丙泊酚對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

丙泊酚對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究目的內(nèi)毒素血癥常見(jiàn)于嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克、重癥感染等應(yīng)激狀態(tài)下,來(lái)自于感染部位的LPS大量進(jìn)入體內(nèi),并引起炎癥介質(zhì)的大量合成、釋放,使包括腎臟在內(nèi)的多器官受累,在急性損傷的發(fā)生、發(fā)展中起著不可忽視的作用。腎臟又是代謝產(chǎn)物及毒素排泄的主要途徑,LPS亦可經(jīng)腎小管重吸收后,使腎小管上皮細(xì)胞處在高濃度LPS微環(huán)境中,可能對(duì)腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要的影響,在AKI的發(fā)生、發(fā)展中起著一定的作用。急性腎損傷所致的急性腎功能衰竭的特征性改變就是腎小球?yàn)V過(guò)率下降及腎小管功能障礙,完善的尿液濃縮與鈉離子重吸收的腎小管功能依賴于水通道蛋白的參與及功能性表達(dá)。AQPs（水通道蛋白）分布廣泛,腦、肺、腎等臟器組織均有不同亞型分布,對(duì)水和甘油等小分子物質(zhì)代謝有重要的調(diào)節(jié)作用,是保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要物質(zhì),也受多種因素影響其結(jié)構(gòu)和功能,從而改變對(duì)水的通透性,影響器官水和小分子物質(zhì)的代謝,同時(shí)也是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。1992年P(guān)reston等發(fā)現(xiàn)腎臟AQP,這一發(fā)現(xiàn)合理地解釋了腎臟自由水代謝的問(wèn)題。腎臟是水代謝的主要器官,AQPs在腎臟中的研究對(duì)揭示腎臟的病理生理改變具有重要作用。近期有報(bào)道藥物、缺血等引起的腎功能衰竭中AQP2表達(dá)明顯下調(diào),AQP2的這一變化與腎集合管上皮細(xì)胞損傷程度密切相關(guān),恢復(fù)早于形態(tài)學(xué)改變。已證明AQP2是集合管上皮細(xì)胞上最重要,且是惟一受AVP調(diào)節(jié)的水通道蛋白。分布在細(xì)胞頂質(zhì)膜及細(xì)胞內(nèi)小泡。AVP對(duì)AQP2的調(diào)節(jié)有2種方式:（1）短期調(diào)節(jié)作用,AQP2氨基酸序列中從253-256位含蛋白激酶A（PKA）磷酸化部位,AVP與V2R結(jié)合后激活A(yù)C-cAMP-PKA信號(hào)傳導(dǎo)途徑,導(dǎo)致AQP2磷酸化,是含AQP2的細(xì)胞內(nèi)小泡向細(xì)胞頂質(zhì)膜轉(zhuǎn)移并與之熔接,從而使細(xì)胞膜對(duì)水的滲透性迅速增加,這種調(diào)節(jié)作用可在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生。（2）長(zhǎng)期調(diào)節(jié)作用:V2R穩(wěn)定激活可導(dǎo)致AQP2合成增加,AVP是通過(guò)V2RcAMP-PKA信號(hào)傳遞途經(jīng)致細(xì)胞核內(nèi)cAMP結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子磷酸化及cjun/cFos基因表達(dá),影響AQP2mRNA轉(zhuǎn)錄及AQP2蛋白合成,從而上調(diào)AQP2的總豐度,因而改變腎臟集（?）管對(duì)水的滲透性,AQP2mRNA的變化可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)。近年研究發(fā)現(xiàn)AQPs可以改善一些病理過(guò)程中臟器如肺、腦、腎的水及小分子物質(zhì)的代謝,減少這些相應(yīng)臟器的水腫和損傷,水通道蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞移行對(duì)急性腎損傷腎小管功能的恢復(fù)和重建很重要,與預(yù)防和治療這些重要臟器損傷關(guān)系密切,研究其在這些病理過(guò)程中功能和結(jié)構(gòu)的變化有助于指導(dǎo)用藥。早期發(fā)現(xiàn)和治療腎功能異常不僅對(duì)于糾正休克具有作用,對(duì)于內(nèi)臟器官保護(hù)具有更加重要的意義。水通道蛋白可以受多種因素影響,但是對(duì)其有調(diào)節(jié)作用的藥物并不多,其阻斷劑也多為重金屬物質(zhì),本身就對(duì)生物體有損傷,少數(shù)藥物如糖皮質(zhì)激素?fù)?jù)報(bào)道有一定的水通道蛋白調(diào)節(jié)作用。目前研究表明麻醉藥如異氟烷、七氟烷、利多卡因和丙泊酚等對(duì)心、腦、肺和腎等臟器的不同損傷具有保護(hù)作用,丙泊酚作為一種靜脈麻醉藥具有鎮(zhèn)靜催眠作用,廣泛應(yīng)用于臨床,有報(bào)道在內(nèi)毒素血癥肺損傷時(shí)丙泊酚可以通過(guò)調(diào)節(jié)AQP1起到保護(hù)作用,但對(duì)大鼠內(nèi)毒素血癥腎損傷是否通過(guò)調(diào)節(jié)AQPs起到保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)并模擬病人內(nèi)毒素血癥觀察所見(jiàn)建立大鼠內(nèi)毒素血癥模型,12小時(shí)后行功能檢查并留取腎臟標(biāo)本,病理檢查腎臟損傷情況以及觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)的改變,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)、Western印跡雜交技術(shù)、免疫組織化學(xué)染色技術(shù)等檢測(cè)AQP2基因mRNA和AQP2蛋白、TNF-α、ICAM-1、Bcl2、Bax、Caspase3蛋白等在大鼠內(nèi)毒素血癥腎損傷過(guò)程中表達(dá)的變化,細(xì)胞凋亡程度;同時(shí)觀察在大鼠內(nèi)毒素血癥腎損傷過(guò)程中應(yīng)用公認(rèn)的具有抗炎抗氧化作用的靜脈麻醉藥丙泊酚,采用預(yù)處理,同時(shí)給藥和后處理的不同時(shí)間給藥方式,觀察其在大鼠內(nèi)毒素血癥腎損傷過(guò)程中對(duì)腎臟功能和AQP2基因mRNA、AQP2蛋白、ICAM-1、Bcl2、Bax、Caspase3和細(xì)胞凋亡程度的影響,從分子生物學(xué)角度觀察和探討不同丙泊酚給藥時(shí)間對(duì)大鼠內(nèi)毒素血癥腎損傷的作用,為指導(dǎo)臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)包括三部分:1、內(nèi)毒素血癥大鼠腎臟AQP2基因表達(dá)及結(jié)構(gòu)功能變化;2、丙泊酚對(duì)大鼠內(nèi)毒素血癥腎組織AQP2基因表達(dá)及結(jié)構(gòu)功能的影響;3、丙泊酚對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)材料1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取48只Wistar大鼠（體重在200g—300g之間）,由沈陽(yáng)軍區(qū)總院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2實(shí)驗(yàn)試劑aquaporin2一抗:兔抗鼠aquaporin2,試劑盒（武漢博士德公司）;二抗:羊抗兔IgG,試劑盒（美國(guó)西格瑪公司）;異丙酚（ASTRAZENECA）;Bcl-2/Bax兔抗鼠多克隆抗體（即用型）（santa,美國(guó)）;caspase-3兔抗鼠多克隆抗體（Neomarker,美國(guó)）;Histostain^TMPlusKitsS-P9000免疫組化染色試劑盒、ZLI-9108濃縮型DAB試劑盒（北京中杉生物公司）;Trizol（Invitrogen,美國(guó)）;OnestepRT-PCR試劑盒（大連寶生物公司）;聚偏二氟乙烯（PVDF）蛋白印跡膜（Bio-Rad,美國(guó)）;PBS等其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。3主要實(shí)驗(yàn)儀器（1）振蕩水浴箱（GFLTHERMOLAB,美國(guó)）（2）超低溫冰箱（SANYOMDF-U,日本）（3）旋渦振蕩器（VORTEX-2GENE,美國(guó)）（4）水平板電泳系統(tǒng)（BIO-RADSub-cellGT,美國(guó)）（5）通用電泳儀（BIO-RADPowerPac200,美國(guó)）（6）臺(tái)式低溫高速冷凍離心機(jī)（Sigma3K30,美國(guó)）（7）顯微圖像分析系統(tǒng)（OlympusAX70/Coolsnapfx/MetaMorph,日本）（8）電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（余姚TDW,中國(guó)）（9）自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀（AlphainnotechChemiImager5500,美國(guó)）（10）小型垂直電泳儀（Bio-RadMini-ProteinⅢ,美國(guó)）（11）半干轉(zhuǎn)印儀（Bio-RadSeimidrytransfersystem,美國(guó)）（12）自動(dòng)封膜儀（江蘇儀器設(shè)備公司,中國(guó)）（13）HEIDOLPHDIAX900型勻漿機(jī)（德國(guó)）（14）PTC-100型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)）（15）GLS-700D型數(shù)碼凝膠掃描分析系統(tǒng)（上海,中國(guó)）（16）A-200Ds電子天平（美國(guó)）（17）B-Brown微量泵（德國(guó)）（18）超純水裝置（MILLIPOREMILLI-Q,美國(guó)）（19）實(shí)驗(yàn)室制冰機(jī)（ZIGERA2BE-70-35,德國(guó)）（20）小型臺(tái)式離心機(jī)（SIGMA1-13,美國(guó)）（21）PH計(jì)（WTWInoLab,德國(guó)）（22）電動(dòng)高壓消毒鍋（HIRAYAMAHVE-50,美國(guó)）（23）HSS-1數(shù)字超級(jí)恒溫浴槽（成都儀器廠,中國(guó)）實(shí)驗(yàn)方法1.建立模型Wistar大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（40mg/kg）進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)及維持,LPS5mg/kg靜脈注射建立大鼠內(nèi)毒素血癥模型,按照各組要求給予相應(yīng)藥物靜脈注射(異丙酚:持續(xù)4小時(shí)靜脈輸注30mg·kg^-1·h^-1)后分別置入各自代謝籠中,以分別收集尿液,正常取食水,12小時(shí)后收集尿液和采取血液行功能檢查及提取腎臟標(biāo)本。2.分組和取材實(shí)驗(yàn)共分6組,分別為空白對(duì)照組（C1組8只）;注射生理鹽水和脂肪乳組（C2組8只）;注射內(nèi)毒素和脂肪乳組（L組8只）;丙泊酚預(yù)處理組（P1組8只,注射LPS前1小時(shí)開(kāi)始輸注丙泊酚）;丙泊酚同時(shí)給藥組（P2組8只,注射LPS后立刻繼以丙泊酚輸注）和丙泊酚后處理組（P3組8只,注射LPS后1小時(shí)開(kāi)始輸注丙泊酚）。12小時(shí)后收集尿液并記錄尿量,然后眼動(dòng)脈取血3ml置于真空采血管內(nèi),靜置30min后在德國(guó)Sigma離心機(jī)上3000r/min（r=9cm）離心10min,取上清置于滅菌子彈頭內(nèi)凍于-20℃冰箱內(nèi)待測(cè),應(yīng)用7600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)BUN、Crea,折射儀冰點(diǎn)下降法測(cè)血、尿滲透壓。收集血、尿后斷頭處死大鼠,嚴(yán)格滅RNA酶操作下取各組腎臟組織,取部分腎臟分離出腎髓質(zhì)置于滅菌子彈頭內(nèi)用液氮罐轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱內(nèi)待測(cè),一部分放入TRIZOL液中保存;另取部分腎臟經(jīng)甲醛固定后HE染色以光鏡觀察腎集合管形態(tài)學(xué)變化和留待免疫組化分析。為電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)改變,另橫斷腎皮質(zhì)髓質(zhì),取腎組織1mm³置25ml/L戊二醛中固定,固定的組織經(jīng)磷酸鹽緩沖液中充分漂洗,鋨酸后固定,丙酮酸梯度脫水,環(huán)氧數(shù)脂618浸透處理,半薄切片定位腎小球,超薄切片,醋酸鈉和枸櫞酸鉛雙重染色,透視電鏡下觀察。3.檢測(cè)指標(biāo)（1）RT-PCR:RT-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞AQP2mRNA、TNF-α、ICAM-1mRNA。TRIZOL裂解各組細(xì)胞后進(jìn)行總RNA的提取,一步法RT-PCR,按寶生物公司逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒使用說(shuō)明操作。按試劑盒說(shuō)明加入反應(yīng)體系。逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,反應(yīng)條件為42℃30min,95℃5min。直接進(jìn)入第二鏈cDNA合成及PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為94℃變性40s,54℃退火40s,72℃延伸60s,38個(gè)循環(huán),最后72℃5min結(jié)束,4℃保存。取8ulPCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳,在溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部邊緣時(shí)停止電泳。以溴化乙啶液（1ug/ul）覆蓋凝膠,染色5min自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀下觀察拍照。測(cè)定電泳條帶灰度值,與β-actin灰度值相比以百分?jǐn)?shù)表示。（2）免疫組織化學(xué)染色技術(shù):免疫細(xì)胞化學(xué)染色測(cè)定caspase3蛋白、Bcl-2/Bax蛋白和AQP2蛋白表達(dá)10%福爾馬林溶液中固定腎組織經(jīng)脫水、切片后,SP法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,染色步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,封片。采用顯微圖像分析系統(tǒng)（OlympusAX70/Coolsnapfx/MetaMorph）圖像處理分析儀檢測(cè),每組在高倍鏡下（×400）隨機(jī)選擇6個(gè)視野,測(cè)出caspase3、Bcl-2、Bax和AQP2蛋白等的平均光密度。腎組織AQP一2蛋白表達(dá)檢測(cè)常規(guī)固定包埋后切片,以二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水,0.3過(guò)氧化氫處理后,熱抗原修復(fù),反復(fù)加熱3次,待切片冷卻后按SABC免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）提供的方法,即予以一抗（羊抗小鼠AQP2多克隆抗體,美國(guó)SANTA公司）1:100稀釋后孵育（4℃,過(guò)夜）,二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG,杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）以1:500稀釋后孵育（37℃,60min）,DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,常規(guī)樹(shù)脂封片后觀察。AQP-2陽(yáng)性部位呈棕黃色染色。（3）Western印跡雜交技術(shù):腎AQP2、TNF-α、ICAM-1蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用Westernblot技術(shù),A.蛋白質(zhì)樣品的制備①每管腎組織中加入蛋白裂解緩沖液1.0ml,用研磨器反復(fù)混勻,冰浴30分鐘后,12000rpm,4℃離心15分鐘,收集上清,分裝后保存于-70℃。②蛋白質(zhì)濃度測(cè)定:在紫外分光光度計(jì)于570nm測(cè)定吸光度值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出實(shí)際蛋白含量。B.SDS電泳①將玻璃板用清洗劑洗凈,晾干。配制12%的分離膠,將分離膠注入玻璃板夾層中,上面流出灌注積層膠所需空間（梳子的齒長(zhǎng)再加上1cm）。用吸管在膠面上覆蓋一層超純水,保持膠面平整,將凝膠垂直放置在室溫。②待分離膠完全聚合后（30分鐘）,傾出覆蓋層的液體,用去離子水洗滌凝膠頂部數(shù)次以除去未聚合的丙烯酰胺。配置好一定濃度的濃縮膠（4%）,將其直接灌注在已聚合的分離膠面上,立即在濃縮膠中插入干凈的梳子,小心避免混入氣泡,在加入濃縮膠液以充滿梳子間的空隙,將凝膠垂直放置在室溫下。③待濃縮膠完全聚合時(shí),將待分析的蛋白質(zhì)樣品置于1×SDS凝膠加樣緩沖液中,100℃加熱3～5分鐘使蛋白質(zhì)變性,插入冰浴冷卻后上樣。④在電泳槽中加入電泳緩沖液,小心拔出上樣梳,然后用注射器洗干凈加樣孔,用微量加樣器分別吸取待分析樣品,根據(jù)蛋白質(zhì)的濃度和加樣孔體積決定加樣量。⑤加樣完畢后,接通電源,起始時(shí)用低電壓或低電流,當(dāng)樣品在濃縮膠部分濃縮成一條直線,進(jìn)入分離膠后,將電源電壓或電流提高,繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠底部邊緣時(shí)即可停止電泳。⑥從電泳裝置上卸下玻璃板,放在紙巾上,撬開(kāi)兩層玻璃,取出凝膠。C.轉(zhuǎn)膜①將電泳后的膠取出浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中,水平搖床緩慢搖30分鐘,裁取相同大小的聚偏二氟乙烯（PVDF）蛋白印跡膜,甲醇浸透,棄去甲醇后浸入蒸餾水或1×TBS中,再將PVDF膜浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中至少5分鐘。②用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕一張厚濾紙,鋪于半干轉(zhuǎn)印儀的底層電極板上,將PVDF膜鋪于濾紙上,勿留氣泡,將凝膠貼于PVDF膜上,不留氣泡,潤(rùn)濕另一張濾紙,蓋在凝膠上,用玻璃棒趕去氣泡。蓋上頂層電極板,接通正負(fù)極電源,15V（不超過(guò)25V）轉(zhuǎn)印10～30分鐘。D,雜交①取出PVDF膜,1×TBS洗一次,和膠相鄰面向上浸入封閉液中置于水平搖床緩慢搖1小時(shí)至過(guò)夜。②倒掉封閉液,用洗膜液略洗一下,加入用雜交液按1:500稀釋的一抗（iNOS、eNOS和ET-1兔抗鼠多克隆抗體）,在搖床搖床上室溫雜交1小時(shí)。取出PVDF膜,用洗膜液洗3次,每次5～15分鐘。③倒掉洗膜液,加入用雜交液按比例（1:30000）稀釋的二抗（堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔IgG,稀釋度為1:5000）,搖床上雜交45分鐘。取出膜,用洗膜液洗3次,每次5～15分鐘。E.顯色取出PVDF膜放入堿性磷酸酶顯色液中,顯色5-30min,顯色明顯后取出PVDF膜,晾干,備掃圖,圖像分析軟件分析各電泳條帶灰度值,半定量測(cè)定蛋白含量。（4）TUNEL法檢測(cè)鼠腎臟細(xì)胞凋亡程度:10%福爾馬林溶液中固定腎組織經(jīng)脫水、切片后,SP法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,染色步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,封片。每組在高倍鏡下（×400）隨機(jī)選擇6個(gè)不重復(fù)視野,計(jì)數(shù)鼠腎小管細(xì)胞凋亡數(shù)量,以細(xì)胞核呈棕黃色為陽(yáng)性即凋亡細(xì)胞。（5）HE染色觀察腎臟病理學(xué)改變:取腎組織10%中性甲醛固定,脫水后常規(guī)石蠟包埋,切片厚度4μm,行HE染色,用普通光學(xué)顯微鏡在400倍光鏡下,隨機(jī)選取5個(gè)視野,每個(gè)視野10個(gè)腎小管計(jì)分,光鏡下腎小管病變程度采用Paller氏標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分,以上檢查交由病理專業(yè)人士進(jìn)行,采用單盲法;電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)改變,標(biāo)本處理:低溫下橫斷腎皮質(zhì)髓質(zhì),取腎組織1mm³置25ml/L戊二醛中固定,固定的組織經(jīng)磷酸鹽緩沖液中充分漂洗,鋨酸后固定,丙酮酸梯度脫水,環(huán)氧數(shù)脂618浸透處理,半薄切片定位腎小球,超薄切片,醋酸鈉和枸櫞酸鉛雙重染色,透視電鏡下觀察。（6）腎臟功能學(xué)檢測(cè):收集尿液計(jì)量后凍存,眼動(dòng)脈抽血3ml離心后取上清-20℃保存,留待血肌酐、尿素氮含量測(cè)定,血、尿滲透壓測(cè)定采用折射儀冰點(diǎn)下降法測(cè)量。4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（（?）±s）表示,采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,方差齊性采用LSD檢驗(yàn),方差不齊采用DunnettT3檢驗(yàn),P＜0.05差異具有顯著性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.與兩個(gè)對(duì)照組相比內(nèi)毒素組尿量減少,血肌酐、尿素氮、血滲透壓均明顯提高,而尿滲透壓明顯下降,不同時(shí)間應(yīng)用丙泊酚后出現(xiàn)不同程度的改善,尿量增加,血肌酐、尿素氮、血滲透壓下降,尿滲透壓提高。2.與兩個(gè)對(duì)照組相比內(nèi)毒素組大鼠腎臟AQP2mRNA和蛋白的表達(dá)減少（P＜0.01）,、TNF、ICAM-1的mRNA和蛋白表達(dá)增多（P＜0.01）,而應(yīng)用丙泊酚預(yù)處理、同時(shí)處理和后處理可以不同程度的糾正上述變化。3.與兩個(gè)對(duì)照組比較內(nèi)毒素血癥大鼠腎臟caspase3和bax蛋白等促凋亡物質(zhì)表達(dá)增加,bcl2作為一種抗凋亡物質(zhì)表達(dá)減少,bcl2/bax比值下降,細(xì)胞凋亡明顯增加,而經(jīng)過(guò)丙泊酚處理后減輕上述表現(xiàn),bcl2/bax比值得到恢復(fù)。4.腎組織超微結(jié)構(gòu)的改變對(duì)照組腎組織超微結(jié)構(gòu)基本正常,腎小管上皮細(xì)胞及細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常。腎小管細(xì)胞核形態(tài)完整,無(wú)腫脹,大量線粒體、核糖體存在,無(wú)空泡變性,無(wú)斷裂,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)擴(kuò)張,核糖體存在無(wú)脫落;內(nèi)毒素組腎小管細(xì)胞受損,胞膜破裂,細(xì)胞核圓形其中異染色質(zhì)邊集,細(xì)胞膜表面微絨毛破壞,線粒體腫脹,破碎,嵴部分消失,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。P₁和P₂組腎小管細(xì)胞絕大部分結(jié)構(gòu)正?；蚧菊?腎小管細(xì)胞核形態(tài)、結(jié)構(gòu)存在,核仁清楚,線粒體嵴稍擴(kuò)張,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微絨毛稍擴(kuò)張,較內(nèi)毒素組超微結(jié)構(gòu)明顯改善。P₃組腎小管損傷略重,細(xì)胞器減少空泡變性明顯,但與內(nèi)毒素組比較也有改善。5.腎組織病理改變對(duì)照組形態(tài)學(xué)觀察未見(jiàn)明顯異常;內(nèi)毒素組腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死,細(xì)胞脫落,腎小管管腔變窄,腎間質(zhì)水腫、充血,P₁和P₂組腎小管排列基本正常,以腫脹為主,腎間質(zhì)水腫、充血,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯。P₃組腎小管的改變也有改善。光鏡下腎小管損傷Paller氏評(píng)分,P₁和P₂組顯著低于L組（P＜0.01）,P₃組也有差異（P＜0.05）。討論本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道模擬內(nèi)毒素血癥病人觀察所見(jiàn)建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型,研究丙泊酚不同給藥時(shí)間對(duì)腎臟功能學(xué)的影響并提取腎臟標(biāo)本,行病理學(xué)檢查及超微結(jié)構(gòu)觀察并采用免疫組化和westernblot等技術(shù)檢測(cè)水通道蛋白、腫瘤壞死因子、細(xì)胞間黏附分子、bcl2/bax以及caspase3水平和凋亡細(xì)胞數(shù)量,詣在探討丙泊酚的腎臟保護(hù)作用及可能機(jī)制,為指導(dǎo)臨床麻醉用藥提供依據(jù)。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,內(nèi)毒素血癥大鼠12小時(shí)后血Cr、BUN等水平顯著升高,血滲透壓升高、尿滲透壓下降,出現(xiàn)AKI的負(fù)水平衡及高滲改變;透射電鏡觀察腎集合管超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),內(nèi)毒素組腎小管細(xì)胞核、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微絨毛等均遭破壞,但緊密連接尚在;光鏡結(jié)果顯示:內(nèi)毒素組腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死,細(xì)胞脫落,腎小管管腔變窄,腎間質(zhì)水腫、充血;免疫組化等檢查發(fā)現(xiàn),內(nèi)毒素組水通道蛋白含量明顯下降,腫瘤壞死因子、細(xì)胞間黏附蛋白等表達(dá)增多,Bcl2/Bax比值下降,caspase3表達(dá)增加,細(xì)胞凋亡增加,不同時(shí)間給予丙泊酚后,各種功能學(xué)檢查以及腎集合管的超微結(jié)構(gòu)和病理改變均得到改善,水通道蛋白的表達(dá)增加,上調(diào)了抗凋亡基因Bcl-2mRNA的表達(dá),腫瘤壞死因子、細(xì)胞間黏附分子、caspase3等表達(dá)下降,腎小管凋亡細(xì)胞減少。上述結(jié)果表明,不同時(shí)間應(yīng)用丙泊酚給藥能對(duì)抗內(nèi)毒素血癥腎損傷,有利于腎結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。內(nèi)毒素血癥常見(jiàn)于嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克、重癥感染等應(yīng)激狀態(tài)下,來(lái)自于感染部位的LPS大量進(jìn)入體內(nèi),并引起炎癥介質(zhì)的大量合成、釋放,導(dǎo)致細(xì)胞變性和壞死,表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)的損害和器官功能的衰退;LPS引起腎小球尤其是入球卸鍪賬?使腎內(nèi)血流再分布,造成腎血流及腎小球?yàn)V過(guò)率下降,從而誘發(fā)腎缺血再灌注損傷,同樣的在急性腎損傷的發(fā)生、發(fā)展起著不可忽視的作用;腎臟又是代謝產(chǎn)物及毒素排泄的主要途徑,LPS亦可經(jīng)腎小管重吸收后,使腎小管上皮細(xì)胞處在高濃度LPS微環(huán)境中,可能對(duì)腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要的影響,在AKI的發(fā)生、發(fā)展中也起著一定的作用。丙泊酚是一種臨床常用靜脈麻醉藥,其特有的功能和結(jié)構(gòu)使其具有抑制炎性反應(yīng)、減輕炎性因子釋放、抑制炎癥細(xì)胞的聚集活化從而減輕炎癥反應(yīng)強(qiáng)度、增強(qiáng)抗炎功能并減少壞死及凋亡,具有保護(hù)臟器作用,有研究表明丙泊酚可以在內(nèi)毒素血癥肺損傷時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)AQP1并減少局部TNF等物質(zhì)產(chǎn)生減輕肺泡上皮細(xì)胞損傷的作用,本實(shí)驗(yàn)觀察到在內(nèi)毒素血癥急性腎損傷過(guò)程中應(yīng)用丙泊酚處理的幾組均表現(xiàn)出不同程度的損傷減輕表現(xiàn),而脂質(zhì)溶劑組則沒(méi)有這種效果,說(shuō)明是丙泊酚本身可能通過(guò)調(diào)節(jié)局部的水通道蛋白表達(dá)及相關(guān)因子水平和腎的灌注而起到了腎臟的保護(hù)作用。內(nèi)毒素血癥腎損傷所致的急性腎功能衰竭的特征性改變就是腎小球?yàn)V過(guò)率下降及腎小管功能障礙,完善的尿液濃縮與鈉離子重吸收的腎小管功能依賴于水通道蛋白及其它離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與及功能性表達(dá)。AQPs（水通道蛋白）分布廣泛,腦肺腎等臟器組織均有不同亞型分布,對(duì)水和甘油等小分子物質(zhì)代謝有重要的調(diào)節(jié)作用,是保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要物質(zhì),也受多種因素影響其結(jié)構(gòu)和功能,由于AQPs對(duì)多種病理過(guò)程和很多細(xì)胞因子炎癥因子的敏感性,從而改變對(duì)水的通透性,影響器官水和小分子物質(zhì)的代謝,同時(shí)也是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。腎臟AQP的發(fā)現(xiàn)合理地解釋了腎臟自由水代謝的問(wèn)題。正是因?yàn)槟I臟是水代謝的主要器官,AQPs在腎臟中的研究對(duì)揭示腎臟的病理生理改變具有重要作用。近期有報(bào)道藥物、缺血等引起的腎功能衰竭中AQP2表達(dá)明顯下調(diào),AQP2的這一變化與腎集合管上皮細(xì)胞損傷程度密切相關(guān),恢復(fù)早于形態(tài)學(xué)改變。已證明AQP2是集合管上皮細(xì)胞上最重要的水通道蛋白。分布在細(xì)胞頂質(zhì)膜及細(xì)胞內(nèi)小泡,其豐度影響集合管對(duì)水的通透性,幾分鐘內(nèi)即可發(fā)生變化。近年研究發(fā)現(xiàn)AQPs可以改善一些病理過(guò)程中臟器如肺、腦、腎的水及小分子物質(zhì)的代謝,減少這些相應(yīng)臟器的水腫和損傷,水通道蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞移行對(duì)急性腎損傷腎小管功能的恢復(fù)和重建很重要,與預(yù)防和治療這些重要臟器損傷關(guān)系密切,研究其在這些病理過(guò)程中功能和結(jié)構(gòu)的變化有助于指導(dǎo)用藥。本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到與對(duì)照組比較,注射脂質(zhì)溶劑+內(nèi)毒素組的水通道蛋白含量減少,提示水通道蛋白的減少可能是急性腎損傷的一個(gè)因素,而應(yīng)用丙泊酚的幾組中水通道蛋白2的含量不同程度的均有提高,提示丙泊酚本身具有直接的或間接的作用調(diào)整水通道蛋白2從而起到腎臟保護(hù)的作用,當(dāng)然,局部的炎性反應(yīng)、其它的水通道蛋白和離子通道也參與其中,確切機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。研究表明大量細(xì)胞因子參與了內(nèi)毒素血癥的過(guò)程,其中包括IL-1β,IL-6,ICAM-1,VCAM-1和TNF-a,這些炎性因子誘導(dǎo)炎性瀑布,放大炎性反應(yīng)。TNF-α是一種17kd的多肽,被認(rèn)為是全身炎性反應(yīng)的啟動(dòng)和關(guān)鍵因子。有研究表明,TNF-α對(duì)腎組織有較強(qiáng)毒性,具有直接的細(xì)胞毒性,直接引起細(xì)胞壞死,還可以通過(guò)微循環(huán)障礙導(dǎo)致細(xì)胞壞死,在內(nèi)毒素刺激下與其它炎癥介質(zhì)相互激發(fā),可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放IL-1,IL-1隨后又刺激產(chǎn)生其它細(xì)胞因子的生物合成,如加強(qiáng)ICAM-1mRNA的表達(dá),使炎癥信號(hào)進(jìn)一步擴(kuò)大,反過(guò)來(lái)增強(qiáng)組織對(duì)TNF-α的敏感性。給動(dòng)物注射適量的TNF-α能引起急性腎損傷,如給以TNF-α抗體或是采取措施減少其產(chǎn)生能阻斷內(nèi)毒素的損傷作用。本研究證實(shí),內(nèi)毒素血癥后,腎皮質(zhì)TNF-αmRNA表達(dá)明顯增加,表明其參與了AKI的病理過(guò)程,而給予異丙酚能顯著減少TNF-αmRNA和TNF-α蛋白表達(dá),從而明顯減少腎組織中TNF-α的含量,減輕腎損傷。ICAM-1是細(xì)胞表面的糖蛋白,是內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一部分。內(nèi)毒素血癥后,LPS刺激及機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子,這些物質(zhì)在激活白細(xì)胞的同時(shí),也激活了血管內(nèi)皮細(xì)胞,前者在細(xì)胞表面表達(dá)CD11/CD18糖蛋白黏附復(fù)合物,后者表達(dá)ICAM-1,二者相互結(jié)合,引起白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,促進(jìn)白細(xì)胞聚集活化,釋放炎性介質(zhì)。正常腎組織缺乏ICAM-1表達(dá),LPS及細(xì)胞因子均能使ICAM-1mRNA表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致循環(huán)白細(xì)胞在局部黏附,于外髓質(zhì)形成梗阻,同時(shí)使內(nèi)皮通透性增加,且浸潤(rùn)、激活的白細(xì)胞還可導(dǎo)致直接的組織損傷,紅細(xì)胞凝聚導(dǎo)致再灌注后