雜草抗藥性檢測(cè)方法

雜草抗藥性檢測(cè)方法崔海蘭中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所抗藥性雜草的形成ALS抑制劑：ACCase抑制劑：其他除草劑：

1/100,000？

1/1,000,000

？1/10,000,000

？ 激素類(lèi)&草甘膦：1/100,000,000？除草劑選擇壓 Heap，2021大穗看麥娘標(biāo)本。此標(biāo)本于1876年5月在俄國(guó)的葡萄園內(nèi)采集而來(lái)，保存在日內(nèi)瓦的植物公園內(nèi)〔瑞士〕。這個(gè)標(biāo)本為Alopecurusagrestis，是A.myosuroides〔大穗看麥娘〕以前的名稱(chēng) 樣本：734個(gè)；DNA提取不成功：49個(gè)；成功的：685個(gè) 在采集于1888年的一株大穗看麥娘內(nèi)檢測(cè)出除草劑抗性ACC酶Leu1781等位基因〔法國(guó)〕。1781突變生長(zhǎng)更旺盛？低劑量下

Lolium

rigidum快速形成抗藥性Neve

and

Powles

(2005)

Theor

Appl

Genet抗藥性形成影響因素除草劑選擇壓〔頻度，劑量〕生態(tài)適合度基因流〔花粉….〕抗性基因型的初始頻度抗藥性機(jī)理研究靶標(biāo)抗性非靶標(biāo)抗性突變過(guò)量表達(dá)代謝吸收、傳導(dǎo)隔離靶標(biāo)突變除草劑靶標(biāo)酶除草劑

靶標(biāo)酶靶標(biāo)過(guò)量表達(dá)除草劑靶標(biāo)酶靶標(biāo)抗性雜草?

ALS抑制劑抗性?

ACCase抑制劑抗性?

草甘膦抗性?

……雜草對(duì)ALS抑制劑的抗性?

約159種抗性雜草ALS

突變位點(diǎn)205376

377

574653654交互抗性？

編碼區(qū)全長(zhǎng)≈

2000bp標(biāo)準(zhǔn)參照：擬南芥內(nèi)含子、基因拷貝數(shù)？

122

197雜草對(duì)ACCase抑制劑的抗性?

約48種抗性雜草CTBCCBCTPBC:

biotin

carboxylase

生物素羧化酶BCC:

biotin

carboxyl

carrier

生物素羧基載體蛋白CT:

carboxyl

transferase

羧基轉(zhuǎn)移酶質(zhì)體

ACCase:

同質(zhì)型：敏感

ACCase:

>2000

aa異質(zhì)型：不敏感ACCase

基因突變位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)參照：鼠尾看麥娘

A.

myosuroidesPowlesandYu,2021AnnRevPlantbiologyShiv

Shankhar

KaundunPestManagSci2021;66:1249–1256Lolium

multiflorum炔草酯

APP烯草酮

CHD唑啉草酯

PPZ

日本看麥娘對(duì)3類(lèi)ACCase抑制劑的交互抗性模式

S2027位突變1781位突變Cuietal.,WeedTechnology202129:444–450草甘膦抗性cDNA分析；基因拷貝數(shù)是敏感的8倍，拷貝數(shù)和表達(dá)量呈現(xiàn)正相關(guān)；Palmer

amaranth

(Amaranthus

palmeri)Gainsetal.2021PNASEPSPS

gene

amplification

and

glyphosateresistance草甘膦抗性一個(gè)多抗性案例：牛筋草同時(shí)抗glufosinate,

glyphosate,

paraquat

and

ACCase-inhibiting

herbicidesJALALUDINA,YUQ&POWLESSB(2021).Multipleresistanceacrossglufosinate,glyphosate,paraquatandACCase-inhibitingherbicidesinanEleusineindicapopulation.WeedResearch55,82–89.抗藥性雜草檢測(cè)方法?

生物測(cè)定方法§整株測(cè)定〔盆栽〕§種子測(cè)定法§花粉管萌發(fā)法§瓊脂法?

靶標(biāo)抗性的快速分子檢測(cè)§測(cè)序§PCR§PCR+酶切§LAMP。。。。種子采集、整理、保存 雜草抗藥性水平檢測(cè)l整株植物測(cè)定法〔劑量反響曲線(xiàn)Doseresponseexperiments〕 通過(guò)整株雜草生物量對(duì)除草劑系列濃度的反響，建立劑量與生物量的關(guān)系， 以地上部生物量受藥劑的抑制程度來(lái)評(píng)價(jià)其對(duì)除草劑抗性。 生長(zhǎng)抑制中量使雜草地上部鮮重比不用藥處理降低50%的藥劑劑量 計(jì)算抗性指數(shù) 敏感 抗性-1 抗性-2抗性-3ShivShankharKaundunPestManagSci2021;66:1249–1256生物測(cè)定20g

a.i./ha苯磺隆用藥后21天MP11-3#敏感MP11-6#抗MP11-7#抗2〔河北〕/16〔河北、山東、河南、陜西〕吡嘧磺隆20g

a.i./ha為1倍劑量01/641/321/161/81/41/2124816倍生物測(cè)定生物測(cè)定雜草抗藥性檢測(cè)l

種子生物測(cè)定法通過(guò)種子在一定濃度梯度除草劑中的萌發(fā)率或胚根〔胚芽〕長(zhǎng)度，建立劑量與雜草發(fā)芽〔長(zhǎng)度〕的關(guān)系。楊彩宏，等.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007,40〔12〕：2759-2765.lRISQ〔ResistanceinSeasonQuick〕快速檢測(cè)法 2021，在當(dāng)季對(duì)田間疑似抗性植株進(jìn)行早期診斷，根據(jù)診斷結(jié)果給出合理用藥方案與一定體積的水混合吸干外表水分加熱溶解

植株分開(kāi)，洗

凈根部泥土溫度降至60度，加除草劑

混勻后倒入培

養(yǎng)皿等容器

稱(chēng)取瓊脂粉移栽到培養(yǎng)基lRISQ〔ResistanceinSeasonQuick〕快速檢測(cè)法培養(yǎng)容器發(fā)芽盒培養(yǎng)皿三角瓶組培專(zhuān)用容器為0.4uM0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0菵草用花粉檢測(cè)看麥娘對(duì)ACCase類(lèi)除草劑的靶標(biāo)抗性隨著芳氧苯氧丙酸類(lèi)除草劑的濃度的增加，三個(gè)種群的花粉萌發(fā)情況受到顯Weed

Research，

2000，40,

151–162培養(yǎng)基中預(yù)先添加了120微摩爾/升的fenoxaprop，對(duì)芳氧苯氧丙酸類(lèi)除草劑具有高抗種群的花粉仍能萌發(fā)。靶標(biāo)抗性的快速分子檢測(cè)測(cè)序方法：準(zhǔn)確，多位點(diǎn)很好的選擇基于酶切方法：CAPS(dCAPS)基于PCR的方法：PASA微測(cè)序方法：SNaPshotLAMP。。。。l

靶標(biāo)酶基因突變位點(diǎn)測(cè)定-適用于靶標(biāo)酶基因突變引起的抗性Genbank：查詢(xún)序列設(shè)計(jì)引物：〔Primer、DNAMAN、DNAstar、Oligo…〕PCR擴(kuò)增：〔溫度梯度PCR〕模板：DNA、RNA序列分析：直接測(cè)序、克隆測(cè)序兩端序列獲得：RACE、

Genome

Walking….拼接和完整序列擴(kuò)增明確突變位點(diǎn)l

靶標(biāo)酶基因突變位點(diǎn)測(cè)定-適用于靶標(biāo)基因突變引起的抗性測(cè)序法122197205376

377

574653654編碼區(qū)全長(zhǎng)≈

2000bp標(biāo)準(zhǔn)參照：擬南芥ALS基因抗藥性突變位點(diǎn)Cuietal.,PesticideBiochemistryandPhysiology，2021，102：229-232.

AB

C

DALS

197位

ALS

574位

EF

不同基因型的峰圖

A、E：敏感基因型

C、D、F：抗性基因型

B：雜合基因型R:S=1:1R:S=1:3R:S=1:5抗性和敏感性基因以一定比例混合后檢測(cè)結(jié)果dCAPS:(cleaved

amplified

polymorphicsequence，CAPS)或dCAPS

(derived

CAPS)PCR與限制性酶切相結(jié)合DE′LYEC&BOUCANSAUDK(2021).Amolecularassayfortheproactivedetectionoftargetsite-basedresistancetoherbicidesinhibitingacetolactatesynthaseinAlopecurusyosuroides.WeedResearch48,97–101.dCAPS:PASA:也稱(chēng)為AS-PCR

,Allele

Specific

PCR

關(guān)鍵：PCR