華中農業(yè)大學病毒學實驗技術第六章病毒純化

第六章病毒的純化利用各種物理、化學方法，以不使病毒受損傷和失活為前提，去除宿主細胞組分等非病毒雜質，提取出高純度濃縮的病毒樣品。病毒微細構造的研討病毒抗原蛋白的分別純化病毒化學成分及其遺傳物質的研討病毒感染的分子細節(jié)的研討一、病毒純化的規(guī)范堅持感染性具有均一性：結晶構成檢測病毒制備物均一性的方法：電鏡察看：大小、形狀均一超速離心：沉降速率和密度一致，只出現(xiàn)一條沉降帶電泳：顆粒大小及外表電荷均一，只構成一條電泳帶免疫學方法：只與特異性抗體發(fā)生反響大小、形狀、密度、化學組成、分子量、抗原性二、病毒純化的實際根據病毒體外外表的主要化學組成是蛋白質，可利用蛋白質提純的方法純化病毒病毒體具有一定大小、外形和密度，可利用超速離心技術提純病毒三、病毒純化前的預處置1、病毒感染的組織、臟器或細胞研磨勻漿超聲波處置反復凍融低速離心去掉細胞碎片2、細胞培育液、雞胚尿囊液低速離心去掉能夠含有的雜質或直接用于病毒的分別純化沉淀法超速離心法超濾法層析法兩相溶劑間分配系數(shù)法吸附法電泳法四、病毒純化的方法〔一〕沉淀法主要從稀的病毒懸浮液中濃縮病毒。中性鹽沉淀法〔鹽析〕聚乙二醇沉淀法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法皂土法魚精蛋白沉淀法1、中性鹽沉淀法〔鹽析〕先用其它方法去除資料中的大量雜質，再以高濃度的中性鹽溶液鹽析，析出的沉淀用緩沖液懸浮后再進展鹽析，反復幾次后，懸浮沉淀，用透析法或其它方法脫鹽。病毒普通在45%以上飽和度的硫酸銨溶液中沉淀，且堅持感染性。2、聚乙二醇〔PEG〕沉淀法用于病毒沉淀的分子量：2000-6000將PEG配成50%左右的溶液，或直接將固體PEG加于病毒懸液中，使其到達所需濃度，在4℃攪拌過夜，然后離心使病毒沉淀。3、有機溶劑沉淀法乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物原理：A、降低溶液的介電常數(shù)，從而添加病毒顆粒外表不同電荷之間的引力，導致其溶解度降低。B、與水作用，破壞蛋白質分子的水化膜。優(yōu)點：分辨力高，易除去缺陷：易使外表蛋白量變性，溶解脂質4、等電點沉淀法〔分辨力不高〕原理：病毒粒子在等電點時，所攜帶的正電荷與負電荷相互中和，因此失去相互排斥的作用而發(fā)生沉淀〔分辨力不高〕。多數(shù)病毒的等電點在pH4.０~5.5之間。5、皂土法輪狀病毒皂土在酸性條件下〔pH4~4.5)可吸附輪狀病毒，在堿性條件下(pH8.5)，又使其洗脫下來。6、魚精蛋白沉淀法〔沉淀直徑大于50nm的病毒〕魚精蛋白為堿性蛋白，具有攜帶其它蛋白質〔直徑大于50nm〕共沉淀的作用，當向這種沉淀物參與1mol/LNaCl時，其它蛋白質又重新釋放到懸液中，而魚精蛋白依然沉淀?！捕硨游龇ㄆ暇厶侵鶎游龇z層析法離子交換柱層析法親和層析法〔三〕兩相溶劑間分配系數(shù)法原理：溶質在兩個互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而選擇性地分配于其中的一方。常用的溶劑：葡聚糖硫酸鹽〔dextransulphate,Ds)聚乙二醇〔PEG〕甲基纖維素〔MC〕聚乙烯醇〔PVA〕分配體系：Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-MC系〔四〕吸附法原理：利用對病毒或對雜質有選擇吸附才干的固體吸附劑吸附病毒或吸附雜質，再用一定的鹽溶液把它們洗脫下來。作為吸附劑必需具備的特點：有較大的外表積和吸附才干較高的吸附選擇性便于洗脫性質穩(wěn)定常用吸附劑：白土磷酸鈣硅藻土紅細胞離子交換樹脂羧甲基纖維素〔六〕超濾法利用超濾膜將水、鹽及小分子濾過，將一定大小的大分子或病毒等顆粒截住從而使后者得到濃縮。優(yōu)點：可用于大容量樣品的濃縮可以在室溫或低溫下操作對被濃縮產物的損害小濃縮的同時可到達部分純化回收率高可防止外來污染〔五〕電泳法〔七〕離心法差速離心速度區(qū)帶離心法密度梯度離心1.差速離心法原理：不同大小和比重的粒子沉降速度不同。用途：從組織培育液、雞胚尿囊液或經過紅細胞吸附釋放的病毒懸液中提純病毒。優(yōu)點：可快速處置大量樣品步驟：低速〔2000-3000r/min,20-30min)、中速〔10000min,20-30min)去除較大的宿主細胞碎片、污染的細菌及其它較大的雜質。再選擇較高速度離心1-2h使病毒沉淀。速度梯度離心法密度梯度離心法原理沉降與顆粒質量成正比，以物質沉降速度的不同進行分離沉降與顆粒密度成正比，以物質浮密度的不同進行分離介質密度小，1-1.3286，預制梯度，不連續(xù)密度大，1-1.9025，連續(xù)梯度離心力場強，離心速度高，使被分離物質易沉降稍強，速度相對低，使CsCl形成梯度，建立沉降擴散平衡離心過程樣品向離心管底沉降樣品停留于介質的等密度部位離心時間較短，幾小時到幾十小時較長，十幾小時到數(shù)天2.速度梯度離心法與密度梯度離心法速度梯度離心密度梯度離心…………AB五、病毒純化應留意的問題1、堅持病毒的感染性嚴厲控制溫度、pH及試劑的選擇。2、選用適宜的純化實驗起始資料無其它病毒或毒株的污染病毒體的含量高雜質含量少并易于處置3、根據詳細情況選擇提純方法根據需求純化的病毒的性質、起始資料的特點、研討的目的以及實驗室的條件等，選擇適宜的純化方法。4、建立靈敏的病毒鑒定和測定方法六、偽狂犬病毒的濃縮提純1、病毒資料將偽狂犬病病毒接種于PK-15細胞，病變后搜集細胞培育物，反復凍融3次，即為樣品資料。2．病毒提純濃縮去細胞碎片及雜質：將細胞培育物4℃3000r/min離心30min，搜集上清液。硫酸銨沉淀：按100ml病毒液42.5g硫酸銨的量參與硫酸銨，攪勻后置4℃冰箱攪拌沉淀過夜，4℃5000r/min離心40min，去上清，沉淀用適量的滅菌ddH2O懸浮。透析：將懸浮的病毒液裝于透析袋中，于ddH2O或PBS中攪拌透析，每半個小時換一次液，共換5次，第5次透析過夜。濃縮：透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖將病毒濃縮至適宜的體積。超離純化：在離心管中參與不同濃度的甘油墊層，即先參與45%甘油，再參與5%甘油。參與病毒懸液〔應不超越離心管總容積的10%〕。20000-25000r/min離心2h。棄上層液體，沉淀用適量TEN重懸〔渦旋或超聲波處置，使沉淀分散〕。速度區(qū)帶離心密度梯度離心在離心管中參與不同濃度的CsCl或蔗糖墊層，再參與病毒懸液，超高速離心。蔗糖密度梯度離心：在離心管中參與20%～60%不延續(xù)蔗糖密度梯度,20000-25000r/min離心2h～3h，搜集蔗糖濃度為35%處的病毒帶，參與適量緩沖液稀釋后，再次20000-25000r/min離心2h，沉淀用適量TEN重懸。PrV鄂A株電鏡察看左圖：上帶中的PrV粒子右圖：下帶中的PrV粒子濃縮〔方法二〕將經低速離心去掉細胞碎片及雜質的病毒懸液直接20000-25000r/min離心2h。棄上層液體，沉淀用適量TEN重懸。將重懸的病毒液再經梯度離心純化。如何利用純化的病毒進展下一步的研討研討病毒的構造研討病毒感染的分子細節(jié)病毒粒子的標志研討與受體的結合研討病毒的侵入研討病毒在體內的移行病毒純化質譜分析靶蛋白驗證純化的病毒是不是