出芽短梗霉發(fā)酵麥麩制備阿魏酰低聚糖及其生物活性研究

出芽短梗霉發(fā)酵麥麩制備阿魏酰低聚糖及其生物活性研究阿魏酰低聚糖(FOs)是一類廣泛存在于禾本科植物中的不同糖鏈位置上的羥基與阿魏酸(FA)羧基酯化形成的具有顯著抗氧化活性的功能性低聚糖。面粉加工過程中產(chǎn)生的麥麩是制備FOs重要來源。FOs具有阿魏酰基與親水性的低聚糖基團,兼具水溶性和耐熱性,在保健食品中具有廣闊的應用前景,但其高效制備技術(shù)有待深入研究。本研究篩選能發(fā)酵麥麩產(chǎn)FOs的菌株,研究培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件對發(fā)酵菌株生成FOs和半纖維素酶系的影響,并比較研究一段式與二段式聯(lián)合調(diào)控溫度和pH的發(fā)酵制備FOs工藝,鑒定兩種發(fā)酵工藝制備FOs的組成及結(jié)構(gòu)差異,及其體內(nèi)外抗氧化、抗腫瘤活性。主要研究結(jié)果如下：1.通過初篩和復篩從面粉廠周邊的土壤中選育出能產(chǎn)FOs的菌株2012,根據(jù)其形態(tài)特征、ITS序列及系統(tǒng)發(fā)育分析,鑒定為不產(chǎn)黑色素為特征的出芽短梗霉(Aureobacidiumpullulans).在pH5.5、60g/L的麥麩液中,出芽短梗霉菌株2012的FOs產(chǎn)量達到545nmol/L)木聚糖酶(Xyln)、阿魏酸酯酶(FAE)活性分別為64.12、0.14IU/mL,發(fā)酵后麥麩結(jié)構(gòu)出現(xiàn)斷裂、舒散變化,形成空腔,其內(nèi)壁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的破散現(xiàn)象。2.選育出的出芽短梗霉在麥麩培養(yǎng)基中生長時能夠合成分解麥麩半纖維素的酶系,其中Xyln主要分布在細胞外,可由麥麩、木糖、木聚糖誘導產(chǎn)生,被葡萄糖和蔗糖所抑制。木糖糖苷酶主要分布在胞內(nèi),由麥麩、木糖、木聚糖誘導,蔗糖、葡萄糖和乳糖則抑制之。阿拉伯糖苷酶在含麥麩和木聚糖的發(fā)酵基質(zhì)中胞內(nèi)、胞外均有分布,在其它碳源中不產(chǎn)生；FAE主要為胞外酶,在葡萄糖和蔗糖發(fā)酵基質(zhì)中不產(chǎn)生。FOs產(chǎn)量與Xyln活性有極顯著正相關(guān)(r=0.992),木糖糖苷酶和FAE的產(chǎn)生有顯著正相關(guān)(r=0.966),FOs產(chǎn)量與木糖糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、FAE的活性呈正相關(guān)。在以麥麩作為唯一碳源時,隨其濃度的升高,Xyln活性和FOs產(chǎn)量隨之增加,質(zhì)量濃度為50～60g/L的麥麩液有利于Xyln的合成和FOs的制備。適量的木聚糖和蛋白胨均能促進Xyln的合成及FOs的生成,添加金屬離子和表面活性劑未能提高該菌發(fā)酵系統(tǒng)中FOs產(chǎn)量。發(fā)酵制備FOs的最佳培養(yǎng)基組成為：60g/L麥麩液中添加10g/L木聚糖和1g/L蛋白胨,利用該培養(yǎng)基進行液態(tài)發(fā)酵,FOs產(chǎn)量達774nmol/L.3.研究了發(fā)酵條件對出芽短梗霉發(fā)酵麥麩制備FOs的影響,經(jīng)P-B試驗篩選出對FOs產(chǎn)量影響呈顯著正效應的因素有：起始pH、接種量、發(fā)酵溫度；經(jīng)中心組合試驗優(yōu)化后,在控制起始pH6.0、接種量4.50%、發(fā)酵溫度29℃的最優(yōu)試驗條件下,出芽短梗霉發(fā)酵液中FOs含量達到904nmol/L,與預測值相符?？刂破鹗及l(fā)酵pH4.0、起始溫度33℃,在發(fā)酵至36h時,將pH和溫度分別調(diào)控為6.0和29℃,進行二段式聯(lián)合調(diào)控溫度和pH發(fā)酵制備FOs,在發(fā)酵至84h時達到FOs的峰值1123nmol/L,較一段式工藝提高24%,且提前12h出峰。4.將采用一段式發(fā)酵工藝(FOs1)及二段式聯(lián)合發(fā)酵工藝(FOs2)所制備的發(fā)酵液經(jīng)醇沉、AmberliteXAD-2分離后,進行液相色譜及氣相色譜分析,結(jié)果表明,兩種工藝制備的FOs均由木糖、阿拉伯糖和FA三種成分組成。紫外光譜分析表明,兩種FOs在MOPS緩沖液中在325nm處均具有最大值。紅外光譜分析表明,兩種FOs中均存在羥基、酯鍵及阿拉伯糖基等特征基團。電噴霧電離質(zhì)譜分析表明,FOs1聚合度分別為5、4、3、2,由分子量分別為986、854、722、590的阿魏酰阿拉伯糖基木五糖(FAX5)、FAX4、FAX3、FAX2四組分構(gòu)成。FOs2聚合度分別為6、5、4,由分子量分別為1118、986、854的FAX6、FAX5、FAX4構(gòu)成,組分純度和聚合度均高于FOs1。5.研究了FOs1和FOs2對體外大鼠紅細胞溶血、大鼠肝組織勻漿及肝線粒體MDA生成的影響。FOs1和FOs2在0.5～10mg.mL-1范圍內(nèi)能抑制大鼠紅細胞溶血,抑制大鼠肝組織勻漿及肝線粒體MDA的生成,具有量效關(guān)系,說明FOs1和FOs2具體外抗氧化效果,且FOs2效果好于FOs1。FOs1和FOs2隨著劑量的增加可提高S180荷瘤小鼠血清中SOD和GSH-Px活性,降低MDA含量,從而提高其體內(nèi)抗氧化活性。當劑量達到250mg·kg-1·d-1時,FOs2較5-FU和FOs1更有利于促進荷瘤小鼠體內(nèi)抗氧化能力的提高。采用MTT法檢驗了FOs1和FOs2對人肝癌細胞HepG2.人胃癌細胞BGC-823、人肺腺癌細胞A549的抗腫瘤活性。結(jié)果表明,兩種物質(zhì)對三株腫瘤細胞均有體外抑制作用,且FOs2的抑制效果優(yōu)于FOs1,并對人肝癌細胞HepG2的抑制效果最好,當FOs2濃度為1mg/mL時,對其抑制率可達50.8%。對給藥后的腫瘤細胞進行可見光形態(tài)學觀察后發(fā)現(xiàn),細胞株給藥后腫瘤細胞變圓、變小、浮起,細胞間變松散,增殖速率減緩。通過研究FOs1和FOs2對S180荷瘤小鼠抑瘤率、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、免疫功能因子IFN-γ和IL-3的影響及對腫瘤進行切片HE染色觀察,探明FOs1和FOs2體內(nèi)抗腫瘤活性。FOs1和FOs2對S180荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤有很好的抑制效果,250mg·kg-1.d-1劑量組的FOs2抑制率達到44.55%,HE