蟲草益腎顆粒對人腎小球系膜細胞megsin及p38MAPK信號通路影響的研究

蟲草益腎顆粒對人腎小球系膜細胞megsin及p38MAPK信號通路影響的研究目的：基于三焦氣化理論益腎泄?jié)岱〝M蟲草益腎方制成蟲草益腎顆粒并觀察其對高糖培養(yǎng)下人腎小球系膜細胞(humanglomerularmesangialcell,HMC)絲氨酸蛋白酶抑制劑serpinB7(megsin)及絲裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinasessignalpathway,p38MAPK)信號通路的影響,探討蟲草益腎顆粒對人腎小球系膜細胞保護作用的機制。方法：將50只雄性wistar大鼠隨機分為正常組、蟲草益腎顆粒高、中、低劑量組及福辛普利組5組,每組10只,每組大鼠灌胃給藥：蟲草益腎顆粒高、中、低劑量組中藥溶液0.972g/(kg·d).0.486g/(kg·d).0.243g/(kg·d)(含顆粒量),福辛普利0.9mg/(kg·d)水溶液,正常組等體積生理鹽水,連續(xù)給藥7天后根據(jù)血清藥理學方法制備動物含藥血清。將常規(guī)培養(yǎng)的HMC分為6組并給與相應處理：正常組(10%正常大鼠血清+RPMI-1640培養(yǎng)液)、高糖組(10%正常大鼠血清+30mmol/LD-葡萄糖+RPMI-1640培養(yǎng)液)、蟲草益腎顆粒高劑量組(10%蟲草益腎顆粒高劑量組大鼠血清+30mmol/LD-葡萄糖+RPMI-1640培養(yǎng)液)、蟲草益腎顆粒中劑量組(10%蟲草益腎顆粒中劑量組大鼠血清+30mmol/LD-葡萄糖+RPMI-1640培養(yǎng)液)、蟲草益腎顆粒低劑量組(10%蟲草益腎顆粒低劑量組大鼠血清+30mmol/LD-葡萄糖+RPMI-1640培養(yǎng)液)、福辛普利組(10%福辛普利組大鼠血清+30mmol/LD-葡萄糖+RPMI-1640培養(yǎng)液),MTT法檢測24h、48h及72h細胞增殖情況,根據(jù)細胞增殖的差異性選取48h、72h兩個時間點進行后續(xù)實驗。于相應因素干預作用后的48h、72h,采用免疫細胞化學法檢測各組細胞中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK(磷酸化絲裂原活化蛋白激酶)蛋白表達與分布,real-timePCR法檢測serpinB7mRNA.p38MAPKmRNA基因轉錄,采用westernblot法檢測megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達。結果：(1)MTT結果顯示：與正常培養(yǎng)環(huán)境相比,高糖(30mmol/LD-葡萄糖)環(huán)境可刺激HMC增殖(P<0.05,P<0.01)；24h、48h、72h時,與高糖組相比,蟲草益腎顆粒組及福辛普利組大鼠含藥血清對HMC增殖均有抑制作用(P<0.05,P<0.01)；蟲草益腎顆粒高劑量組抑制效果優(yōu)于福辛普利組(P<0.05)；(2)免疫細胞化學結果顯示：megsin與p38MAPK蛋白主要在HMC胞漿中表達,p-p38MAPK蛋白在HMC胞核與胞漿中均有表達48h、72h時,與正常組相比,高糖組HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達均增加(P<0.01),與高糖組相比,蟲草益腎顆粒組與福辛普利組HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達均降低(P<0.05,P<0.01),且以蟲草益腎顆粒高劑量組降低效果明顯；(3)Real-timePCR結果顯示：在正常環(huán)境培養(yǎng)下,HMC中即有serpinB7mRNA、p38MAPKmRNA基因的轉錄48h、72h時,與正常組較比,高糖組HMC中serpinB7mRNA、p38MAPKmRNA基因的轉錄明顯增加(P<0.01),與高糖組相比,蟲草益腎顆粒組及福辛普利組HMC中serpinB7mRNA、p38MAPKmRNA基因的轉錄降低(P<0.05,P<0.01),且以蟲草益腎顆粒高劑量組降低效果明顯；72h時,蟲草益腎顆粒高、中劑量組下調HMC中serpinB7mRNA、p38MAPKmRNA基因的轉錄作用優(yōu)于福辛普利組(P<0.05)；(4)Westernblot結果顯示：在正常環(huán)境培養(yǎng)下,HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白均有表達48h、72h時,與正常組相比,高糖組HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表達明顯升高(P<0.01)；與高糖組相比,蟲草益腎顆粒組及福辛普利組HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達均降低(P<0.05,P<0.01),且以蟲草益腎顆粒高劑量組降低效果最明顯(P<0.01)；觀察含藥血清對降低HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達作用方面,48h時,蟲草益腎顆粒高劑量組優(yōu)于福辛普利組(P<0.05),72h時,蟲草益腎顆粒高、中劑量組優(yōu)于福辛普利組(P<0.05)。結論：(1)蟲草益腎顆粒對高糖培養(yǎng)下HMC增殖具有抑制作用,且蟲草益腎顆粒抑制效果優(yōu)于福辛普利。(2)蟲草益腎顆粒可抑制高糖培養(yǎng)下HMC增殖,其作用與下調HMC中serpinB7mRNA、p38MAPKmRNA基因的轉錄有關。(3)蟲草益腎顆?？梢种聘咛桥囵B(yǎng)下HMC增殖,其作用與降低megsin、p38MAPK蛋白的表達、抑制p38MAPK磷酸化,從而抑制p38MAPK信號向細胞核內轉導的通路有關。(4)