大腸桿菌和布魯氏菌脂多糖刺激條件下巨噬細(xì)胞差異表達(dá)miRNAs的鑒定及其作用機(jī)制

大腸桿菌和布魯氏菌脂多糖刺激條件下巨噬細(xì)胞差異表達(dá)miRNAs的鑒定及其作用機(jī)制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是大腸桿菌、布魯氏菌等革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的一種成分,可誘導(dǎo)單核／巨噬細(xì)胞活化、成熟,通過(guò)刺激單核／巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并釋放大量的一氧化氮(nitricoxide,NO)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及腫瘤壞死因子-a(tumornecrosisfactor-a,TNF-a)等炎癥因子,引起宿主產(chǎn)生炎癥反應(yīng),嚴(yán)重時(shí)可誘發(fā)膿毒癥、膿毒性休克,導(dǎo)致多器官功能障礙,甚至發(fā)生膿毒性死亡。MicroRNAs(miRNAs)是一類大小約為18-24個(gè)堿基的非編碼單鏈小分子RNA,主要通過(guò)與靶基因mRNA分子的3’端非編碼區(qū)域(3’untranslatedregions,3’UTR)互補(bǔ)匹配,導(dǎo)致靶基因mRNA分子的被切割或翻譯受到抑制,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控。目前,對(duì)LPS的研究主要集中在信號(hào)通路、細(xì)胞因子分泌,以及其所引起的器官損傷和細(xì)胞凋亡等方面。我們通過(guò)分析大腸桿菌LPS(EscherichiacoliLPS,E.coliLPS)和布魯氏菌LPS(BrucellamelitensisLPS,B.melitensisLPS)刺激條件下,巨噬細(xì)胞差異表達(dá)的miRNAs及其對(duì)于靶基因的調(diào)控,以在表觀遺傳學(xué)層面揭示E.coliLPS和B.melitensisLPS誘導(dǎo)宿主發(fā)生炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制。方法1)利用TaqManMicroRNAArray檢測(cè)E.coliLPS刺激后RAW264.7細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜變化,并用qRT-PCR對(duì)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證；2)應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)差異表達(dá)miRNAs的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),并利用GeneOntology對(duì)所預(yù)測(cè)的基因進(jìn)行功能分類；3)E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激RAW264.7細(xì)胞后,應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)miR-27a-5p時(shí)間變化曲線,并結(jié)合Westernblot檢測(cè)E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激RAW264.7后差異表達(dá)的]miR-27a-5p的預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)；4)將甘油醛一3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)和經(jīng)過(guò)qRT-PCR和Westernblot驗(yàn)證過(guò)的miR-27a-5p的靶基因單核細(xì)胞趨化蛋白誘導(dǎo)蛋白1(monocytechemotacticproteininducedprotein1,MCPIP1)的3’UTR克隆到pmirGLO螢光素酶報(bào)告基因載體中,并與miR-27a-5p模擬物共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中,通過(guò)雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)螢光素酶表達(dá),分析miR-27a-5p與MCPIP13’UTR的相互作用情況；5)在RAW264.7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MCPIP1,應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞在E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激條件下IL-6、IL-10和IL一1β的分泌。結(jié)果1)通過(guò)TaqManMicroRNAArray分析,與空白對(duì)照組比較,在E.coliLPS刺激后,RAW264.7細(xì)胞中有7條miRNAs差異表達(dá),其中miR-196b,miR-196c,miR-146a,miR-155和miR-222表達(dá)上調(diào),而miR-27a-5p和niR-532-5p表達(dá)下調(diào)。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果表明,E.coliLPS刺激RAW264.7細(xì)胞后,miR-146a和miR-155表達(dá)上調(diào),miR-27a-5p和miR-532-5p表達(dá)下調(diào)。B.melitensisLPS刺激RAW264.7細(xì)胞后,可引起miR-146a,miR-155和miR-532-5p表達(dá)上調(diào),以及miR-27a-5p表達(dá)下調(diào)；2)通過(guò)TargetScan,PicTar,miRDB和microRNA.org四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)miRNAs靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),獲得1000多個(gè)靶基因,由于LPS的主要作用是引起巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng),所以使用GeneOntology對(duì)靶基因進(jìn)行分類,并對(duì)炎癥相關(guān)基因進(jìn)行富集,得到涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和先天免疫反應(yīng)的靶基因39個(gè)；3)在E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激RAW264.7細(xì)胞后的不同時(shí)間點(diǎn),應(yīng)用qRT-PCR對(duì)miR-27a-5p的表達(dá)水平進(jìn)行分析,結(jié)果表明,E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激可引起miR-27a-5p表達(dá)降低,應(yīng)用qRT-PCR和Westernblot對(duì)E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激RAW264.7細(xì)胞后靶基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,在miR-27a-5p的預(yù)測(cè)靶基因中,MCPIP1mRNA表達(dá)水平在E.coliLPS刺激6h后顯著升高,MCPIP1蛋白表達(dá)在E.coliLPS刺激3h后逐漸增加,在6-12h間高表達(dá),到24h時(shí),蛋白表達(dá)基本恢復(fù)到未刺激水平。而B(niǎo).melitensisLPS對(duì)MCPIP1表達(dá)無(wú)顯著影響；4)螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明,與共轉(zhuǎn)染Pre-miR-NC無(wú)效序列相比,pmir-luciferase-MCPIPl-3’UTR與Pre-miR-27a-5p共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,可以顯著抑制螢光素酶活性,提示miR-27a-5p可以與MCPIP13’UTR特異性結(jié)合抑制其表達(dá)；5)在RAW264.7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MCPIP1后,應(yīng)用ELISA方法對(duì)細(xì)胞因子分泌進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,在E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激條件下,MCPIP1過(guò)表達(dá)可顯著降低RAW264.7細(xì)胞IL-6、IL一10和IL-lp的分泌。結(jié)論本研究分析了E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激條件下RAW264.7細(xì)胞miRNAs的表達(dá),篩選到4條差異表達(dá)的miRNAs,其中,miR-27a-5p在E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激條件表達(dá)均下調(diào),miR-155和miR-146a表達(dá)均上調(diào)。miR-532-5p在E.coliLPS刺激條件表達(dá)下調(diào),而在B.melitensisLPS刺激條件下表達(dá)上調(diào)；通過(guò)生物信息學(xué)軟件(TargetScan、PicTar、miRDB和microRNA.org)預(yù)測(cè),獲得差異表達(dá)的miRNAs的1000多個(gè)候選靶基因。并對(duì)涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和先天免疫反應(yīng)的等炎癥相關(guān)靶基因進(jìn)行富集,得到39個(gè)炎癥相關(guān)靶基因。通過(guò)qRT-PCR分析,我們發(fā)現(xiàn),在E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激條件下,RAW264.7細(xì)胞中miR-27a-5p表達(dá)下調(diào),Westernblot驗(yàn)證了其靶基因MCPIP1在E.coliLPS刺激條件下表達(dá)上調(diào)。通過(guò)螢光素酶實(shí)驗(yàn),證實(shí)了miR-27a