當(dāng)歸多糖以Galectin-3為靶點(diǎn)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的構(gòu)效關(guān)系研究

當(dāng)歸多糖以Galectin-3為靶點(diǎn)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的構(gòu)效關(guān)系研究目的:當(dāng)歸Angelicasinensis（Oliv.）Diels作為祖國(guó)的傳統(tǒng)中藥應(yīng)用于血液疾病和婦科疾病等的治療由來(lái)已久。多糖為當(dāng)歸的主要活性成分之一,研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖具有顯著的抗氧化、抗腫瘤、促進(jìn)造血、免疫調(diào)節(jié)、防輻射等生物活性。已有文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)歸多糖對(duì)白血病細(xì)胞增殖可產(chǎn)生顯著的抑制,并誘導(dǎo)其凋亡,在治療白血病過(guò)程中發(fā)揮了攻補(bǔ)兼施的獨(dú)特療效。本課題組前期研究也表明,當(dāng)歸酸性多糖（特別是AAPS-2Ⅰ組分）有對(duì)白血病細(xì)胞增殖的直接抑制作用,且較當(dāng)歸中性多糖組分強(qiáng)。此外,前期實(shí)驗(yàn)也提示,Galectin3（Gal-3）可能是當(dāng)歸多糖誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用靶點(diǎn)。本課題擬通過(guò)1)分析活性多糖AAPS-2Ⅰ的結(jié)構(gòu)特征;2)建立AAPS-2Ⅰ多糖片段的制備方法,制備AAPS-2Ⅰ的酶降解和酸水解片段;3)篩選可以與Gal-3結(jié)合的AAPS-2Ⅰ多糖片段;4)測(cè)定AAPS-2Ⅰ及其片段對(duì)白血病細(xì)胞K562增殖的抑制和凋亡的誘導(dǎo)作用;5)綜合分析AAPS-2Ⅰ活性片段的結(jié)構(gòu)特征與誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的構(gòu)效關(guān)系五個(gè)方面的研究層層深入解析當(dāng)歸酸性多糖AAPS-2Ⅰ抑制白血病K562細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡的活性核心結(jié)構(gòu)特征,進(jìn)一步闡明AAPS-2Ⅰ發(fā)揮白血病細(xì)胞增殖抑制作用的靶點(diǎn)和治療白血病的藥效基礎(chǔ),為祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的臨床研究和新藥的開(kāi)發(fā)提供更多生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和研究依據(jù)。方法:（1）AAPS-2Ⅰ的結(jié)構(gòu)特征分析:HPSEC法測(cè)定當(dāng)歸酸性多糖AAPS-2Ⅰ的純度和分子量,苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法、考馬斯亮藍(lán)法分別測(cè)定AAPS-2Ⅰ的總糖含量、糖醛酸含量和蛋白含量,HPLC法測(cè)定AAPS-2Ⅰ的單糖組成,1D和2DNMR解析AAPS-2Ⅰ糖殘基類型和連接方式;（2）AAPS-2Ⅰ多糖片段的制備:酶降解法和酸水解法分別制備AAPS-2Ⅰ的酶降解片段和酸水解片段;（3）固相結(jié)合法、MST法測(cè)定8種當(dāng)歸均一性多糖及AAPS-2Ⅰ多糖片段與Gal-3的親和力;（4）CCK-8法測(cè)定8種當(dāng)歸均一性多糖及AAPS-2Ⅰ多糖片段對(duì)白血病細(xì)胞K562的增殖抑制,AnnexinV-FITC/PI雙染法測(cè)定各均一性多糖及AAPS-2Ⅰ多糖片段作用后白血病細(xì)胞K562的凋亡率;（5）HPLC法測(cè)定AAPS-2Ⅰ活性片段的單糖組成,NMR分析AAPS-2Ⅰ活性片段的結(jié)構(gòu)。結(jié)果:（1）HPSEC實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AAPS-2Ⅰ為分子量6.5×10⁴Da的均一性多糖;AAPS-2Ⅰ的總糖含量,糖醛酸含量和蛋白含量分別為96.37%,36.87%和1.08%;其單糖組成及摩爾比Man︰Rha︰GalA︰Glc︰Gal︰Ara（0.2︰0.4︰0.2︰1.0︰3.9︰2.4）,此外,還含有痕量的GlcA和Fuc;NMR解析發(fā)現(xiàn)AAPS-2Ⅰ結(jié)構(gòu)中主要含有α-L-1,5-Araf、α-L-1,3,5-Araf、T-α-Araf、β-D-1,4-Galp、β-D-1,3-Galp、T-α-Glcp、α-L-1,2-Rhap7種糖殘基。（2）建立了AAPS-2Ⅰ酶降解和酸水解片段的制備工藝,分別用β-半乳糖酶、β-甘露聚糖酶、果膠酶和鼠李糖酶4種酶對(duì)AAPS-2Ⅰ進(jìn)行降解,得到了Galase-1、Galase-2、Galase-3、Galase-4、Manase-1、Manase-2、Pecase-1、Pecase-2、Rhaase-1和Rhaase-2共10種酶降解片段;分別用0.5、1.0、2.0MTFA水解AAPS-2Ⅰ,透析得到3種酸水解片段AAPS-2Ⅰ-0.5-R、AAPS-2Ⅰ-1-R和AAPS-2Ⅰ-2-R。經(jīng)純化,獲得的13種均一性降解片段分子量831.7².5×10⁴Da。（3）MST研究發(fā)現(xiàn)在8種當(dāng)歸均一性多糖中,AAPS-2Ⅰ、AAPS-2Ⅱ和AAPS-1Ⅰ可以與Gal-3結(jié)合,解離常數(shù)（Kd）分別為:93.5±33μM、510.3±106μM和166±4.46μM,AAPS-2Ⅰ酶水解片段中Galase-4、Pecase-1、Rhaase-2與Gal-3有結(jié)合,Kd分別為24.5±12μM、166.7±120μM和596±146μM,酸水解片段均與Gal-3無(wú)結(jié)合作用;固相結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)Galase-4、Pecase-1和Rhaase-2與半乳糖競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Gal-3,IC₅₀分別為179±18mg/L、182±17mg/L和189±29mg/L。（4）CCK-8法測(cè)定當(dāng)歸各均一性多糖及AAPS-2Ⅰ多糖片段對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用,結(jié)果顯示在8種均一性多糖中,AAPS-2Ⅰ抑制作用最強(qiáng),其酶降解片段Galase-4可進(jìn)一步增加抑制作用,IC₅₀可達(dá)44.23mg/L,且呈濃度依賴性關(guān)系;AnnexinV-FITC/PI雙染色法測(cè)定當(dāng)歸各均一性多糖及AAPS-2Ⅰ多糖片段對(duì)K562凋亡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),AAPS-2Ⅰ可顯著地誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡,其酶降解片段Galase-4能進(jìn)一步促進(jìn)白血病細(xì)胞K562發(fā)生凋亡。（5）AAPS-2Ⅰ可能的糖鏈結(jié)構(gòu)含有:→2)-Rhap-（1→3）-Galp-（1→）-T-Glcp,→5)-Arap-（1→4）-Galp-（1→,→5）-Araf-（1→3,5）-Araf-（1→3）-T-Araf;與Gal-3親和作用最強(qiáng)的酶降解片段Galase-4結(jié)構(gòu)中含有→3)-Galp-（1→4）-Manp-（1→主鏈,→4）-Glcp-（1→5）-Araf-（1→支鏈;AAPS-2Ⅰ-0.5-R主要的糖鏈連接方式為:→4）-Manp-（1→4）-Glcp-（1→）-GlcpA。通過(guò)比較AAPS-2Ⅰ及其活性片段、酸水解片段的單糖組成和糖鏈連接方式,初步確定當(dāng)歸多糖抗白血病的構(gòu)效關(guān)系:酸性;GlcA和Rha為非必須糖殘基;→3)-Galp-（1→4）-Manp-（1→主鏈,→5）-Araf-（1→支鏈?zhǔn)侵匾幕钚詥卧?多糖酸化降解后活性喪失。結(jié)論:本研究初步解析了AAPS-2Ⅰ的結(jié)構(gòu)特征,其主要含有α-L-1,5-Araf、β-D-1,4-Galp、β-D-1,3-Galp和α-L-1,2-Rhap糖殘基;建立了AAPS-2Ⅰ酶降解和酸水解片段的制備工藝并制備得到了13種AAPS-2Ⅰ多糖片段;發(fā)現(xiàn)8種當(dāng)歸均一性多糖中,AAPS-2Ⅰ對(duì)白血病細(xì)胞K562的增殖抑制作用最為顯著,可通過(guò)結(jié)合Gal-3產(chǎn)生白血病細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用;其酶降解片段Galase-4對(duì)Gal-3的親和力、K562細(xì)胞的凋亡率和增殖抑制作用均進(jìn)一步增強(qiáng),表明Galase-4是主要“活