丙泊酚對肝細胞肝癌生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用及機制研究

丙泊酚對肝細胞肝癌生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用及機制研究第一部分丙泊酚抑制肝癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的體外研究研究背景：丙泊酚是一種常用于腫瘤切除手術(shù)的靜脈麻醉藥,近年丙泊酚對腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用及對腫瘤免疫的影響逐漸受到關(guān)注。丙泊酚體外可以直接抑制人宮頸癌、纖維肉瘤、骨肉瘤等細胞系的侵襲能力首先被報道,隨后,體內(nèi)和體外實驗均證明丙泊酚能抑制乳腺癌細胞系的生長和轉(zhuǎn)移,關(guān)于食道癌、肺癌等離體細胞研究也證實了丙泊酚的抗癌作用。但是,丙泊酚對肝癌細胞的具體作用目前國內(nèi)外尚無報道。研究目的：本研究的目的是明確丙泊酚對肝癌細胞的生長和侵襲能力的具體作用及初步機制。研究方法：1.不同濃度的丙泊酚與肝癌HepG2細胞、正常肝L-02細胞共培養(yǎng)。2.MTT法測定肝癌HepG2細胞、正常肝L-02細胞的細胞活性。3.酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測Caspase8、Caspase9活性表達。4.Transwell小室進行細胞侵襲試驗。5.明膠酶譜分析基質(zhì)屬蛋白酶-9的活性。6.westernblot測定MMP-9蛋白表達。研究結(jié)果1.丙泊酚抑制肝癌細胞HepG2(A)和正常肝細胞L02(B)的生長。其中,正常細胞表現(xiàn)出更強的丙泊酚抗性。2.丙泊酚誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2產(chǎn)生細胞凋亡,并伴隨Caspase-8和Caspase-9活性的顯著增強。而且,HepG2細胞凋亡率的增加與丙泊酚作用濃度呈正相關(guān)趨勢。3.5ug/ml和10ug/m丙泊酚與HepG2細胞共培養(yǎng)后均能顯著降低HepG2細胞的附著力。4.分別用5、10μg/ml的丙泊酚處理HepG2細胞16小時,MMP-9的活性呈劑量依賴性地降低,在HepG2細胞中的MMP-9的蛋白表達水平明顯降低。結(jié)論：臨床相關(guān)濃度的丙泊酚能夠濃度依賴誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2凋亡,可能與激活凋亡蛋白Caspase-8和Caspase-9有關(guān)。丙泊酚也能抑制HepG2的侵襲能力,明顯抑制HepG2細胞MMP-9的活性。丙泊酚對腫瘤細胞的作用是多方面的,所以詳細的機制還需要進一步的研究。第二部分丙泊酚通過上調(diào)巨噬細胞及微泡中miR-142-3p發(fā)揮抗肝癌作用的研究研究背景：本研究第一部分發(fā)現(xiàn)丙泊酚能夠?qū)﹄x體肝癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用,但是這對指導(dǎo)臨床還遠遠不夠,我們進一步研究其作用機制,研究丙泊酚抑制肝癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的動物實驗,特別是丙泊酚對機體免疫功能的影響。巨噬細胞具有異質(zhì)性和多樣性,在不同微環(huán)境信號刺激下,能分化成為生物學(xué)功能相反的亞群。腫瘤相關(guān)巨噬細胞作為腫瘤免疫微環(huán)境中最豐富的免疫細胞,受到腫瘤細胞的募集與其他基質(zhì)細胞一起共同構(gòu)成腫瘤免疫微環(huán)境。肝癌患者體內(nèi)巨噬細胞集落刺激因子水平升高可預(yù)測肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況。對多種腫瘤的研究表明,miRNA在腫瘤致病過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用,miR-142-3p在抑制肝癌細胞遷移和侵襲中起著重要的作用,而增強miR-142-3p的表達可以抑制腫瘤相關(guān)巨噬細胞的分化,發(fā)揮抗腫瘤作用。微泡中負載包括miRNA在內(nèi)的多中生物活性分子,共同組成“信號復(fù)合體”。巨噬細胞受到誘導(dǎo)后釋放富含信息的微泡,通過釋放到胞外環(huán)境的這些微泡,將信息物質(zhì)傳遞給周圍及遠處的腫瘤細胞發(fā)揮相應(yīng)的作用。已有研究證明丙泊酚可以減少巨噬細胞釋放的活性氧家族,發(fā)揮抗腦膠質(zhì)瘤的作用,本部分研究假設(shè)丙泊酚能夠活化腫瘤相關(guān)巨噬細胞,上調(diào)miR-142-3p表達并刺激腫瘤相關(guān)巨噬細胞分泌富含miR-142-3p的微泡,通過微泡發(fā)揮抑制肝癌細胞生長和侵襲的能力。研究目的：本研究假設(shè)丙泊酚能夠活化腫瘤相關(guān)巨噬細胞,上調(diào)miR-142-3p的表達,并刺激腫瘤相關(guān)巨噬細胞分泌微泡,微泡運送miR-142-3p到肝癌細胞,從而抑制肝癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。實驗方法：1.建立肝癌細胞系Hepa1-6小鼠皮下移植瘤模型；差速離心分離血漿中MVs,根據(jù)處理藥物的不同對荷瘤小鼠分組,共分8組：(1)20mg/kg丙泊酚；(2)100μg/kgclodrolip;(3)20mg/kg丙泊酚+100μg/kgclodrolip;(4)50mg/kg丙泊酚；(5)50mg/kg丙泊酚+100μg/kgclodrolip;(6)20μgMVs;(7)miR-142-3p抑制劑；(8)20mg/kg丙泊酚+miR-142-3p抑制劑。荷瘤小鼠處死后測量腫瘤體積和重量。2.分離荷瘤小鼠TAMs并與肝癌Hepal-6細胞共培養(yǎng),(?)ranswell小室進行細胞侵襲試驗。3.實時熒光定量PCR測定各組提取的巨噬細胞、微泡及肝癌Hepa1-6細胞內(nèi)的miR-142-3p含量,使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染miR-142-3p抑制劑給肝癌細胞荷瘤小鼠或巨噬細胞后測定miR-142-3p含量。結(jié)果：1.丙泊酚抑制肝細胞癌荷瘤小鼠腫瘤的生長。2.丙泊酚處理后的腫瘤組織TAMs可上調(diào)Hepa1-6細胞miR-142-3p的表達。3.丙泊酚刺激巨噬細胞miR-142-3p表達升高并作用于Hepa1-6細胞。4