產(chǎn)酶溶桿菌轉(zhuǎn)錄因子LeClp調(diào)控幾丁質(zhì)酶和次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的機(jī)制研究

產(chǎn)酶溶桿菌轉(zhuǎn)錄因子LeClp調(diào)控幾丁質(zhì)酶和次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的機(jī)制研究產(chǎn)酶溶桿菌OH11(LysobacterenzymogenesOH11)是本實(shí)驗(yàn)室于2003年從辣椒根際土壤中分離到的一株具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重要生防細(xì)菌,其能產(chǎn)生胞外幾丁質(zhì)酶、抗真菌代謝產(chǎn)物HSAF、抗細(xì)菌活性物質(zhì)WAP-8294A2等胞外酶和次級(jí)抗菌代謝產(chǎn)物,對(duì)多種植物病原菌均有較強(qiáng)的抑制能力,具有十分廣闊的生防應(yīng)用前景。LeClp(cAMP-receptorlikeprotein)是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中發(fā)現(xiàn),LeClp在產(chǎn)酶溶桿菌OH11中可調(diào)控3種生防因子(HSAF、WAP-8294A2和胞外幾丁質(zhì)酶)的生物合成,但相應(yīng)的機(jī)制未知。本文以產(chǎn)酶溶桿菌OH11為對(duì)象,深入研究了LeClp對(duì)上述3種生防因子發(fā)揮調(diào)控作用的機(jī)制,取得了如下結(jié)果:構(gòu)建LeClp蛋白的原核表達(dá)載體,并對(duì)LeClp蛋白的誘導(dǎo)及純化條件進(jìn)行優(yōu)化,得到了大量的純化的LeClp蛋白,這為后續(xù)進(jìn)行其他相關(guān)實(shí)驗(yàn),如凝膠阻滯電泳(EMSA)打下了良好的基礎(chǔ)。同時(shí)利用微量熱泳動(dòng)技術(shù)(MST)檢測(cè)了LeClp蛋白與細(xì)菌第二信使c-di-GMP之間的結(jié)合作用。結(jié)果顯示:產(chǎn)酶溶桿菌OH11中的LeClp可以結(jié)合c-di-GMP,表明LeClp是一個(gè)c-di-GMP的受體,揭示其調(diào)控作用的發(fā)揮與胞內(nèi)的c-di-GMP含量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn),Leclp突變株無(wú)法產(chǎn)生胞外幾丁質(zhì)酶,但具體的分子和生化機(jī)制未知。chiA是產(chǎn)酶溶桿菌OH11中已鑒定的一個(gè)負(fù)責(zé)胞外幾丁質(zhì)酶生物合成的關(guān)鍵基因。本研究通過(guò)生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)在chiA的啟動(dòng)子區(qū)可能具有LeClp蛋白的結(jié)合位點(diǎn),并通過(guò)細(xì)菌單雜交、EMSA和ChIP-PCR(染色質(zhì)免疫沉淀-PCR)這三種手段進(jìn)一步確認(rèn)了LeClp在體內(nèi)和體外對(duì)chiA的啟動(dòng)子區(qū)的直接結(jié)合。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在所測(cè)實(shí)驗(yàn)條件下,c-di-GMP并未影響LeClp與啟動(dòng)子的結(jié)合過(guò)程,暗示LeClp對(duì)chiA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能并不依賴胞內(nèi)的c-di-GMP。重要的是,我們發(fā)現(xiàn)LeClp對(duì)chiA的這種直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式可能也是其他產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的溶桿菌種采用的一種保守調(diào)控機(jī)制。pks/nrps是HSAF生物合成的一個(gè)關(guān)鍵基因,其敲除突變體完全不產(chǎn)HSAF。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)pks/nrps啟動(dòng)子區(qū)含有LeClp潛在的結(jié)合位點(diǎn),揭示LeClp可能是通過(guò)直接結(jié)合啟動(dòng)子的方式來(lái)調(diào)控HSAF的生物合成的。細(xì)菌單雜交和EMSA等實(shí)驗(yàn)表明:LeClp蛋白可直接結(jié)合在pks/nrps的啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控HSAF的生物合成。在所測(cè)條件下,c-di-GMP并未影響LeClp與啟動(dòng)子的結(jié)合,揭示c-di-GMP可能未參與LeClp對(duì)HSAF生物合成的調(diào)控過(guò)程。另外,我們通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并結(jié)合生化試驗(yàn),表明LeClp作為下游因子,介導(dǎo)了LesR(孤立LuxR蛋白)調(diào)控HSAF的過(guò)程。WAP-8294A2是產(chǎn)酶溶桿菌OH11合成的一種抗革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的次生代謝產(chǎn)物,其生物合成也受到了LeClp的調(diào)控。本研究通過(guò)RT-PCR鑒定了WAP-8294A2合成基因簇的啟動(dòng)子區(qū),進(jìn)而采用細(xì)菌單雜交發(fā)現(xiàn)LeClp不是通過(guò)直接結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)的方式來(lái)調(diào)控WAP-8294A2的生物合成的,這與LeClp調(diào)控HSAF的生物合成的方式完全不同。隨后,我們開(kāi)展了LeClp體內(nèi)結(jié)合基因啟動(dòng)子區(qū)的ChIP-Seq實(shí)驗(yàn),鑒定了LeClp體內(nèi)直接調(diào)控的靶標(biāo)基因及其參與的生物學(xué)功能。在此基礎(chǔ)上,我們通過(guò)細(xì)菌單雜交和EMSA,鑒定了受L