發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離方法

14發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離方法從微生物發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)液中提取生化物質(zhì)的第一個(gè)必要步驟就是預(yù)處理和固液分離。14.1發(fā)酵液的預(yù)處理從懸浮液中分離固形物的速度，取決于該液體的物理性質(zhì)、常采用預(yù)處理的辦法改變其物理性質(zhì)而促其分離。細(xì)菌及某些放線菌菌體細(xì)小，發(fā)酵液粘度大，不能直接過濾。由于菌體自溶，核酸、蛋白質(zhì)及其它有機(jī)粘性物質(zhì)的存在會(huì)造成濾液渾濁，濾速極慢。因此，在預(yù)處理中應(yīng)采用絮凝或凝聚的方法，設(shè)法增大懸浮液中固體粒子的大小，提高其沉降速度，或采用稀釋、加熱等方法降低粘度，以利于過濾。發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，其中對(duì)提煉影響最大的是高價(jià)無機(jī)離子（Ca＋＋、Mg十＋、Fe＋＋）和雜蛋白質(zhì)等。

高價(jià)無機(jī)離子的存在，會(huì)影響樹脂對(duì)生化物質(zhì)的交換容量。雜蛋白質(zhì)的存在，不僅在采用離子交換法和大網(wǎng)格樹脂吸附法提煉時(shí)會(huì)降低其吸附能力，而且在采用有機(jī)溶劑或兩水相萃取時(shí)，容易產(chǎn)生乳化，使兩相分離不清，在預(yù)處理時(shí)，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。14.1高價(jià)無機(jī)離子的去除方法為去除鈣離子，宜加入草酸,可用其可溶性鹽，如草酸鈉。反應(yīng)生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固，提高濾液（也稱為原液）質(zhì)量。但草酸價(jià)格較貴，加入硫酸鉛，在60℃下反應(yīng)生成草酸鉛。后者在90－95℃下用硫酸分解，經(jīng)過濾、冷卻、結(jié)晶后可以回收草酸。草酸鎂的溶解度較大。故加入草酸不能除盡鎂離子。要除去鎂離子，可以加入三聚磷酸鈉，它和鎂離子形成可溶性絡(luò)合物：Na5P3O10＋Mg＋＋＝MgNaNa3P3O10＋2Na十用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。要除去鐵離子，可加入黃血鹽，使形成普魯士藍(lán)沉淀。14.l.2雜蛋白質(zhì)的去除方法蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中。膠體粒子的穩(wěn)定性和其所帶電荷有關(guān)。蛋白質(zhì)在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小，稱為等電點(diǎn)。因?yàn)轸然碾婋x度比氨基大，故蛋白質(zhì)的酸性性質(zhì)通常強(qiáng)于堿性，因而很多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在酸性范圍內(nèi)（pH4.0－5.5）。但單靠調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)的辦法不能將大部分蛋白質(zhì)除去。在酸性溶液中，蛋白質(zhì)能與一些陰離子如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，能與一些陽離子，如Ag十，Cu＋＋，Zn十十，F(xiàn)e＋＋和Pb＋＋等形成沉淀。變性蛋白質(zhì)溶解度較小。最常用的使蛋白質(zhì)變性的方法是加熱。加熱還能使液體粘度降低，加快過濾速度。該法只適用于對(duì)熱較穩(wěn)定的生化物質(zhì)。使蛋白質(zhì)變性的其它辦法還有：大幅度改變pH，加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑等。在抗生素生產(chǎn)中，常將發(fā)酵液pH調(diào)至偏酸性范圍（pH2－3）或較堿性范圍（pH8一9）使蛋白質(zhì)凝固，一般以酸性下除去的蛋白質(zhì)較多。加有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)變性的方法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場(chǎng)合。此外，還可以利用吸附作用除去蛋白質(zhì)。例如，四環(huán)類抗生素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀K2Zn3〔Fe（CN）5〕2的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)。在枯草桿菌發(fā)酵液中，常加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，這兩者本身生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，從而加快了過濾速度。14.l.3凝聚和絮凝技術(shù)凝聚和絮凝技術(shù)能有效地改變細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使聚集起來，增大體積，以便于過濾，常用于菌體細(xì)小而且粘度大的發(fā)酵液的預(yù)處理中。凝聚和絮凝的概念凝聚是在中性鹽作用下，由于雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。

絮凝是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過程，是一種以物理的集合為主的過程。發(fā)酵液中的細(xì)胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子的表面，一般都帶有電荷，主要是吸附溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離。

通常發(fā)酵液中細(xì)胞或菌體帶有負(fù)電荷，由于靜電引力的作用使溶液中帶相反電荷的粒子（即正離子）被吸附在其周圍，在界面上形成了雙電層。但是這些正離子還受到使它們均勻分布開去的熱運(yùn)動(dòng)的影響，具有離開膠粒表面的趨勢(shì)，在這兩種相反作用的影響下，雙電層就分裂成兩部分，在相距膠核表面約一個(gè)離子半徑的Stern平面以內(nèi)，正離子被緊密束縛在膠核表面，稱為吸附層或緊密層；在stern平面以外，剩余的正離子則在溶液中擴(kuò)散開去，距離越遠(yuǎn)，濃度越小，最后達(dá)到主體溶液的平均濃度，稱為擴(kuò)散層。這樣就形成了擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)模型，如圖14－1所示。當(dāng)膠粒在溶液中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，總有一薄層液體，隨著它一起滑移，這一薄層，厚度比吸附層稍大，滑移面（剪切面）在圖14－l中用波紋線表示。

這三種電位中只有ζ電位能實(shí)際測(cè)得，所以可以認(rèn)為它是控制膠粒間電排斥作用的電位，用來表征雙電層的特征，并作為研究凝聚機(jī)理的重要參數(shù)。膠粒能保持分散狀態(tài)的原因主要是帶有相同電荷和擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)，一旦由于布朗（Brown）運(yùn)動(dòng)使粒子間距離縮小到它們的擴(kuò)散層部分重疊時(shí)，即產(chǎn)生使兩個(gè)粒子分開：從而阻止了粒子的聚集。ζ電位越大，電排斥作用就越強(qiáng)，膠粒的分散程度也越大，此外，由于膠粒表面的水化作用，形成了包圍于粒子周圍的水化層，也能阻礙膠粒間的直接聚集。但是，水化膜主要是伴隨膠粒帶電而引起的，一旦ζ電位降低或消除，水化層也會(huì)隨之減弱或消失。根據(jù)靜電學(xué)基本定理，可導(dǎo)出ζ電位的基本公式為：ζ＝4πqδ/D其中D—水的介電常數(shù)；q—膠體的電動(dòng)電荷密度，即滑移面上的電荷密度；δ—擴(kuò)散層的有效厚度，即為吸附層和擴(kuò)散層界面處電位φd降低到其值為1/e處的距離，可知，ζ電位與擴(kuò)散層厚度δ和電動(dòng)電荷密度q成正比，而擴(kuò)散層厚度又與溶液中離子強(qiáng)度有關(guān)，當(dāng)雙電層的排斥力不足以抗衡膠粒間的范德華引力時(shí)，由于熱運(yùn)動(dòng)的結(jié)果導(dǎo)致膠粒的互相碰撞而聚集起來。由此可見，在發(fā)酵液中加入具有高價(jià)陽離子的電解質(zhì)，能降低ζ電位和脫除膠粒表面的水化膜，就能導(dǎo)致膠粒間的凝聚作用。常用的凝聚劑電解質(zhì)有：Al2（SO4）3·18H2O（明礬）；AlC13·6H2O；FeC13；ZnSO4；MgCO3等。有機(jī)高分子聚合物絮凝劑，它們具有長鏈線狀的結(jié)構(gòu)，是一種水溶性的聚合物，分子量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，在長的鏈節(jié)上含有相當(dāng)多的活性功能團(tuán)，可以帶有多價(jià)電荷（如陰離子或陽離子），也可以不帶電性（如非離子型）。它們通過靜電引力、范德華分子引力或氫鍵的作用，強(qiáng)烈地吸附在膠粒的表面，一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同顆粒的表面上，產(chǎn)生了架橋聯(lián)接，生成粗大的絮團(tuán)，這就是架凝作用。如果膠粒相互間的排斥電位不太高，只要高分子聚合物的鏈節(jié)足夠長，跨越的距離超過顆粒間的有效排斥距離，也能把多個(gè)膠粒拉在一起，導(dǎo)致架橋絮凝。目前最常見的高分子聚合物絮凝劑是有機(jī)合成的聚丙烯酰胺類衍生物。根據(jù)活性基團(tuán)在水中解離情況不同，可分為非離子型、陰離子型（含有羧基）和陽離子型（含有胺基）三類。聚丙烯酰胺類絮凝劑具有用量少，絮凝體粗大，分離效果好，絮凝速度快以及種類多等優(yōu)點(diǎn)，所以適用范圍廣。它們的主要缺點(diǎn)是存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，要考慮這些物質(zhì)最終能否從產(chǎn)品中去除。近年來還發(fā)展了聚丙烯酸類陰離子絮凝劑，它們無毒，可用于食品和醫(yī)藥工業(yè)中。另外，還有聚苯乙烯類衍生物及無機(jī)高分子聚合物絮凝劑，如聚合鋁鹽和聚合鐵鹽等。除此以外，也可采用天然有機(jī)高分子絮凝劑。如多聚糖類膠粘物，海藻酸鈉，明膠、骨膠、殼多糖和脫乙酰殼多糖等。對(duì)于帶負(fù)電性菌體或蛋白質(zhì)來說，陽離子型高分子絮凝劑同時(shí)具有降低粒子排斥電位和產(chǎn)生吸附架橋的雙重機(jī)理，所以可以單獨(dú)使用。對(duì)于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，則主要通過分子間引力和氫鍵作用產(chǎn)生吸附架橋，它們常與無機(jī)電解質(zhì)凝聚劑搭配使用。首先加入無機(jī)電解質(zhì)，使懸浮粒子間的相互排斥能降低，脫穩(wěn)而凝聚成微粒，然后，再加入絮凝劑。無機(jī)電解質(zhì)的凝聚作用為高分子絮凝劑的架橋創(chuàng)造了良好的條件，從而，提高了絮凝效果。這種包括凝聚和絮凝機(jī)理的過程，常稱為混凝。

絮凝劑濃度增加有助于架橋充分，但是，過多的加量反而會(huì)引起吸附飽和，在每個(gè)膠粒上形成覆蓋層而使膠粒產(chǎn)生再次穩(wěn)定現(xiàn)象見圖（14－2）。適宜的加量通常由實(shí)驗(yàn)得出。雖然高分子絮凝劑分子量提高，鏈增長，可使架橋效果明顯，但是，分子量不能超過一定的限度，因?yàn)殡S分子量提高，高分子絮凝劑的水溶性降低。溶液PH的變化常會(huì)影響離子型絮凝劑中功能團(tuán)的電離度，從而影響分子鏈的伸展形態(tài)。電離度增大，由于鏈節(jié)上相鄰離子基團(tuán)間的電排斥作用，而使分子鏈從卷曲狀態(tài)變?yōu)樯煺範(fàn)顟B(tài)，所以架橋能力提高。14.2發(fā)酵液的過濾微生物發(fā)酵液中含有大量菌體、細(xì)胞或細(xì)胞碎片以及殘余的固體培養(yǎng)基成分。過濾就是將懸浮在發(fā)酵液中的固體顆粒與液體進(jìn)行分離的過程。14.2.4發(fā)酵液的過濾特性和濾餅的重量比阻微生物的發(fā)酵液大多數(shù)屬于非牛頓型液體，濾渣為可壓縮性的。衡量過濾特性的主要指標(biāo)是濾餅的重量比阻rB，它表示單位濾餅厚度的阻力系數(shù)，與濾餅的結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。對(duì)于不可壓縮性濾餅，比阻值為常數(shù)，但對(duì)于可壓縮性濾餅，比阻rB是操作壓力差的函數(shù)，一般可用下式表示：rB＝r（△p）m式中r—不可壓縮濾渣的比阻，對(duì)于一定的料液，其值為常數(shù)；m—壓縮性指數(shù)，一般取0.5－0.8，對(duì)不可壓縮性濾餅，m為0；可見，濾餅的比阻值是隨操作壓力差的提高而增大的。因此，開始過濾時(shí)應(yīng)注意不能很快提高壓差，通?？恳褐淖匀粔翰钸M(jìn)料，并應(yīng)緩慢地，逐步地升高壓力，一般在相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)，壓力差不要超過0.05MPa，最后的壓差也不超過0.3－0.4MPa。

如果操作壓力控制過高，由于比阻值的急劇增加，會(huì)使過濾速度很快下降，以至達(dá)到不能繼續(xù)過濾的程度。恒壓下，可壓縮性濾餅的比阻值應(yīng)為常數(shù)。如過濾介質(zhì)的阻力相對(duì)較小可以忽略不計(jì)，則恒壓下的過濾方程式如下：q2＝2△pτ/μrBXB式中q--到瞬間τ，通過單位過濾面積的濾液量，m；△p—壓力差，Pa；μ—濾液粘度，Pa．s；

rB—濾餅的重量比阻，m／kg；XB—通過單位體積濾液，所形成的濾渣重量（干重），kg／m3；τ—過濾時(shí)間，s。14.2.2影響過濾速度的因素過濾速度和菌種、發(fā)酵條件（培養(yǎng)基的組成，未用完培養(yǎng)基的數(shù)量，消沫油，發(fā)酵周期）等有關(guān)。菌種對(duì)過濾速度影響很大。一般，真菌的菌絲比較粗大，發(fā)酵液容易過濾，常不需特殊處理。其濾渣呈緊密餅狀物，很容易從濾布上刮下來，故可采用鼓式真空過濾機(jī)過濾。放線菌發(fā)酵液菌絲細(xì)而分枝，交織成網(wǎng)絡(luò)狀。還含有很多多糖類物質(zhì)，粘性強(qiáng)，過濾較困難，一般需經(jīng)預(yù)處理，以凝固蛋白質(zhì)等膠體。細(xì)菌發(fā)酵液的菌體更細(xì)小，因此，過濾十分困難，如不用絮凝等方法預(yù)處理發(fā)酵液，往往難以采用常規(guī)過濾的設(shè)備來完成過濾操作。培養(yǎng)基的組成對(duì)過濾速度影響也很大。用黃豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源會(huì)使過濾困難。此外，發(fā)酵后期加消沫油或剩余大量未用完的培養(yǎng)基，都會(huì)使過濾困難。正確選擇發(fā)酵終了時(shí)間對(duì)過濾影響很大。在菌絲自溶前必須放罐，因?yàn)榧?xì)胞自溶后的分解產(chǎn)物一般很難過濾。有時(shí)延長發(fā)酵