堿裂解法提取質(zhì)粒課件

堿裂解法提取質(zhì)粒DNA堿裂解法提取質(zhì)粒

通過(guò)質(zhì)粒的一些特性、質(zhì)粒DNA的提取、測(cè)定，學(xué)習(xí)用堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法，掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理及操作。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膲A裂解法提取質(zhì)粒質(zhì)粒(Plasmid)：質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。在細(xì)胞內(nèi)它們常以共價(jià)閉環(huán)的超螺旋形式存在。存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。二、實(shí)驗(yàn)原理堿裂解法提取質(zhì)粒堿裂解法提取質(zhì)粒質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，具有以下特點(diǎn)：

易于鑒定；在受體細(xì)胞中可以獨(dú)立復(fù)制；易于篩選；易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。

堿裂解法提取質(zhì)粒二、實(shí)驗(yàn)原理高堿細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物釋放①染色體DNA斷裂成不同長(zhǎng)度的線性雙鏈DNA；②線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。①質(zhì)粒DNA不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀；②雙鏈DNA并不完全分離。高酸中和至中性變性的染色體DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物質(zhì)粒DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中純化RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì)堿裂解法提取質(zhì)粒SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以SDS處理細(xì)菌細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細(xì)胞中同時(shí)釋放出來(lái)。釋放出來(lái)的DNA遇到強(qiáng)堿性(NaOH)環(huán)境，就會(huì)變性。然后，用酸性乙酸鉀來(lái)中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速?gòu)?fù)性，而基因組DNA，由于分子巨大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細(xì)胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過(guò)這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細(xì)菌中提取出來(lái)。堿裂解法提取質(zhì)粒三、主要試劑及作用溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl組成(保護(hù)、緩沖)葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過(guò)程中的機(jī)械剪切作用,防止破壞質(zhì)粒(保護(hù)作用)EDTA

的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子,防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用（保護(hù)作用）Tris-HCl使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）8堿裂解法提取質(zhì)粒

溶液II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與NaOH組成(裂解、變性)SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性（裂解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用）NaOH（PH>12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用）9堿裂解法提取質(zhì)粒溶液III：HAc和KAc組成的高鹽溶液(復(fù)性，分離)HAc溶液能中和溶液Ⅱ的堿性，使染色體DNA變性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒DNA復(fù)性。KAc會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；溶液中的DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。堿裂解法提取質(zhì)粒四、試劑配制

溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0)。

1MTris-HCl(pH8.0）12.5ml，0.5MEDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。溶液Ⅱ：0.2NNaOH，1%SDS。2NNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時(shí)配置。

3.溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH4.8。5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存?zhèn)溆?。堿裂解法提取質(zhì)粒4.TE：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)。1MTris-HCl（pH8.0）1ml，0.5MEDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?.苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）6.乙醇（無(wú)水乙醇、70%乙醇）7.5×TBE：Tris堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O4.65g，加ddH2O至1000ml。15lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?.RNaseA（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free)RNaseA的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20℃。堿裂解法提取質(zhì)粒實(shí)

驗(yàn)步驟加1.5ml培養(yǎng)物于EP管，12000g×30S

除去上清，加入冰的200μl溶液I，劇烈振蕩EP管，室溫3min

加入300μl溶液II，快速顛倒數(shù)次，冰浴3min

加入400μl冰溶液III，溫和振蕩10s，冰浴5min，12000g×5min轉(zhuǎn)移上清到新EP管，加入等體積酚/氯仿(1:1)，溫和振蕩，冰浴3min，12000g×5min

上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管，加入2倍體積無(wú)水乙醇，顛倒混勻，-20℃冰箱中放置