多西環(huán)素在斑點(diǎn)叉尾鮰中安全使用及快速檢測(cè)技術(shù)研究

多西環(huán)素在斑點(diǎn)叉尾鮰中安全使用及快速檢測(cè)技術(shù)研究本論文從多西環(huán)素(DOTC)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的安全性、比較藥動(dòng)學(xué)、新劑型、藥動(dòng)-藥效結(jié)合模型及快速檢測(cè)技術(shù)等幾個(gè)方面開展研究,其目的是解決DOTC在斑點(diǎn)叉尾鮰中安全合理使用與殘留控制的問題。1.研究了不同濃度(87.5、175、350mg/kg)多西環(huán)素口灌斑點(diǎn)叉尾鮰后對(duì)血清生化指標(biāo)的影響和對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰紅細(xì)胞的損傷情況。結(jié)果顯示：不同劑量實(shí)驗(yàn)組甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CHO)、堿性磷酸酶(ALP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)含量在整個(gè)試驗(yàn)階段變化不大,與對(duì)照組相比,均無顯著性差異(P>0.05)。染毒的第4d,三個(gè)濃度用藥組的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量與對(duì)照組相比,存在顯著差異(P<0.05),斑點(diǎn)叉尾鮰外周血紅細(xì)胞微核率、核異常率有升高,但差異不顯著(P>0.05),揭示了一定濃度的DOTC對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的肝細(xì)胞可能造成損傷,在本實(shí)驗(yàn)濃度下DOTC對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰無明顯的細(xì)胞毒性效應(yīng)。2.多西環(huán)素在斑點(diǎn)叉尾鮰中藥代藥殘研究。(1)研究了不同水溫(18±1℃和28±1℃)下,以20mg/kg魚體重單次口灌DOTC后斑點(diǎn)叉尾鮰體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué),并在同等條件下與鯽的代謝規(guī)律進(jìn)行比較。結(jié)果表明：DOTC在斑點(diǎn)叉尾鮰和鯽體內(nèi)的藥時(shí)數(shù)據(jù)均符合二室開放式模型,藥-時(shí)曲線呈明顯雙峰現(xiàn)象。在水溫18℃條件下,DOTC在魚體血漿和組織中的分布較慢,消除也慢；在水溫28℃條件下,DOTC在魚體血漿和組織中的分布較快,而消除也相對(duì)低溫快。高溫條件下組織中的濃度均比低溫條件下的濃度高,且第二次達(dá)峰濃度Cmax(2)均大于第一次的濃度Cmax(1)。在血液中,鯽對(duì)DOTC的吸收速率和消除速率均較斑點(diǎn)叉尾鮰慢,吸收半衰期(T1/2Ka)、達(dá)峰時(shí)間(Tp)均較斑點(diǎn)叉尾鮰快得多而消除半衰期(T1/2β)較斑點(diǎn)叉尾鮰慢,血藥濃度-時(shí)間下面積(AUC)僅為斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)的1/3。(2)研究了不同水溫(18±1℃和28±1℃)下,DOTC在斑點(diǎn)叉尾鮰體內(nèi)的殘留消除規(guī)律。結(jié)果表明：DOTC殘留的消除速度隨水溫降低而減慢,與其他組織相比,DOTC在肝臟中的消除最慢。若按DOTC在可食組織肌肉+皮中最高殘留限量300μg/kg計(jì)算休藥期,建議休藥期分別為22d和19d。3.多西環(huán)素殼聚糖納米粒凍干粉的制備及其評(píng)價(jià)(1)采用離子交聯(lián)法和冷凍干燥法制備了DOTC殼聚糖納米粒凍干粉,以正交試驗(yàn)優(yōu)化處方與工藝,并與DOTC原料藥進(jìn)行穩(wěn)定性和體外釋藥特性對(duì)比研究。結(jié)果,DOTC殼聚糖納米粒凍干粉制備工藝切實(shí)可行,穩(wěn)定性良好,并具有顯著的緩釋特性。按殼聚糖濃度為2.5mg/mL、三聚磷酸鈉濃度為1.2mg/ml、DOTC用量為8.0mg、pH值為5.5的處方制備的DOTC殼聚糖納米粒凍干粉復(fù)溶性良好,電鏡下觀測(cè)發(fā)現(xiàn)納米粒平均粒徑為(126.3±17.8)nm,平均包封率為(56.52±2.1)%,平均載藥量為(16.83±0.27)%。與原料藥相比,10dDOTC殼聚糖納米粒凍干粉的(4500±500)Lx強(qiáng)光降解率減少22.97%,40、60℃熱降解率分別減少18.72%和31.41%,75%、92.5%高濕降解率分別減少20.45%和26.90%。DOTC殼聚糖納米粒凍干粉在人工胃液中釋藥較快,其次是人工腸液和pH7.4磷酸鹽緩沖液,且人工胃液在pH2-4范圍內(nèi),隨著pH值增大,凍干粉釋放度減小。(2)在(25±1)℃,對(duì)DOTC殼聚糖納米粒凍干粉(DC-CS-NPs)與DOTC原料藥進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)與組織分布規(guī)律進(jìn)行比較研究。結(jié)果,DC-CS-NPs在血漿、肝臟、腎臟、肌肉中的雙峰現(xiàn)象變?yōu)閱畏瀣F(xiàn)象。與DOTC原料藥相比,DOTC殼聚糖納米粒凍干粉在肝臟、腎臟、肌肉的峰濃度減小,達(dá)峰時(shí)間延長(zhǎng)；在血漿中的峰值時(shí)間明顯延長(zhǎng),峰濃度減小,消除半衰期延長(zhǎng),藥-時(shí)曲線下面積變大,相對(duì)生物利用度為DOTC原料藥的116%。4.多西環(huán)素對(duì)嗜水氣單胞菌藥動(dòng)-藥效同步模型的研究(1)建立了DOTC對(duì)A.h的體外PK-PD模型。測(cè)定了模型中藥物動(dòng)力學(xué)和DOTC抑制A.h的藥效學(xué)參數(shù),并研究了它們之間的關(guān)系。結(jié)果,在消除半衰期為38.61h的模型內(nèi),2MIC的DOTC對(duì)A.h僅能抑制3h,模型運(yùn)行3h后細(xì)菌出現(xiàn)再生長(zhǎng)。4、8和16MIC的DOTC對(duì)A.h能夠起到持續(xù)的抑制作用。結(jié)果表明,DOTC對(duì)A.h的藥效與藥物濃度關(guān)系密切。當(dāng)Cmax/MIC>3.96時(shí),DOTC能夠?qū).h起到持續(xù)的抑制作用。(2)建立了DOTC對(duì)A.h的半體內(nèi)PK-PD模型。采用體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和體外藥效學(xué)相結(jié)合的方法,研究了斑點(diǎn)叉尾鮰血清中DOTC抗A.h的活性,數(shù)據(jù)使用3p97和kinetica4.4軟件分析。結(jié)果,斑點(diǎn)叉尾蛔按20mg/kg體重的劑量口灌DOTC后,藥物吸收迅速、達(dá)峰快、消除緩慢,血漿藥物達(dá)峰時(shí)間(Tmax)為2.57h,峰濃度(Cmax)為1.72μg/mL,消除半衰期(T(1/2)β)為38.63h。在半效應(yīng)室內(nèi),半效濃度參數(shù)(EC50)為16.95h。PK-PD同步模型參數(shù)Cmax/MIC血清為0.86,AUC0→24h/MIC血清為20.57h。通過抑制效應(yīng)的SigmoidEmax模型方程可得到臨床起到抑菌效果的最佳給藥劑量范圍為10.68-41.42mg/kg體重。5.采用改進(jìn)的碳二亞胺兩步法將多西環(huán)素半抗原與載體蛋白BSA連接制備人工免疫抗原,并用同樣方法將DOTC與載體蛋白OVA連接制備人工包被抗原。經(jīng)紫外掃描分析和動(dòng)物免疫試驗(yàn)證實(shí)DOTC人工抗原合成成功,經(jīng)動(dòng)物免疫試驗(yàn)所得抗血清效價(jià)為2.