消毒產(chǎn)品消毒效果檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)范

消毒產(chǎn)品消毒效果檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)范1消毒劑殺微生物試驗(yàn)1.1適用范圍主要適用于消毒劑鑒定和日常監(jiān)測(cè)，用來(lái)評(píng)價(jià)各種用途的消毒劑對(duì)微生物的殺滅效果。按此方法進(jìn)行的試驗(yàn)，只是對(duì)消毒劑的殺菌能力的重要方面進(jìn)行驗(yàn)證，側(cè)重反映消毒劑的實(shí)用劑量與殺菌能力。不能反映消毒劑的全面特性。1.2菌懸液與菌片的制備1.2.1適用范圍制備消毒劑殺菌試驗(yàn)用細(xì)菌懸液與菌片，以供消毒劑殺菌試驗(yàn)時(shí)使用。1.2.2試驗(yàn)器材（1）菌種:金黃色葡萄球菌ATCC6538、銅綠假單胞菌ATCC15442、大腸桿菌8099、枯草桿菌黑色變種ATCC9372、龜分枝桿菌膿腫亞種ATCC93326、白色葡萄球菌8032、白色念珠菌ATCC10231、黑曲霉菌ATCC16404。在上述規(guī)定的菌株基礎(chǔ)上，根據(jù)消毒劑特定用途或試驗(yàn)特殊需要，還可增選其他菌株。（2）有機(jī)干擾物：見附錄A。（3）磷酸鹽緩沖液：見附錄A。（4）無(wú)菌蒸餾水。（5）稀釋液：見附錄A。A。（7）革蘭染色液：見附錄A。（8）芽孢染色液：見附錄A。（9）恒溫水浴箱。（10）玻璃漏斗。（11）刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛細(xì)吸管。（12）數(shù)字可調(diào)移液器（10μl，20μl，100μl，200μl，1000μl）及配套用一次性塑料吸頭。（13）離心機(jī)。（14）電動(dòng)混合器（15）濁度計(jì)。1.2.3細(xì)菌懸液制備程序（1）細(xì)菌繁殖體懸液的制備1）取凍干菌種管，在無(wú)菌操作下打開，以毛細(xì)吸管加入適量營(yíng)養(yǎng)肉湯，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含5.0ml～10.0ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置37℃培養(yǎng)18h～24h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)18h～24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，于37℃培養(yǎng)18h～24h，即為第3代培養(yǎng)物。2）取菌種第3代～14代的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（18h～24h），用5.0ml吸管吸取3.0ml～5.0ml稀釋液加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用5.0ml吸管將洗液移至另一無(wú)菌試管中，用電動(dòng)混合器混合（振蕩）20s，或在手掌上振敲80次，以使細(xì)菌懸浮均勻。3）初步制成的菌懸液，先用細(xì)菌濃度比濁測(cè)定法粗測(cè)其含菌濃度，然后以稀釋液稀釋至所需使用的濃度。4）細(xì)菌繁殖體懸液應(yīng)保存在4℃冰箱內(nèi)備用。應(yīng)當(dāng)天使用不得過(guò)夜。5）懷疑有污染時(shí)，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗(yàn)等法進(jìn)行鑒定。（2）細(xì)菌芽孢懸液的制備1）取凍干菌種管，在無(wú)菌操作下打開，以毛細(xì)吸管吸加適量營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，輕柔吹吸養(yǎng)18h～24h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)18h～24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)18h～24h，即為第3代培養(yǎng)物。2）用10.0ml吸管吸取5.0ml～10.0ml第3代～5代的18h～24h營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，接種于羅氏瓶中營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，將其搖動(dòng)使菌液布滿營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的表面，再將多余肉湯培養(yǎng)物吸出，將羅氏瓶置于37℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)5d～7d。3）用接種環(huán)取菌樣少許涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在顯微鏡（油鏡）一定時(shí)間，直至達(dá)到上述芽孢形成率后再進(jìn)行以下處理。改良芽孢染色法：①用接種環(huán)取菌樣涂布于玻片上，待自然干燥。而后通過(guò)火焰加熱將菌固定于玻片上。②將涂片放入平皿內(nèi)，片上放兩層濾紙，滴加足量的5.0%孔雀綠水溶液。將平皿蓋好，放54℃～56℃條件下，加熱30min。取出，去濾紙，用自來(lái)水沖洗殘留孔雀綠溶液。③加0.5%沙黃水溶液，染1min。水洗，待干后鏡檢。芽孢呈綠色，菌體呈紅色。和第二批洗下的菌懸液集中于一含玻璃珠的無(wú)菌三角燒瓶中，振搖5min，打碎菌塊，使成均勻的芽孢懸液。5）必要時(shí)，將盛裝菌懸液的三角燒瓶置45℃水浴中24h，使菌自溶斷鏈，分散成單個(gè)芽孢。6）用無(wú)菌棉花或紗布過(guò)濾芽孢懸液，清除其中的瓊脂凝塊。7）將過(guò)濾后的芽孢懸液，置無(wú)菌離心管內(nèi)，以3000r/min速度離心30min。棄上清液，加蒸餾水吹吸使芽孢重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗，先后共3遍。8）將洗凈的芽孢懸浮于三角燒瓶?jī)?nèi)蒸餾水中，并加入適量小玻璃珠。9）將芽孢液放于80℃水浴中10min（或60℃，30min），以殺滅殘余的細(xì)菌繁殖體。待冷至室溫后，保存于4℃冰箱中備用。有效使用期為半年。10）芽孢懸液在使用時(shí)，應(yīng)先進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。11）懷疑有雜菌污染時(shí)，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗(yàn)等法進(jìn)行鑒定。1.2.4菌片的制備程序（1）消毒試驗(yàn)中使用的菌片是以菌液滴加于載體上制成。載體應(yīng)根據(jù)消毒對(duì)象選擇，常用的有金屬、玻璃、濾紙、線、棉布等。根據(jù)其特點(diǎn)選擇適宜材料載體作為代表。載體可以為方形，大小為10mm×10mm。當(dāng)以金屬片為載體時(shí)，因方形金屬載體在振敲時(shí)可將玻璃試管撞碎，故改用12mm直徑圓形金屬片（厚0.5mm）。（2）所用載體（除濾紙片外）于染菌前，應(yīng)進(jìn)行脫脂處理。脫脂方法如下：①將載體放pH呈中性；⑤晾干、熨平備用。（3）布片用白平紋棉布制作。在剪開前，先將脫脂的布?jí)K按載體規(guī)定的大小，抽去邊緣一周的經(jīng)緯紗各一根，再按抽紗痕剪開。此法制成的載體大小一致，且無(wú)毛邊。金屬片以不銹鋼制作，紙片以新華濾紙制作。（4）載體經(jīng)壓力蒸汽滅菌后，使用滴染法染菌。培養(yǎng)物，細(xì)菌芽孢可使用4℃冰箱貯存液。含菌量約為1×108cfu/ml～5×108cfu/ml，可使用濁度計(jì)調(diào)整菌液濃度。滴染法染菌時(shí)，將經(jīng)滅菌的載體片平鋪于無(wú)菌平皿內(nèi)，逐片滴加菌液。菌液滴加量每片為10μl。用10μl移液器接滅菌塑料吸頭滴染菌液，并用接種環(huán)涂勻整個(gè)載體表面。滴染菌液后，染菌載體可置37℃溫箱內(nèi)干燥（約20min～30min），或置室溫下自然陰干后再使用。1.2.5注意事項(xiàng)（1）用濁度計(jì)測(cè)定的菌懸液濃度，只用于在滴染菌片時(shí)對(duì)菌懸液稀釋度的估計(jì)。作為菌懸液含菌濃度或菌片染菌量的正式報(bào)告（如殺菌試驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照組菌懸液或菌片所含菌量），必須以活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)的實(shí)測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，不得使用根據(jù)比濁法判定的估計(jì)值。（2）滴染時(shí)，菌液滴加量不宜過(guò)多，避免流散影響染菌的準(zhǔn)確性。（3）細(xì)菌繁殖體在烤干過(guò)程中，可引起部分死亡，如銅綠假單胞菌在37℃干燥過(guò)程中，滴度最高可下降1個(gè)對(duì)數(shù)值。此時(shí)，應(yīng)提高初始菌濃度，以便達(dá)到所需的菌量。（4）配制菌懸液和制備菌片時(shí)，嚴(yán)格按無(wú)菌要求操作，以防污染雜菌，影響隨后殺菌試驗(yàn)的結(jié)果。（5）用帶橡皮塞的容器保存菌液時(shí)，應(yīng)將其預(yù)先煮沸10min進(jìn)行脫硫處理。（6）制得的菌懸液和菌片，用畢應(yīng)隨時(shí)放入冰箱內(nèi)，盡量減少在室溫下放置時(shí)間，以減少細(xì)菌的自然死亡。1.3活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)技術(shù)1.3.1適用范圍測(cè)定細(xì)菌懸液、菌片、采樣液等樣本中含有活菌的數(shù)量。1.3.2試驗(yàn)器材（1）刻度吸管（1.0ml、5.0ml）。（2）稀釋液：見附錄A。（3）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A。（4）電動(dòng)混合器1.3.3操作程序本規(guī)范要求在殺菌試驗(yàn)中的活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)統(tǒng)一使用傾注法。其操作程序如下。（1）對(duì)菌懸液可直接進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。對(duì)菌片、采樣棉拭與小型固體樣本等，應(yīng)將其上的細(xì)菌洗下成為菌懸液后進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。洗菌時(shí)，一般以稀釋液為洗液。具體方法如下:取含每管一份樣本。而后，用電動(dòng)混合器混合20s（或在手掌上用力振敲80次），將菌洗下形成菌懸液。以上操作應(yīng)嚴(yán)格按無(wú)菌要求進(jìn)行。（2）將試管按需要數(shù)量分組排列于試管架上，每管加入4.5ml稀釋液。各組由左向右，逐管標(biāo)上10-1、10-2、10-3......等。（3）將菌懸液樣本在用電動(dòng)混合器混合20s（或在手掌上用力振敲80次），隨即吸取0.5ml加至10-1管內(nèi)。（5）選擇適宜稀釋度試管（以預(yù)計(jì)生長(zhǎng)菌落數(shù)每平板為15cfu～300cfu者為宜），吸取其中混合均勻的懸液1.0ml加于無(wú)菌平皿內(nèi)。每一稀釋度接種3個(gè)平皿。一般需接種2個(gè)～3個(gè)不同稀釋度。平皿加樣前，應(yīng)先按組編號(hào)，以免弄混。（6）將冷至40℃～45℃的熔化營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，傾注于已加入樣液的平皿中，每平皿15ml～20ml。（7）將平皿蓋好，即刻輕輕搖動(dòng)混勻，平放于臺(tái)上。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底向上，置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。（8）每日觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間（細(xì)菌繁殖體為48h，白色念珠菌與細(xì)菌芽孢為72h），計(jì)數(shù)最終結(jié)果的菌落數(shù)。（9）對(duì)菌片和采樣棉拭洗液的活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，先按各試驗(yàn)要求處理（如去除殘留消毒劑等），而后取其最終樣液按上法進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（10）計(jì)數(shù)菌落時(shí)，一般以肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查。以菌落數(shù)在15cfu～300cfu的平板為準(zhǔn)，每個(gè)稀釋度3個(gè)平板生長(zhǎng)菌落數(shù)全合乎上述標(biāo)準(zhǔn)，則以該3個(gè)平板的菌落平均值作為結(jié)果；若有2個(gè)符合上述標(biāo)準(zhǔn)，則以該合格的兩個(gè)平板菌落的平均值為結(jié)果。但對(duì)黑曲霉菌活菌計(jì)數(shù)及殺滅試驗(yàn)時(shí)，平板菌落數(shù)應(yīng)在15cfu～100cfu之間。對(duì)估計(jì)菌量極少的樣本（如消毒處理后樣本），在培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)可不作稀釋，即使平板菌落數(shù)未達(dá)15時(shí)，亦可用其計(jì)算最終結(jié)果。將求得的平均菌落值，再乘以稀釋倍數(shù)，即得每毫升原樣液中的菌量。菌量單位為cfu。1.3.4活菌計(jì)數(shù)中技術(shù)操作誤差的測(cè)定試驗(yàn)者在活菌計(jì)數(shù)中因技術(shù)操作而引起的菌落數(shù)誤差率（平板間、稀釋度間）不宜超過(guò)10%。對(duì)誤差率的自檢，可按以下公式計(jì)算。（1）平板間誤差率計(jì)算公式：（2）稀釋度間誤差率計(jì)算公式：1.3.5注意事項(xiàng)（1）嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止污染。（2）認(rèn)真檢查試驗(yàn)器材有無(wú)破損（要特別注意試管底的裂痕和破洞），以防丟失樣本和污染環(huán)境。（3）注意菌液的均勻分散。（4）稀釋或取液時(shí)要準(zhǔn)確，盡量減少吸管使用中產(chǎn)生的誤差。（5）每吸取一個(gè)稀釋度樣液，必須更換一支吸管，以減少誤差。（6）樣液接種于平皿后應(yīng)盡快傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，避免樣液干燥于平皿上，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。（7）傾注時(shí)瓊脂培養(yǎng)基溫度不得超過(guò)45℃，以防損傷細(xì)菌或真菌。傾注和搖動(dòng)時(shí)，動(dòng)作應(yīng)盡量平穩(wěn)，以利細(xì)菌分散均勻，便于計(jì)數(shù)菌落。勿使培養(yǎng)基外溢，以免影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和造成環(huán)境的污染。（8）為提高試驗(yàn)成功率，最好先用濁度計(jì)對(duì)原菌液含菌量做出估計(jì)，盡可能在首次試驗(yàn)時(shí)所取的有限稀釋范圍內(nèi)（2個(gè)～3個(gè)稀釋度）即有長(zhǎng)菌在15cfu～300cfu之間的平板。（9）結(jié)果計(jì)算時(shí)，必須弄清稀釋倍數(shù)，以免計(jì)算錯(cuò)誤。1.4殘留消毒劑的去除方法1.4.1目的在化學(xué)消毒試驗(yàn)中，達(dá)到規(guī)定消毒時(shí)間終點(diǎn)時(shí)，要求立即終止殘留消毒劑的繼續(xù)作用，以便準(zhǔn)確檢測(cè)出消毒體系中殘留存活的微生物及其數(shù)量。因?yàn)橄倔w系中殘留的消毒劑，可能對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖具有一定抑制作用，從而可導(dǎo)致對(duì)殺菌效果偏高的錯(cuò)誤判斷，甚至產(chǎn)生假陰性結(jié)果。殘留消毒劑的去除（下簡(jiǎn)稱除藥），可排除殘留消毒劑對(duì)微生物的抑制，從而使試驗(yàn)獲得正確結(jié)果。1.4.2除藥的原則（1）可有效去除殘留的消毒劑。（2）對(duì)微生物無(wú)害，不減少微生物應(yīng)有的回收量。（3）不破壞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成份，不影響其透明度。（4）必須按規(guī)定方法進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，并認(rèn)為合格者方可在相應(yīng)的消毒試驗(yàn)中使用。1.4.3除藥的方法（1）化學(xué)中和法：又稱中和劑法，是指在消毒劑與微生物作用到達(dá)規(guī)定時(shí)間的終點(diǎn)時(shí)，取樣加于適宜種類和濃度的中和劑中，將殘留消毒劑迅速中和，使其不再持續(xù)抑制或殺滅微生物的方法。本法同時(shí)含有稀釋作用效果（至少1:1稀釋，常用1:10稀釋），是最為普遍使用的方法。對(duì)常用消毒劑，雖有一些中和劑介紹，但在實(shí)際應(yīng)用中由于情況多變，效果不一定都理想。所以，在消毒試驗(yàn)前仍應(yīng)將擬用中和劑按試驗(yàn)具體情況，經(jīng)鑒定合格后再使用。操作要點(diǎn)：①對(duì)接觸消毒劑的微生物樣本，在達(dá)到規(guī)定作用時(shí)間，即刻取樣移入鑒定合格的中和劑溶液中；②所用中和劑的濃度與容量應(yīng)與鑒定試驗(yàn)結(jié)果規(guī)定的相同；③即刻混勻，并按規(guī)定時(shí)間吸取樣液進(jìn)行隨后的培養(yǎng)檢測(cè)；④在將樣本接種培養(yǎng)基以前的操作，應(yīng)按規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，以免微生物與中和劑或中和產(chǎn)物接觸過(guò)久。（2）過(guò)濾沖洗法將經(jīng)消毒劑作用過(guò)的微生物樣本，立即加入適量稀釋液中混勻（通過(guò)適量稀釋，可減輕消毒劑的持續(xù)作用），并傾入裝有微孔濾膜的濾器內(nèi)，接真空泵抽吸過(guò)濾（或加壓過(guò)濾）后，再加適量稀釋液沖洗，同時(shí)過(guò)濾，可去除殘留的消毒劑。多用于難以找到適宜中和劑的消毒劑試驗(yàn)中，如以植物提取物制備的消毒劑。本除藥方法應(yīng)按擬進(jìn)行試驗(yàn)具體情況，經(jīng)鑒定合格后再使用。操作要點(diǎn)：①準(zhǔn)備好裝有相應(yīng)孔徑微孔濾膜的濾器；②濾膜及濾器需先經(jīng)滅菌處理；③初次過(guò)濾后，應(yīng)使用一定量對(duì)微生物無(wú)害的稀釋液進(jìn)行沖洗，沖洗次數(shù)一般以洗凈消毒劑為準(zhǔn)；④最后一次沖洗、濾凈后，將微孔濾膜以無(wú)菌操作法取出，進(jìn)行隨后的培養(yǎng)檢測(cè)。（3）稀釋法將經(jīng)消毒劑作用過(guò)的微生物樣本，用稀釋液稀釋，降低殘留消毒劑濃度，以消除對(duì)微生物的抑制作用。但若稀釋過(guò)多，微生物濃度下降，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。本法可單獨(dú)使用，但更常見的是與其它方法同時(shí)使用。單獨(dú)使用時(shí)，一般多用于濃度系數(shù)較高的消毒劑（如醇類消毒劑）。本法應(yīng)按擬進(jìn)行試驗(yàn)具體情況，經(jīng)鑒定合格后再使用。操作要點(diǎn)：①對(duì)接觸消毒劑的微生物樣本，在達(dá)到規(guī)定作用時(shí)間后，即時(shí)以對(duì)微生物無(wú)害的稀釋液稀釋，稀釋比例隨試驗(yàn)需要決定；②電動(dòng)混合或敲打振蕩，使之混勻；③吸取稀釋樣液進(jìn)行隨后培養(yǎng)檢測(cè)。1.4.4注意事項(xiàng)（1）處理時(shí)應(yīng)嚴(yán)守?zé)o菌操作要求，所有試液須無(wú)菌，接觸樣本和試液的器材（如吸管、平皿、試管、濾材等）亦均須經(jīng)滅菌，以免污染樣本，影響試驗(yàn)結(jié)果。（2）每次吸液，均須更換一支無(wú)菌吸管，以防交叉污染。此點(diǎn)由于操作繁瑣，器材需求量大，往往不能認(rèn)真執(zhí)行，應(yīng)加以注意。（3）為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，所用吸管的容量應(yīng)盡量與擬吸取的液體量相近，不要用大吸管吸取少量液體；試驗(yàn)樣本的混勻操作，必須認(rèn)真進(jìn)行；盡量減少中和劑或中和產(chǎn)物與試驗(yàn)微生物的接觸時(shí)間。（4）所用方法適宜與否，和消毒劑性質(zhì)、復(fù)方中的附加成份、試驗(yàn)微生物種類、消毒試驗(yàn)種類等等均有關(guān)系，試驗(yàn)條件稍有改變就可能影響除藥效果。故每進(jìn)行一種消毒試驗(yàn)（包括消毒劑或微生物的更換），均需按規(guī)定對(duì)所選方法進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，合格者方可用于正式試驗(yàn)。此步驟絕不可省略，否則極有可能導(dǎo)致試驗(yàn)產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。1.5中和劑鑒定試驗(yàn)1.5.1目的確定所選中和劑是否適用于擬進(jìn)行的細(xì)菌和真菌殺滅試驗(yàn)。1.5.2試驗(yàn)器材（1）試驗(yàn)菌菌懸液和菌片（見1.2）。（2）刻度吸管（1.0ml、5.0ml）。（3）小平皿（4cm～6cm直徑）。（4）恒溫水浴箱。（5）稀釋液：見附錄A。（6）胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）：見附錄A。（7）電動(dòng)混合器1.5.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則（1）通過(guò)所設(shè)各組試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，應(yīng)可確定所用中和劑是否對(duì)測(cè)試消毒劑有良好的中和作用，對(duì)試驗(yàn)用細(xì)菌以及其恢復(fù)期培養(yǎng)是否有害或不良影響。（2）在確定用何種中和劑進(jìn)行鑒定試驗(yàn)有困難時(shí)，可對(duì)多個(gè)中和劑進(jìn)行初選以確定（見本款文后【附】）。（3）試驗(yàn)中所用消毒劑的濃度應(yīng)以殺菌試驗(yàn)中使用的最高濃度為準(zhǔn)。濃度過(guò)低，則不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部中和。（4）鑒定試驗(yàn)中，消毒后去除殘留消毒劑組（第2組）無(wú)菌生長(zhǎng)，不能表明中和后受到消毒劑作用后的細(xì)菌是否能恢復(fù)生長(zhǎng)。細(xì)菌是否復(fù)蘇。此時(shí)可適當(dāng)縮短作用時(shí)間重新進(jìn)行試驗(yàn)，但作用時(shí)間最短不得少于30s，否則難以控制試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。若縮短作用時(shí)間后仍無(wú)菌生長(zhǎng)，在排除其他原因的基礎(chǔ)上，可適當(dāng)下調(diào)殺菌試驗(yàn)中消毒劑濃度，再次進(jìn)行中和劑鑒定試驗(yàn)。（5）同一消毒劑擬對(duì)多種微生物進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)按微生物種類分別進(jìn)行鑒定試驗(yàn)。對(duì)細(xì)菌繁殖體，在大腸桿菌（8099）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、銅綠假單胞菌（ATCC15442）中任選其一進(jìn)行試驗(yàn)即可；對(duì)細(xì)菌芽孢，以枯草桿菌黑色變種（ATCC9372）芽孢進(jìn)行。當(dāng)用其他特定微生物進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時(shí)，均應(yīng)以該特定微生物進(jìn)行中和劑的鑒定試驗(yàn)。（6）鑒定時(shí)根據(jù)所用殺菌試驗(yàn)方法，使用相應(yīng)的懸液或載體定量試驗(yàn)。【附】中和劑初選試驗(yàn)中和劑鑒定試驗(yàn)前，若難確定擬檢測(cè)的中和劑，可通過(guò)本試驗(yàn)初選，而后以選中的中和劑進(jìn)行正式的鑒定試驗(yàn)。初選操作程序如下：（1）將0.5ml試驗(yàn)菌懸液（含菌量為1×103cfu/ml～3×103cfu/ml）加入含4.5ml中和劑試管中，混勻，作用30min后，取1.0ml接種平皿，用TSA傾注法培養(yǎng)。（2）將0.5ml試驗(yàn)菌懸液（含菌量為1×103cfu/ml～3×103cfu/ml）加入含4.5ml中和產(chǎn)物試管中，混勻，作用30min后，取1.0ml接種平皿，用TSA傾注法培養(yǎng)。（3）試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組以0.5ml菌懸液加入含4.5ml稀釋液試管中，混勻，作用30min后，取1.0ml接種平皿，用TSA傾注法培養(yǎng)。當(dāng)3組平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù)接近，如果以陽(yáng)性對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)（X），前兩組長(zhǎng)菌數(shù)為（X±50%X）以內(nèi)，可進(jìn)行正式的鑒定試驗(yàn)。1.5.4試驗(yàn)分組第1組消毒劑+菌懸液→培養(yǎng)觀察消毒劑對(duì)試驗(yàn)菌有無(wú)殺滅或抑制能力。第2組（消毒劑+菌懸液）+中和劑→培養(yǎng)觀察殘留消毒劑被中和后受到清毒劑作用后的試驗(yàn)菌是否能恢復(fù)生長(zhǎng)。第3組中和劑+菌懸液→培養(yǎng)觀察中和劑是否抑菌。第4組（消毒劑+中和劑）+菌液→培養(yǎng)觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和的殘留消毒劑對(duì)試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)繁殖是否有影響。第5組稀釋液+菌懸液→培養(yǎng)作為菌數(shù)對(duì)照。第6組稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基→培養(yǎng)作為陰性對(duì)照。1.5.5中和劑懸液定量鑒定試驗(yàn)操作程序根據(jù)試驗(yàn)分組，準(zhǔn)備足量試管和平皿，依次進(jìn)行編號(hào)。將消毒劑按所需濃度配制好后，置20℃±1℃水浴中待用。按1.2制備試驗(yàn)菌懸液。取2.0ml試驗(yàn)菌懸液于試管中，加入2.0ml有機(jī)干擾物質(zhì)，制成含有機(jī)干擾物質(zhì)的菌懸液，置20℃±1℃水浴中備用。（1）第1組。吸取1.0ml含有機(jī)干擾物質(zhì)的試驗(yàn)菌懸液于試管內(nèi)，置20℃±1℃水浴中5min后，再吸加4.0ml消毒劑于試管內(nèi)，混勻。作用至預(yù)定時(shí)間，吸此樣液0.5ml加于含有4.5ml稀釋液的試管中，混勻。吸取該最終樣液1.0ml，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（2）第2組。吸取1.0ml含有機(jī)干擾物質(zhì)試驗(yàn)菌懸液于試管內(nèi)，置20℃±1℃水浴中5min后，再吸加4.0ml消毒劑于試管內(nèi)，混勻。作用至預(yù)定時(shí)間，吸此樣液0.5ml加于含4.5ml中和劑溶液管中，混勻，作用10min。吸取該最終樣液1.0ml，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。如平板生長(zhǎng)菌落數(shù)均超過(guò)300個(gè)，應(yīng)以稀釋液對(duì)上述最終樣液作適宜稀釋后，再次進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（3）第3組。吸取0.1ml含有機(jī)干擾物質(zhì)的試驗(yàn)菌懸液于試管內(nèi)，置20℃±1℃水浴中5min后，加入0.4ml硬水，混勻。加入4.5ml中和劑，作用10min。用中和劑做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取1.0ml，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（4）第4組。吸取0.1ml含有機(jī)干擾物質(zhì)的試驗(yàn)菌懸液于試管內(nèi)，置20℃±1℃水浴中5min后，吸加4.9ml中和產(chǎn)物溶液（以0.4ml消毒劑加4.5ml中和劑，作用10min配制而成）于試管內(nèi)，混勻。作用10min，吸取該最終樣液0.5ml，用中和產(chǎn)物溶液做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取1.0ml，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（5）第5組。吸取0.1ml含有機(jī)干擾物質(zhì)的試驗(yàn)菌懸液于試管內(nèi)，置20℃±1℃水浴中5min后，吸加0.4ml硬水于試管內(nèi)，混勻。加入4.5ml稀釋液，作用10min，用稀釋液做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取1.0ml，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（6）第6組。分別吸取稀釋液、中和劑和硬水各1.0ml于同一無(wú)菌平皿內(nèi)，倒入上述試驗(yàn)同批次的培養(yǎng)基25ml，培養(yǎng)觀察。如出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，可能提示試驗(yàn)材料或操作過(guò)程中有污染。應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。1.5.6中和劑載體定量鑒定試驗(yàn)操作程序根據(jù)試驗(yàn)分組，準(zhǔn)備足量試管和平皿，依次進(jìn)行編號(hào)。各組分別用適宜大小容量的無(wú)菌定量吸管按以下程序吸取或添加試劑和試驗(yàn)樣本。（1）第1組。吸取消毒劑5.0ml于無(wú)菌小平皿內(nèi)，將其置20℃±1℃水浴中5min后，用無(wú)菌鑷子夾入一菌片，并使浸透于消毒液中。待作用至試驗(yàn)預(yù)定的時(shí)間，立即用無(wú)菌鑷子取出菌片移入含5.0ml稀釋液試管中，作用10min。用電動(dòng)混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次，吸取該最終樣液1.0ml，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（2）第2組。吸取消毒劑5.0ml于無(wú)菌小平皿內(nèi)，將其置20℃±1℃水浴中5min后，用無(wú)菌鑷子夾入一菌片，并使浸透于消毒液中，待作用至試驗(yàn)預(yù)定時(shí)間，立即用無(wú)菌鑷子取出菌片移入含5.0ml中和劑試管中，用電動(dòng)混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次。作用10min，吸取該最終樣液1.0ml，分別接種于各平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。如平板生長(zhǎng)菌落數(shù)均超過(guò)300個(gè)，應(yīng)重新吸取該最終樣液0.5ml，用稀釋液做適當(dāng)稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取1.0ml，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（3）第3組。吸取中和劑5.0ml于無(wú)菌小平皿中，將其置20℃±1℃水浴中5min后，用無(wú)菌鑷子夾入1菌片，并使浸透于中和劑內(nèi)，作用10min。立即用無(wú)菌鑷子取出菌片移入含5.0ml中和劑試管中，用電動(dòng)混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次，混勻。吸取該最終樣液1.0ml，用中和劑做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取1.0ml，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（4）第4組。吸取中和產(chǎn)物溶液（以一片浸有消毒劑的載體置5.0ml中和劑內(nèi)，作用10min）5.0ml于無(wú)菌小平皿內(nèi)，將其置20℃±1℃水浴中5min后，用無(wú)菌鑷子夾入1菌片，并使浸透于中和產(chǎn)物溶液中。作用10min，用無(wú)菌鑷子取出菌片，移入含5.0ml中和產(chǎn)物溶液的試管中，用電動(dòng)混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次，混勻。吸取該最終樣液0.5ml，用中和產(chǎn)物溶液做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取1.0ml，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（5）第5組。吸取稀釋液5.0ml于無(wú)菌小平皿內(nèi)，將其置20℃±1℃水浴中5min后，用無(wú)菌鑷子夾入1菌片，并使浸透于稀釋液中。作用10min，立即用無(wú)菌鑷子取出菌片移入含5.0ml稀釋液的試管中，用電動(dòng)混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次，混勻。吸取該最終樣液0.5ml，用稀釋液做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取1.0ml，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（6）第6組。分別吸取稀釋液與中和劑各1.0ml于同一無(wú)菌小平皿內(nèi)，倒入上述試驗(yàn)同批次的培養(yǎng)基15ml～20ml，培養(yǎng)觀察。如出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，提示試驗(yàn)材料或操作過(guò)程中可能有污染。應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。1.5.7評(píng)價(jià)規(guī)定試驗(yàn)結(jié)果符合以下全部條件，所測(cè)中和劑可判為合格:（1）第1組無(wú)試驗(yàn)菌，或僅有極少數(shù)試驗(yàn)菌菌落生長(zhǎng)。（2）第2組有較第1組為多，但較第3、4、5（組）為少的試驗(yàn)菌菌落生長(zhǎng)，并符合表2-1要求者。表2-1中和劑鑒定試驗(yàn)合格標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)第1組與第2組菌落數(shù)的要求第1組平板平均菌落數(shù)第2組平板平均菌落數(shù)0>5X（1～10）>（X+5）Y（>10）>（Y+0.5Y）注：對(duì)抑菌作用不明顯消毒劑（如乙醇）所用中和劑的鑒定試驗(yàn)中，當(dāng)?shù)?組與第2組菌落數(shù)相近，難以達(dá)到本表要求時(shí)，可根據(jù)具體情況另行作出判斷和評(píng)價(jià)。間，載體試驗(yàn)在5×105cfu/片～5×106cfu/片之間。其組間菌落數(shù)誤差率應(yīng)不超過(guò)15%。第3、4、5組間菌落數(shù)誤差率計(jì)算公式其計(jì)算公式如下。（4）第6組無(wú)菌生長(zhǎng)。否則，說(shuō)明試劑有污染，應(yīng)更換無(wú)污染的試劑重新進(jìn)行試驗(yàn)。（5）連續(xù)3次試驗(yàn)取得合格評(píng)價(jià)。1.5.8注意事項(xiàng)（1）試驗(yàn)所分各組均有其特定意義，不得任意刪減。（2）嚴(yán)守?zé)o菌操作，保持試液和器材的無(wú)菌，注意更換吸管，以防止沾染影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。（3）在計(jì)算微生物濃度時(shí)，須考慮其稀釋倍數(shù)。（4）試驗(yàn)組序應(yīng)按本規(guī)范所列排列。1.6物理法去除殘留消毒劑試驗(yàn)1.6.1目的通過(guò)本鑒定試驗(yàn)，確定常用的物理去除法是否可去除消毒體系中殘留的消毒劑，使消毒劑鑒定試驗(yàn)顯示出真正的殺菌效果。1.6.2試驗(yàn)器材（1）過(guò)濾沖洗法需用經(jīng)過(guò)滅菌處理的濾器、微孔濾膜、真空泵（或抽濾泵）。（2）離心沉淀法需用離心機(jī)與離心管。（3）吸附柱、分子篩柱（主要供病毒滅活試驗(yàn)用）。（4）無(wú)菌稀釋液、沖洗液。要求不應(yīng)影響除藥材料（如濾膜、吸附柱等）的性質(zhì)，對(duì)微生物無(wú)傷害作用。常用的有：水、緩沖液（如PBS）、稀釋液、含0.1%～0.5%吐溫80的PBS、中和劑（可中和部分消毒成分）。（5）其他器材隨所用試驗(yàn)微生物而定。1.6.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則（1）通過(guò)所設(shè)各組試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，應(yīng)可確定所選方法是否對(duì)測(cè)試消毒劑有良好的去除作用，對(duì)試驗(yàn)用微生物以及其恢復(fù)期培養(yǎng)是否有害或不良影響。（2）試驗(yàn)中所用消毒劑的濃度應(yīng)以殺菌試驗(yàn)中使用的最高濃度為準(zhǔn)。濃度過(guò)低不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部去除。（3）鑒定試驗(yàn)中，消毒后去除殘留消毒劑組無(wú)微生物生長(zhǎng)，不能表明去除處理后細(xì)菌是否復(fù)蘇。此時(shí)可增加處理時(shí)間或次數(shù)，亦可適當(dāng)縮短作用時(shí)間再試。作用時(shí)間最短不得少于30s，否則難以控制試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。（4）同一消毒劑擬對(duì)多種微生物進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時(shí)，所用物理去除消毒劑法應(yīng)按微生物種類分別進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，不得互相取代。對(duì)細(xì)菌繁殖體的試驗(yàn)，可在大腸桿菌（8099）、銅綠假單胞菌（ATCC15442）或金黃色葡萄球菌（ATCC6538）中任選其一進(jìn)行試驗(yàn)即可；對(duì)細(xì)菌芽孢，以枯草桿菌黑色變種（ATCC9372）芽孢進(jìn)行。當(dāng)用其他特定微生物（如龜分枝桿菌膿腫亞種）進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時(shí)，均應(yīng)以該特定微生物再次進(jìn)行去除消毒劑方法的鑒定試驗(yàn)。（5）鑒定中應(yīng)根據(jù)正式殺滅試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，選擇使用懸液定量試驗(yàn)，還是載體定量試驗(yàn)。通常，懸液鑒定試驗(yàn)結(jié)果可用于載體試驗(yàn)。1.6.4物理去除方法的鑒定（1）分組方法如下：1）消毒劑+菌懸液→培養(yǎng)觀察消毒劑對(duì)試驗(yàn)菌有無(wú)殺滅或抑制作用。2）（菌懸液+消毒劑）+過(guò)濾沖洗法處理→培養(yǎng)觀察所用去除消毒劑處理后，受到消毒劑作用后的試驗(yàn)菌是否能恢復(fù)生長(zhǎng)。3）（菌懸液+水）＋過(guò)濾沖洗法處理→培養(yǎng)觀察去除消毒劑處理是否影響試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)數(shù)量。4）菌懸液→培養(yǎng)作為菌懸液陽(yáng)性對(duì)照值。（2）操作程序如下：1）第1組。吸取0.5ml試驗(yàn)菌懸液于試管內(nèi)，加入0.5ml有機(jī)干擾物質(zhì)，混勻后，置20℃±1℃水浴中5min后，再吸加4.0ml消毒劑（應(yīng)先置20℃±1℃中水?。┯谠嚬軆?nèi)，混勻，作用至試驗(yàn)預(yù)定時(shí)間。吸取該最終樣液0.5ml，加于含4.5ml稀釋液試管中，混勻。吸取最終樣液1.0ml接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。2）第2組。吸取0.5ml試驗(yàn)菌懸液于試管內(nèi)，加入0.5ml有機(jī)干擾物質(zhì)，混勻后，置進(jìn)行去除消毒劑處理，并取最終樣液1.0ml接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)（如為濾膜法，可直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面）。如平皿生長(zhǎng)菌落數(shù)均超過(guò)300個(gè)，應(yīng)再吸取該最終樣液0.5ml，用PBS做適當(dāng)稀釋，選擇適宜稀釋度懸液，吸取1.0ml，分別接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。3）第3組。吸取0.5ml試驗(yàn)菌懸液于試管內(nèi)，加入0.5ml有機(jī)干擾物質(zhì)，混勻后，置最終樣液0.5ml用稀釋液做10倍系列稀釋，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度懸液，各取1.0ml，分別接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)（如為濾膜法，可先進(jìn)行10倍系列稀釋，再經(jīng)過(guò)濾沖洗法處理，然后直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面）。4）第4作任何去除處理，進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，作為陽(yáng)性對(duì)照值。（3）評(píng)價(jià)規(guī)定試驗(yàn)結(jié)果符合以下全部條件，所測(cè)中和劑可判為合格:1）第1組無(wú)試驗(yàn)菌，或僅有極少數(shù)生長(zhǎng)。2）第2組有遠(yuǎn)較第1組為多，但較第3、4（組）為少的試驗(yàn)菌生長(zhǎng)。在第1組無(wú)菌生長(zhǎng)時(shí)，第2組平均每個(gè)平板（或?yàn)V膜）上生長(zhǎng)菌落不少于5個(gè)。3）第3、4（組）測(cè)定的結(jié)果，微生物數(shù)量應(yīng)在1×107cfu/ml～5×107cfu/ml之間，其組間差不得超過(guò)兩組回收菌數(shù)平均值的50%。組間差的計(jì)算可按下式進(jìn)行:4）連續(xù)3次試驗(yàn)取得合格評(píng)價(jià)。5）本規(guī)范推薦使用過(guò)濾沖洗法。1.6.5注意事項(xiàng)見1.5.8。1.7細(xì)菌定量殺滅試驗(yàn)1.7.1目的在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)定消毒劑殺滅懸液中或載體上細(xì)菌繁殖體和細(xì)菌芽孢所需劑量，以驗(yàn)證實(shí)用消毒劑量。1.7.2試驗(yàn)器材（1）按1.2所示方法制備的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和枯草桿菌黑色變種芽孢懸液或菌片。此外，根據(jù)消毒劑特定用途或試驗(yàn)特殊需要，準(zhǔn)備其他菌種的懸液或菌片。（2）消毒劑溶液除有特殊規(guī)定者外，應(yīng)使用無(wú)菌硬水配制。消毒劑溶液濃度應(yīng)以所含有效成份為準(zhǔn)。例如，含氯消毒劑以所含有效氯濃度為準(zhǔn)，碘伏以所含有效碘為準(zhǔn)，過(guò)氧乙酸以所含過(guò)氧乙酸量為準(zhǔn)，復(fù)方消毒劑濃度以主要?dú)⒕行С煞趾繛闇?zhǔn)。各組消毒劑溶液有效成份濃度的計(jì)算，應(yīng)以試驗(yàn)菌與消毒劑的混合液中有效成份的最終濃度為準(zhǔn)。（3）去除殘留消毒劑的中和劑或設(shè)備（經(jīng)鑒定試驗(yàn)證實(shí)合格的中和劑或有關(guān)器材）。（4）消毒劑稀釋用硬水：見附錄A。（5）有機(jī)干擾物質(zhì)。懸液試驗(yàn)用3%BSA溶液，載體試驗(yàn)直接用TSB(見附錄A)。（6）TSA培養(yǎng)基：見附錄A。（7）含中和劑的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（中和劑TSB），中和劑經(jīng)鑒定合格。（8）刻度吸管（1.0ml、5.0ml）。（9）恒溫水浴箱。（10）噴霧器（用于噴霧消毒試驗(yàn)）。（11）電動(dòng)混合器。（12）秒表。1.7.3試驗(yàn)分組試驗(yàn)中應(yīng)分以下各組：（1）試驗(yàn)組。按測(cè)試目的有兩種選擇。第一種適用于消毒產(chǎn)品鑒定。根據(jù)本規(guī)范中表1-1和使用說(shuō)明書，選定試驗(yàn)菌和一個(gè)消毒劑濃度（即產(chǎn)品使用說(shuō)明書中指定的最低濃度）以及3個(gè)作用時(shí)間（說(shuō)明書指定最短作用時(shí)間，指定最短作用時(shí)間的0.5倍，指定最低作用時(shí)間的1.5倍。如說(shuō)明書指定最短作用時(shí)間為20min，則應(yīng)進(jìn)行10min、20min、30min三個(gè)時(shí)間）進(jìn)行試驗(yàn)。第二種適用于消毒產(chǎn)品監(jiān)督機(jī)構(gòu)日常監(jiān)測(cè)。根據(jù)所試菌種和消毒劑對(duì)該菌的殺滅能力，選定一株抗力較強(qiáng)的菌和一個(gè)消毒劑濃度（即產(chǎn)品使用說(shuō)明書中指定的最低濃度）以及一個(gè)作用時(shí)間（說(shuō)明書指定最短作用時(shí)間）進(jìn)行試驗(yàn)。（2）陽(yáng)性對(duì)照組。根據(jù)各種試驗(yàn)的規(guī)定，用稀釋液代替消毒劑溶液，按上述同樣的步驟進(jìn)行試驗(yàn)。所得結(jié)果代表菌液原有濃度，以其作為計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)的初始濃度。1.7.4懸液定量殺菌試驗(yàn)操作程序（1）首先按產(chǎn)品說(shuō)明書要求配制消毒液。無(wú)特殊說(shuō)明者，一律使用無(wú)菌硬水配制，配制的濃度為待測(cè)濃度的1.25倍（例如要評(píng)價(jià)的消毒液濃度為200mg/L，則應(yīng)配制250mg/L），置20℃±1℃水浴備用。（2）按照1.2配制實(shí)驗(yàn)用菌懸液，濃度為1×108cfu/ml～5×108cfu/ml。（3）取消毒試驗(yàn)用無(wú)菌大試管，先加入0.5ml試驗(yàn)用菌懸液，再加入0.5ml有機(jī)干擾物質(zhì)，混勻，置20℃±1℃水浴中5min后，用無(wú)菌吸管吸取上述濃度消毒液4.0ml注入其中，迅速混勻并立即記時(shí)。（4）于4.5ml經(jīng)滅菌的中和劑中，混勻。（5）菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法測(cè)定存活菌數(shù)，每管樣液接種2個(gè)平皿即可。如平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)較多時(shí)，可進(jìn)行系列10倍稀釋后，再進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（6）同時(shí)用稀釋液代替消毒液，進(jìn)行平行試驗(yàn)，作為陽(yáng)性對(duì)照。（7）所有試驗(yàn)樣本均在37℃溫箱中培養(yǎng)，對(duì)細(xì)菌繁殖體培養(yǎng)48h觀察最終結(jié)果；對(duì)細(xì)菌芽孢需培養(yǎng)72h觀察最終結(jié)果。（8）試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各組的活菌濃度（cfu/ml），并換算為對(duì)數(shù)值（N），然后按下式計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值:殺滅對(duì)數(shù)值(KL)＝對(duì)照組平均活菌濃度的對(duì)數(shù)值（No）－試驗(yàn)組活菌濃度對(duì)數(shù)值（Nx）計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值時(shí)，取小數(shù)點(diǎn)后兩位值，可以進(jìn)行數(shù)字修約。如果消毒試驗(yàn)組消毒處理后平均生產(chǎn)菌落數(shù)，小于等于1時(shí)，其殺滅對(duì)數(shù)值，即大于等于試驗(yàn)前對(duì)照組平均活菌濃度的對(duì)數(shù)值。1.7.5載體浸泡殺菌試驗(yàn)操作程序（1）載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)操作程序1）劑溶液注入平皿中。2）將盛有消毒劑平皿置20℃±1℃水浴箱內(nèi)5min后，用無(wú)菌鑷子分別放入預(yù)先制備的菌片3片，并使之浸透于消毒液中。3）管中。用電動(dòng)混合器混合20s，或?qū)⒃嚬茉谑终粕险袂?0次，使菌片上的細(xì)菌被洗脫進(jìn)入中和液中，再放置5min以上，使中和作用充分。最終進(jìn)一步混勻后，吸取1.0ml直接接種平皿，每管接種2個(gè)平皿，測(cè)定存活菌數(shù)。4）另隨后的試驗(yàn)步驟和活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)與上述試驗(yàn)組相同。5）所有試驗(yàn)樣本均在37℃溫箱中培養(yǎng)，對(duì)細(xì)菌繁殖體培養(yǎng)48h觀察最終結(jié)果；對(duì)細(xì)菌芽孢需培養(yǎng)72h觀察最終結(jié)果。6）試驗(yàn)重復(fù)3次（包括對(duì)照），計(jì)算各組的活菌量（cfu/片），并換算為對(duì)數(shù)值（N），然后按1.7.4（8）公式計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值。（2）載體浸泡定性滅菌試驗(yàn)操作程序1）溶液注入平皿中。2）將盛有消毒劑平皿置20℃±1℃水浴箱內(nèi)5min后，用無(wú)菌鑷子分別放入預(yù)先制備的菌片6片，（每個(gè)作用時(shí)間2片菌片）并使之浸透于消毒液中。3）待試驗(yàn)菌與消毒液相互作用至各預(yù)定時(shí)間，用無(wú)菌鑷子將菌片取出分別移入一含5.0ml中和劑TSB試管中。用電動(dòng)混合器混合20s，作為試驗(yàn)組樣本。4）另取一平皿，注入20.0ml硬水代替消毒液，放入4片菌片，作用至預(yù)定時(shí)間，取出2片，分別移入含5ml中和劑TSB試管中。其隨后的試驗(yàn)步驟與上述試驗(yàn)組相同，作為陽(yáng)性對(duì)照組樣本。另取出2片，分別移入一含5.0ml中和劑試管中，用電動(dòng)混合器混合20s，或?qū)⒃嚬茉谑终粕险袂?0次，然后用稀釋液做10倍系列稀釋，選擇適宜稀釋度，吸取1.0ml接種平皿，每管接種2個(gè)平皿，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，作為菌數(shù)對(duì)照組樣本。5）所有試驗(yàn)樣本均在37℃溫箱中培養(yǎng)，對(duì)細(xì)菌繁殖體培養(yǎng)48h，觀察最終結(jié)果；對(duì)細(xì)菌芽孢需培養(yǎng)7d，觀察最終結(jié)果。6）試驗(yàn)重復(fù)5次（包括對(duì)照），計(jì)算各組的活菌量（cfu/片）。1.7.6載體噴霧定量殺菌試驗(yàn)操作程序（1）根據(jù)所試菌種和消毒劑對(duì)該菌的殺滅能力，選定1個(gè)消毒劑濃度（即產(chǎn)品使用說(shuō)明書中指定的最低濃度）和3個(gè)作用時(shí)間（說(shuō)明書指定最短作用時(shí)間，指定最短作用時(shí)間的0.5倍，指定最低作用時(shí)間的1.5倍。如說(shuō)明書指定最短作用時(shí)間為20min，則應(yīng)進(jìn)行10min、20min、30min三個(gè)時(shí)間）進(jìn)行試驗(yàn)。（2）選定消毒劑的濃度與作用時(shí)間。每種菌所染菌片應(yīng)分開進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)時(shí)，每種載體菌片各取3片，以等邊三角形或三角形陣列，均勻排布于一未沾有任何消毒劑的清潔無(wú)菌玻璃板上（如無(wú)菌平皿內(nèi)）。（3）每批試驗(yàn)以同一濃度消毒劑溶液對(duì)上述排列的菌片進(jìn)行均勻噴霧。每次噴霧的距離和壓力保持一致，以盡量使噴到菌片上的霧粒大小和數(shù)量一致。噴霧量以不使菌片濕透、流液為度。（4）中和劑的無(wú)菌試管中。將試管用電動(dòng)混合器混合20s，或在手掌上振敲80次，使菌片上細(xì)菌被洗脫進(jìn)入中和液中。（5）吸取1.0ml上述洗液，按活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法測(cè)定存活菌數(shù)，每管接種2個(gè)平皿。（6）每批試驗(yàn)均應(yīng)換一塊未沾有任何消毒劑的清潔無(wú)菌玻璃板。噴霧器換裝新濃度消毒劑前，應(yīng)將原殘留消毒劑洗凈，再換裝新濃度消毒劑。（7）用硬水代替消毒液，按同樣的噴霧方法進(jìn)行處理，作為陽(yáng)性對(duì)照組。如為壓力罐裝自動(dòng)噴霧式氣霧消毒劑，可直接用染菌載體作活菌計(jì)數(shù)，作為處理前陽(yáng)性對(duì)照組。（8）所有試驗(yàn)樣本均在37℃溫箱中培養(yǎng)，對(duì)細(xì)菌繁殖體培養(yǎng)48h觀察最終結(jié)果；對(duì)細(xì)菌芽孢需培養(yǎng)72h觀察最終結(jié)果。（9）試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各組的活菌數(shù)（cfu/片），并換算為對(duì)數(shù)值（N），然后按1.7.4（8）公式計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值。1.7.7定量殺菌試驗(yàn)的評(píng)價(jià)規(guī)定（1）產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)，在產(chǎn)品說(shuō)明書指定的最低濃度與最低作用時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)3次。要試驗(yàn)，各次的殺滅對(duì)數(shù)值均≥3.00，可判定消毒合格。（2）產(chǎn)品申報(bào)衛(wèi)生許可檢驗(yàn)中，要求在產(chǎn)品說(shuō)明書指定的濃度與3作用時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)3次。在產(chǎn)品指定最低濃度與最短作用時(shí)間，以及最短作用時(shí)間的1.5倍時(shí)，要求懸液定量殺滅試驗(yàn)中各次的殺滅對(duì)數(shù)均應(yīng)≥5.00。要求載體定量殺滅試驗(yàn)中，各次的殺滅對(duì)數(shù)均應(yīng)≥3.00，可判定為消毒合格。在產(chǎn)品指定濃度與最短作用時(shí)間的0.5倍時(shí)，可容許對(duì)不同細(xì)菌或在部分重復(fù)次數(shù)中，出現(xiàn)不合格結(jié)果。（3）對(duì)載體浸泡定性滅菌試驗(yàn)，陽(yáng)性對(duì)照組應(yīng)有菌生長(zhǎng)，菌數(shù)對(duì)照組符合要求，陰性對(duì)照組應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，5次試驗(yàn)所有作用時(shí)間均無(wú)菌生長(zhǎng)為滅菌合格。（4）報(bào)告中應(yīng)將各此試驗(yàn)的結(jié)果全部以表格的形式列出。陽(yáng)性對(duì)照組應(yīng)列出各次試驗(yàn)菌5.00，而不必列出具體的數(shù)字；殺滅對(duì)數(shù)值小于5.00時(shí)，應(yīng)列出具體的數(shù)字（例如2.58，4.65）。1.7.8注意事項(xiàng)（1）在殺菌試驗(yàn)中，每次均應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。（2）試驗(yàn)中所使用的中和劑、稀釋液和培養(yǎng)基等，各批次均應(yīng)進(jìn)行無(wú)菌檢查，發(fā)現(xiàn)有菌生長(zhǎng)，則全部試驗(yàn)需換用未污染試劑或培養(yǎng)基重做。（3）懸液定量殺菌試驗(yàn)時(shí)，有機(jī)干擾物質(zhì)一般采用3%（W/V）牛血清白蛋白貯存溶液，取0.5ml加入到消毒體系中（稀釋10倍），進(jìn)行消毒試驗(yàn)。如果某消毒劑使用說(shuō)明書中指定，其產(chǎn)品只用于清潔物品或器械的消毒或只清洗消毒，可采用0.3%（W/V）牛血清白蛋白貯存溶液，取0.5ml加入到消毒體系中（稀釋10倍），進(jìn)行消毒試驗(yàn)。1.8殺滅分枝桿菌試驗(yàn)1.8.1目的在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)定消毒劑殺滅懸液中或載體上分枝桿菌所需劑量，以驗(yàn)證對(duì)分枝桿菌（包括結(jié)核桿菌）實(shí)用消毒劑量。1.8.2試驗(yàn)器材(1)試驗(yàn)菌株龜分枝桿菌膿腫亞種ATCC93326。(2)培養(yǎng)基分枝桿菌干燥培養(yǎng)基(上海奧普生物醫(yī)藥有限公司)。(3)試驗(yàn)菌及其菌懸液或菌片的制備。(4)中和劑(根據(jù)1.5所示方法鑒定合格者)。(5)稀釋液0.1%胰蛋白胨的生理鹽水溶液。(6)消毒劑稀釋用硬水：見附錄A。(7)有機(jī)干擾物質(zhì)：見附錄A。(8)刻度吸管(0.1ml、1.0ml、5.0ml)。(9)恒溫水浴箱。(10)噴霧裝置（用于噴霧消毒試驗(yàn)）。(11)電力混合器。(12)計(jì)時(shí)裝置。 (13)恒溫培養(yǎng)箱。1.8.3龜分枝桿菌膿腫亞種ATCC93326菌懸液的制備（1）取凍干菌種管，以無(wú)菌操作打開，用毛細(xì)吸管吸加適量營(yíng)養(yǎng)肉湯于管中，輕柔吹吸，置37℃培養(yǎng)18h～24h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于分枝桿菌培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)72h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于分枝桿菌培養(yǎng)基斜面，于37℃培養(yǎng)72h，即為第3代培養(yǎng)物。密封后，在4℃保存，時(shí)間不得超過(guò)6周。（2）試驗(yàn)時(shí)取第3代斜面培養(yǎng)物，在分枝桿菌瓊脂斜面上連續(xù)傳代，培養(yǎng)方法與第3代相稀釋液加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用5.0ml吸管將洗液移至一含有6-7g玻璃珠的無(wú)菌圓錐底試管中，在電動(dòng)混合器混合至少5min。然后將菌液吸入到另一試管內(nèi)制成菌懸液。濃度。（4）菌懸液保存在4℃冰箱內(nèi)備用。當(dāng)天使用不得過(guò)夜。1.8.4試驗(yàn)分組試驗(yàn)分為下列各組:(1)試驗(yàn)組，按1.7.3規(guī)定，選定消毒劑濃度與作用時(shí)間。(2)陽(yáng)性對(duì)照組，以硬水代替消毒劑溶液，按1.7.3規(guī)定程序進(jìn)行試驗(yàn)。所得結(jié)果代表試驗(yàn)體系中所含受試菌的初始濃度，并以其計(jì)算消毒因子對(duì)受試菌的殺滅對(duì)數(shù)值。(3)陰性對(duì)照組，觀察同次試驗(yàn)用相關(guān)溶液和培養(yǎng)基有無(wú)污染。1.8.5試驗(yàn)程序常用殺滅試驗(yàn)有:懸液定量殺滅試驗(yàn)、載體浸泡定量殺滅試驗(yàn)、載體噴霧定量殺菌試驗(yàn)等。其操作程序詳見1.7.4，1.7.5，1.7.6。接種后的平皿應(yīng)放入干凈的塑料袋內(nèi)，在37℃中培養(yǎng)1周，觀察最終結(jié)果。1.8.6評(píng)價(jià)規(guī)定(1)產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)，按產(chǎn)品使用說(shuō)明書指定的使用濃度和作用時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)3次，要求懸液定量殺滅試驗(yàn)各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值均≥4.00，要求載體定量殺滅試驗(yàn)，各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值均≥3.00，可判定該產(chǎn)品對(duì)分枝桿菌污染物消毒合格。(2)產(chǎn)品鑒定檢驗(yàn)，按產(chǎn)品使用說(shuō)明書指定的使用濃度和3個(gè)作用時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)3次，在產(chǎn)品使用說(shuō)明書規(guī)定使用濃度與最短作用時(shí)間，以及最短作用時(shí)間的1.5倍時(shí)，各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值均應(yīng)≥4.00，在產(chǎn)品使用說(shuō)明書規(guī)定使用濃度與最短作用時(shí)間的0.5倍時(shí)，允許殺滅對(duì)數(shù)值＜4.00，可判為實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)該產(chǎn)品對(duì)分枝桿菌污染物消毒的有效劑量。用載體浸泡定量殺滅試驗(yàn)評(píng)價(jià)殺菌效果時(shí)，在產(chǎn)品使用說(shuō)明書規(guī)定使用濃度與最短作用時(shí)間，以及最短作用時(shí)間的1.5倍時(shí)，各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值≥3.00，在產(chǎn)品使用說(shuō)明書規(guī)定的使用濃度與最短作用時(shí)間的0.5倍時(shí)，允許殺滅對(duì)數(shù)值＜3.00，可判為試驗(yàn)室試驗(yàn)該產(chǎn)品對(duì)分枝桿菌污染物消毒的有效劑量。1.9真菌殺滅試驗(yàn)1.9.1目的在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)定消毒劑殺滅懸液中或載體上真菌繁殖體或真菌孢子所需劑量，以驗(yàn)證對(duì)真菌及其孢子實(shí)用消毒劑量。1.9.2試驗(yàn)器材(1)麥芽浸膏瓊脂（MEA）：見附錄A。(2)沙堡瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A。(3)試驗(yàn)菌及其菌懸液或菌片的制備白色念珠菌ATCC10231和黑曲霉菌ATCC16404或孢子懸液與菌片按1.9.3(1)和1.9.3(2)所示方法制備。此外，根據(jù)消毒劑特定用途和特殊需要，可選用其它真菌或孢子懸液與菌片。（4）中和劑(根據(jù)1.5所示方法鑒定合格者)。（5）磷酸鹽緩沖液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)。（6）消毒劑稀釋用硬水：見附錄A。（7）有機(jī)干擾物質(zhì)：見附錄A。（8）刻度吸管(0.1ml、1.0ml、5.0ml)。（9）恒溫水浴箱。（10）噴霧裝置（用于噴霧消毒試驗(yàn)）。（11）電動(dòng)混合器。（12）計(jì)時(shí)裝置。1.9.3真菌懸液制備（1）白色念珠菌懸液的制備1）取凍干菌種管，以無(wú)菌操作打開，用毛細(xì)吸管吸加適量沙堡液體培養(yǎng)基于管中，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含5.0ml～10.0ml沙堡液體培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置37℃培養(yǎng)18h～24h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于沙堡瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)18h～24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于沙堡瓊脂斜面，于37℃培養(yǎng)18h～24h，即為第3代培養(yǎng)物。將其密封后在4℃保存，時(shí)間不得超過(guò)6周。2）試驗(yàn)時(shí)，取第3代斜面培養(yǎng)物在砂堡瓊脂斜面上連續(xù)傳代，方法與第3代相同。取第5代或6代的沙堡瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（18h～24h），用5.0ml吸管吸取3.0ml～5.0ml稀釋液加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用5.0ml吸管將洗液移至另一無(wú)菌試管中，用電動(dòng)混合器混合20s，或在手掌上振敲80次，以使白色念珠菌菌懸浮均勻。3）懸液殺菌試驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)用菌懸液的含菌量為1×107cfu/ml～5×107cfu/ml；菌片制備按1.2要求進(jìn)行。4）菌懸液保存在4℃冰箱內(nèi)備用。當(dāng)天使用不得過(guò)夜。5）懷疑有污染時(shí)，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗(yàn)等法進(jìn)行鑒定。菌落形態(tài)可直接用顯微鏡觀察。菌體形態(tài)可在涂片后直接用高倍顯微鏡觀察，也可用墨水陰地法染色（將菌與黑墨水在玻片上混勻，推成薄膜）后觀察。（2）黑曲霉ATCC16404懸液或菌片的制備。1)取凍干菌種管，以無(wú)菌操作打開，用毛細(xì)管吸取少量麥芽浸膏肉湯培養(yǎng)基加到菌種管中，輕輕吹吸，使菌種沉淀物融化分散。取少許沉淀物懸液加到含5.0ml麥芽浸膏營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管中，置30℃±1℃培養(yǎng)42h～48h。用接種環(huán)劃線接種第1代培養(yǎng)物于MEA培養(yǎng)基平板，置30℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42h～48h。取平板培養(yǎng)物中的典型菌落，接種于麥芽浸膏營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，置30℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42h～48h，即為第3代培養(yǎng)物。將其密封后在4℃保存，時(shí)間不得超過(guò)9周。2)試驗(yàn)時(shí)，取第3代斜面培養(yǎng)物接種麥芽浸膏瓊脂斜面，30℃培養(yǎng)48h，取得3.0~5.0ml麥芽浸膏肉湯，洗下斜面上的培養(yǎng)物，接種羅氏瓶，并搖動(dòng)使菌液布滿MEA培養(yǎng)基表面，然后吸棄多余肉湯培養(yǎng)物液體，置30℃±1℃培養(yǎng)7d～9d。3)向羅氏瓶培養(yǎng)物中加入5.0ml～10.0ml0.05%（V/V）吐溫80生理鹽水溶液，刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中，將孢子懸液移入裝有玻璃珠的三角瓶中，輕輕振搖1min后，濾過(guò)除去菌絲。濾過(guò)后，顯微鏡下（400倍）觀察是否存在菌絲，若懸液中有菌絲存在，可經(jīng)5000r/min～6000r/min，離心20min。再次在顯微鏡下（400倍）觀察，若懸液中仍有菌絲存在，須再離心。4)黑曲霉分生孢子懸液在2℃～8℃儲(chǔ)存不能超過(guò)2d，使用前，混合均勻，在顯微鏡下（400倍）觀察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，則棄之不用。5)使用時(shí)，可用稀釋液適當(dāng)稀釋。懸液試驗(yàn)時(shí)實(shí)驗(yàn)用菌懸液的含菌量為1×107cfu/ml～5×107cfu/ml。6)制備染菌樣片時(shí)染菌方法為滴染法，每片加菌懸液10μl。染菌后，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)干燥(約30min)，或置室溫下自然陰干后再使用。7)回收菌數(shù)應(yīng)達(dá)5×105cfu/片～5×106cfu/片，可依試驗(yàn)要求確定。1.9.4試驗(yàn)分組試驗(yàn)分為下列各組:(1)試驗(yàn)組，按1.7.3規(guī)定，選定消毒劑濃度與作用時(shí)間，對(duì)受試菌種的殺滅能力進(jìn)行測(cè)定。(2)陽(yáng)性對(duì)照組，以硬水代替消毒劑溶液，按1.7.3規(guī)定程序進(jìn)行試驗(yàn)。所得結(jié)果代表試驗(yàn)體系中所含試驗(yàn)菌的初始濃度，并以其計(jì)算消毒因子對(duì)試驗(yàn)菌的殺滅對(duì)數(shù)值。(3)陰性對(duì)照組，觀察同次試驗(yàn)用相關(guān)溶液和培養(yǎng)基有無(wú)污染。1.9.5試驗(yàn)程序常用殺滅試驗(yàn)有：懸液定量殺菌試驗(yàn)、載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)、載體噴霧定量殺菌試驗(yàn)等。培養(yǎng)基對(duì)白色念珠菌為沙堡葡萄糖瓊脂，對(duì)黑曲霉菌為麥芽浸膏瓊脂（MEA）。其操作程序詳見1.7?；罹囵B(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)，對(duì)白色念珠菌，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h觀察最終結(jié)果。對(duì)黑曲霉菌，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h觀察最終結(jié)果。1.9.6評(píng)價(jià)規(guī)定(1)產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)，按產(chǎn)品使用說(shuō)明書指定的使用濃度和作用時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)3次，對(duì)白色念珠菌和黑曲霉菌各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值均≥4.00，要求載體定量殺滅試驗(yàn)，各次試≥3.00，(2)產(chǎn)品申報(bào)衛(wèi)生許可檢驗(yàn)，按產(chǎn)品使用說(shuō)明書指定的使用濃度和3個(gè)作用時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)3次，要求懸液定量殺滅試驗(yàn)在產(chǎn)品使用說(shuō)明書規(guī)定使用濃度與最短作用時(shí)間，以及最短作用時(shí)間的1.5倍時(shí)，各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值均應(yīng)≥4.00，在產(chǎn)品使用說(shuō)明書規(guī)定使用濃度與最低作用時(shí)間的0.5倍時(shí)，允許殺滅對(duì)數(shù)值＜4.00，可判為實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)該產(chǎn)品對(duì)真菌污染物消毒的有效劑量。用載體浸泡定量殺滅試驗(yàn)評(píng)價(jià)殺菌效果時(shí)，在產(chǎn)品使用說(shuō)明書規(guī)定使用濃度與最短作用時(shí)間，以及最短作用時(shí)間的1.5倍時(shí)，各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值≥3.00，在產(chǎn)品使用說(shuō)明書規(guī)定使用濃度與最短作用時(shí)間的0.5倍時(shí)，允許殺滅對(duì)數(shù)值＜3.00，可判為實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)該產(chǎn)品對(duì)真菌污染物消毒的有效劑量。1.9.7注意事項(xiàng)(1)黑曲霉菌試驗(yàn)操作應(yīng)在Ⅱ級(jí)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，避免造成環(huán)境污染和操作者受污染。(2)其它注意事項(xiàng)見1.7.8。1.10病毒滅活試驗(yàn)1.10.1適用范圍主要適用于消毒產(chǎn)品鑒定或日常監(jiān)測(cè)。用具有一定代表性的、活的病毒及其細(xì)胞感染技術(shù)，評(píng)價(jià)各種用途的消毒因子對(duì)測(cè)試病毒的殺滅效果。按此方法進(jìn)行的試驗(yàn)，只是對(duì)消毒因子的滅活病毒能力的重要方面進(jìn)行驗(yàn)證。1.10.2試驗(yàn)器材（1）試驗(yàn)用病毒株：脊髓灰質(zhì)炎病毒1型（poliovirus-Ⅰ，PV-Ⅰ）疫苗株；艾滋病病毒1型（HIV-1）美國(guó)株。（2）測(cè)試細(xì)胞。用含有人T淋巴細(xì)胞白血病病毒1型（humanTcellleukemiavirus1，HTLV-1）基因的人淋巴細(xì)胞（MT4株）作為HIV-1的測(cè)試細(xì)胞。（3）細(xì)胞培養(yǎng)瓶與96孔培養(yǎng)板。（4）恒溫水浴箱。（5）二氧化碳培養(yǎng)箱。（6）層流超凈工作臺(tái)。（7）低溫冰箱（-20℃，-80℃）。（8）液氮罐。（9）倒置顯微鏡。（10）離心機(jī)。（11）可調(diào)移液器及配套一次性塑料吸頭。（12）細(xì)胞維持培養(yǎng)基：見附錄A。（13）細(xì)胞完全培養(yǎng)基：見附錄A。（14）去離子水。1.10.3病毒懸液的制備（1）從液氮中取出凍存的試驗(yàn)用宿主細(xì)胞，在37℃溫水中迅速融化，用毛細(xì)吸管移植于含有細(xì)胞維持液的細(xì)胞管內(nèi)，吹吸數(shù)次，使混勻，立即離心（3000r/min，3min），去上清液。再加入適當(dāng)?shù)募?xì)胞維持液，吹吸數(shù)次，使混勻，同上離心后，轉(zhuǎn)種于加有10ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。逐日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，在細(xì)胞長(zhǎng)滿單層時(shí)，用于消毒試驗(yàn)。（2）取出低溫凍存的試驗(yàn)病毒毒種，37℃水浴融化，用細(xì)胞維持液作10倍稀釋，然后接種于已經(jīng)長(zhǎng)滿單層細(xì)胞的細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，置37℃溫箱中，使與細(xì)胞吸附、生長(zhǎng)。逐日觀察病變，待3/4細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收獲病毒。（3）將含有病毒及宿主細(xì)胞的培養(yǎng)液，在冰浴條件下，用超聲波（或反復(fù)凍融）破碎宿主細(xì)胞，釋放病毒。然后，盡快離心（6000r/min，15min）去除沉淀（主要為細(xì)胞碎片），上清液即為所需的病毒懸液。按每管1.0ml分裝于無(wú)菌離心管(1.5ml)中。（4）取1支病毒懸液，按病毒滴度測(cè)定法，測(cè)定其病毒滴度。其余均冷凍保存于-80℃?zhèn)溆谩?.10.4病毒滅活滴度計(jì)算方法（1）終點(diǎn)稀釋法病毒感染滴度的計(jì)算以半數(shù)細(xì)胞感染劑量（TCID50）表示。TCID50的對(duì)數(shù)值計(jì)算公式如下。TCID50對(duì)數(shù)值=病變率高于50%組稀釋度的對(duì)數(shù)值+距離比例（“病變率高于50%組”是指病變率超過(guò)50%的最低組，下簡(jiǎn)稱“高于50%組”；“病變率低于50%組”是指病變率低于50%的最高組，下簡(jiǎn)稱“低于50%組”）。具體計(jì)算方法如下：1）計(jì)算細(xì)胞病變率。先計(jì)數(shù)培養(yǎng)板上不同稀釋度樣本細(xì)胞病變發(fā)生與未發(fā)生的孔數(shù)，然，由稀釋度低樣本組向稀釋度高樣本組累積；“細(xì)胞病變（+）”累積值則相反，由稀釋度高樣本組向稀釋度低樣本組累積〔見表2-2〕。胞病變（+）”累積總計(jì)值之和即為其病變比，由之可得病變率（%）〔見表2-2〕。2）計(jì)算距離比例。距離比例可按下式計(jì)算：3）計(jì)算舉例設(shè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2-2表2-2某消毒劑對(duì)HIV滅活作用的測(cè)定結(jié)果樣本接種細(xì)胞病變累積值病變比病變率（%）稀釋度孔數(shù)-+細(xì)胞病變(-)細(xì)胞病變(+)10-440401212/1210010-5404088/810010-6413144/58010-7431411/52010-8440800/80本例，高于50%組病變率（%）為80；低于50%病變率（%）為20；高于50%組稀釋度對(duì)數(shù)值為6。TCID50對(duì)數(shù)值=6＋0.5=6.5（2）噬斑法病毒感染滴度的計(jì)算噬斑法病毒感染滴度，以噬斑形成單位數(shù)（pfu），簡(jiǎn)稱噬斑數(shù)表示。計(jì)數(shù)方法同活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)技術(shù)（參見1.3）。每毫升測(cè)試樣品中的病毒含量計(jì)算（pfu/ml）＝平板平均噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)（3）平均滅活對(duì)數(shù)值的計(jì)算平均滅活對(duì)數(shù)值按下式計(jì)算：設(shè)陽(yáng)性（病毒）對(duì)照組平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的為N0，試驗(yàn)（消毒）組平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）為Nx。平均滅活對(duì)數(shù)值=logNo－logNx1.10.5殘留消毒劑化學(xué)中和法的鑒定試驗(yàn)（1）目的本鑒定試驗(yàn)只在確定所選中和劑是否適用于擬進(jìn)行的細(xì)胞感染法病毒滅活試驗(yàn)。（2）試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則1）通過(guò)所設(shè)各組試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，應(yīng)可確定所用中和劑是否對(duì)測(cè)試消毒藥物有良好的中和作用，對(duì)試驗(yàn)用病毒和細(xì)胞株是否有害或不良影響。2）根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康模x擇適宜的病毒株和細(xì)胞株。3）中和試驗(yàn)用藥物濃度應(yīng)為正式消毒試驗(yàn)最高濃度。作用時(shí)間最短不得少于30s。（3）試驗(yàn)分組在使用細(xì)胞感染法進(jìn)行病毒滅活試驗(yàn)時(shí)，對(duì)所用中和劑的鑒定，應(yīng)進(jìn)行以下各組試驗(yàn)。其中，先進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)中的第1組～3組試驗(yàn)，如中和劑與中和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響，再進(jìn)行以下的正式試驗(yàn)。預(yù)備試驗(yàn):1）中和劑+細(xì)胞→培養(yǎng)觀察所用中和劑對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有無(wú)影響。2）（消毒劑+中和劑）+細(xì)胞→培養(yǎng)觀察中和產(chǎn)物溶液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有無(wú)影響。3）（消毒劑+細(xì)胞）→培養(yǎng)觀察消毒劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有無(wú)影響。正式試驗(yàn):1）消毒劑+病毒懸液→接種細(xì)胞培養(yǎng)觀察所試消毒劑對(duì)病毒有無(wú)抑制或滅活作用。2）（消毒劑+病毒懸液）+中和劑→接種細(xì)胞培養(yǎng)觀察殘留消毒劑被去除后，病毒是否可恢復(fù)對(duì)細(xì)胞的感染作用。3）中和劑+病毒懸液→接種細(xì)胞培養(yǎng)觀察中和劑對(duì)病毒有無(wú)抑制作用。4）（消毒劑+中和劑）+病毒懸液→接種細(xì)胞培養(yǎng)觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和的殘留消毒劑對(duì)病毒有無(wú)抑制作用或?qū)z測(cè)方法有無(wú)干擾。5）病毒懸液→接種細(xì)胞培養(yǎng)觀察病毒是否可正常生長(zhǎng)，并將其結(jié)果作為陽(yáng)性對(duì)照值。6）未接種病毒的細(xì)胞→培養(yǎng)觀察其生長(zhǎng)是否正常。（4）病毒懸液定量法中和劑鑒定試驗(yàn)操作程序根據(jù)試驗(yàn)分組，準(zhǔn)備足量有關(guān)器材，依次擺放，進(jìn)行編號(hào)。各組分別用適宜大小容量的無(wú)菌定量吸管按以下程序吸取或添加試劑和試驗(yàn)樣本。各組每吸一次試劑或樣本，即應(yīng)更換一次吸管或微量移液器吸頭，以防相互污染。1）預(yù)備劑溶液，作用3h～4h后，吸去液體，另加細(xì)胞維持培養(yǎng)液，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2）預(yù)備試驗(yàn)第2組。將試驗(yàn)用細(xì)胞，分別加入不同稀釋度中和產(chǎn)物溶液作用3h～4h后，吸去中和產(chǎn)物溶液，另加細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3）預(yù)備試驗(yàn)第3組。將試驗(yàn)用細(xì)胞，分別加入不同稀釋度的消毒劑，作用3h～4h后，吸去消毒劑，另加細(xì)胞維持培養(yǎng)液，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4）正式試驗(yàn)第1組。吸取雙倍濃度消毒劑溶液0.5ml于試管內(nèi)，置20℃±1℃水浴中5min后，吸加0.5ml病毒懸液，混勻。待作用至試驗(yàn)預(yù)定的滅活病毒時(shí)間，加入1.0ml去離子水，根據(jù)試驗(yàn)規(guī)定量，吸取該最終樣液（或以對(duì)病毒無(wú)害的稀釋液作系列稀釋），進(jìn)行隨后的病毒滴度測(cè)定。5）正式試驗(yàn)第2組。吸取雙倍濃度消毒劑溶液0.5ml于試管內(nèi)，置20℃±1℃水浴中5min后，再吸加0.5ml病毒懸液，混勻。待作用至試驗(yàn)規(guī)定的滅活病毒時(shí)間，加入1.0ml中和劑溶液，混勻，作用10min。進(jìn)行隨后的病毒滴度測(cè)定。6）正式試驗(yàn)第3組。吸取0.5ml去離子水于試管內(nèi)，置20℃±1℃水浴中5min后，病毒滴度測(cè)定。7）正式試驗(yàn)第4組。吸取雙倍濃度消毒劑0.5ml于試管內(nèi)，置20℃±1℃水浴中5min后，加入1.0ml中和劑，再吸加0.5ml病毒懸液，混勻，作用10min。進(jìn)行隨后的病毒滴度測(cè)定。8）正式試驗(yàn)第5組。吸取去離子水1.5ml于試管內(nèi)，置20℃±1℃水浴中5min后，再吸加0.5ml病毒懸液，混勻。進(jìn)行隨后的病毒滴度測(cè)定。9）正式試驗(yàn)第6組。將試驗(yàn)用細(xì)胞，加細(xì)胞維持培養(yǎng)液后，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10）本試驗(yàn)中對(duì)各種病毒的接種和檢測(cè)操作技術(shù)，若無(wú)特殊要求，按病毒學(xué)中各種病毒的常規(guī)培養(yǎng)和檢測(cè)方法進(jìn)行即可。（5）評(píng)價(jià)規(guī)定試驗(yàn)結(jié)果符合以下全部條件，所測(cè)中和劑可判為合格:1）正式試驗(yàn)中第1組無(wú)試驗(yàn)病毒，或僅有少量試驗(yàn)病毒生長(zhǎng)。2）正式試驗(yàn)中第2組有較第1組顯著為多，但較第3、4、5（組）顯著為少的試驗(yàn)病毒生長(zhǎng)。3）正式試驗(yàn)中第3、4、5（組）病毒生長(zhǎng)與原接種量相近。4）正式試驗(yàn)中第6組細(xì)胞生長(zhǎng)正常。5）預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果顯示，中和劑和中和產(chǎn)物，在正式試驗(yàn)的最高濃度下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響。6）連續(xù)3次試驗(yàn)取得合格評(píng)價(jià)。（6）注意事項(xiàng)病毒載體中和試驗(yàn)法可參照上述懸液定量中和試驗(yàn)程序，并按照病毒學(xué)原理進(jìn)行適當(dāng)修改后使用。1.10.6殘留消毒劑物理去除方法的鑒定試驗(yàn)病毒滅活試驗(yàn)中的物理除藥法，首先稀釋法，其次為吸附柱法、分子篩柱法、載體沖洗法。（1）分組1）消毒劑+病毒懸液→接種培養(yǎng)觀察所試消毒劑對(duì)病毒有無(wú)滅活或抑制作用，對(duì)細(xì)胞正常生長(zhǎng)有無(wú)影響。2）（消毒劑+病毒懸液）+除藥處理→接種培養(yǎng)觀察去除殘留藥物后病毒可否恢復(fù)對(duì)細(xì)胞的感染作用。3）病毒懸液+除藥處理→接種培養(yǎng)觀察除藥處理對(duì)病毒滴度有無(wú)影響。4）病毒懸液→接種培養(yǎng)觀察病毒生長(zhǎng)是否正常，并以該結(jié)果作為陽(yáng)性對(duì)照值。5）未接種病毒的細(xì)胞→培養(yǎng)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)是否正常。（2）懸液定量操作程序1）第1組。吸取消毒劑0.9ml于試管內(nèi)，置20℃±1℃水浴中經(jīng)5min后，吸加0.1ml病毒懸液，混勻。待作用至試驗(yàn)規(guī)定的滅活病毒時(shí)間，根據(jù)試驗(yàn)規(guī)定量，吸取該最終樣液（或用適宜的對(duì)病毒無(wú)害的稀釋液作系列稀釋的樣液），進(jìn)行隨后的病毒滴度測(cè)定。2）毒懸液，混勻。待作用至規(guī)定的時(shí)間，對(duì)此液進(jìn)行除藥處理，根據(jù)試驗(yàn)規(guī)定量，吸取最終樣本（或用適宜的對(duì)病毒無(wú)害的稀釋液作系列稀釋的樣液），進(jìn)行隨后的病毒滴度測(cè)定。3）第3組。吸取病毒懸液0.1ml，加0.9ml細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液，做除藥處理。根據(jù)試驗(yàn)規(guī)定量，吸取最終樣本（或用適宜的對(duì)病毒無(wú)害的稀釋液作系列稀釋的樣液），進(jìn)行隨后的病毒滴度測(cè)定。4）處理。根據(jù)試驗(yàn)規(guī)定量，吸取該病毒懸液（或用適宜的對(duì)病毒無(wú)害的稀釋液作系列稀釋的樣液），進(jìn)行隨后的病毒滴度測(cè)定。5）第5組。向未接種病毒的細(xì)胞管內(nèi)，加入完全細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。（3）評(píng)價(jià)規(guī)定試驗(yàn)結(jié)果符合以下全部條件，所測(cè)物理除藥法可判為合格:1）第1組無(wú)試驗(yàn)病毒，或僅有少量生長(zhǎng)。2）第2組有遠(yuǎn)較第1組為多，但明顯較3組～5組為少的試驗(yàn)病毒生長(zhǎng)。3）第3、4、5（組）試驗(yàn)病毒生長(zhǎng)量相近。4）連續(xù)3次試驗(yàn)取得合格評(píng)價(jià)。5）可使用病毒載體，按同樣的原理與操作步驟進(jìn)行試驗(yàn)，判定合格標(biāo)準(zhǔn)相同。1.10.7脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活試驗(yàn)（1）目的測(cè)定消毒劑對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus，PV）滅活所需的劑量，以驗(yàn)證病毒污染物消毒實(shí)用劑量。（2）實(shí)驗(yàn)原理用細(xì)胞感染法測(cè)定消毒劑作用前后（或?qū)嶒?yàn)組與對(duì)照組）樣本中脊髓灰質(zhì)炎的量。以細(xì)胞病變作為判斷指標(biāo)，確定各組病毒的感染滴度，計(jì)算消毒劑對(duì)脊髓灰質(zhì)炎的滅活率。（3）試驗(yàn)分組1）試驗(yàn)組。根據(jù)所測(cè)消毒劑對(duì)其他微生物的殺滅或滅活劑量估計(jì)，設(shè)定適宜的濃度與作用時(shí)間組（不少于1個(gè)濃度，3個(gè)作用時(shí)間），對(duì)作用時(shí)間的設(shè)計(jì)應(yīng)不短于30s。2）陽(yáng)性對(duì)照組。用去離子水代替消毒劑，按試驗(yàn)組規(guī)定步驟加入脊髓灰質(zhì)炎懸液進(jìn)行試驗(yàn)和培養(yǎng)，觀察脊髓灰質(zhì)炎生長(zhǎng)是否良好。3）陰性對(duì)照組。用不含脊髓灰質(zhì)炎的完全培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，觀察所用培養(yǎng)基有無(wú)污染，細(xì)胞是否生長(zhǎng)良好。（4）脊髓灰質(zhì)炎懸液定量滅活試驗(yàn)操作程序1）從液氮中取出凍存的試驗(yàn)宿主細(xì)胞，在37℃溫水中迅速融化，并用細(xì)胞維持液洗滌兩次后，轉(zhuǎn)種于加有10ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶中。逐日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，在細(xì)胞長(zhǎng)滿單層時(shí)，用于消毒試驗(yàn)。2）取出低溫凍存的脊髓灰質(zhì)炎-1毒株，37℃水浴融化，用細(xì)胞維持液作10倍稀釋，然后接種于含已經(jīng)長(zhǎng)滿單層細(xì)胞的細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，置37℃溫箱中，使與細(xì)胞吸附、生長(zhǎng)。逐日觀察病變，待3/4細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收獲病毒。收獲時(shí)，將培養(yǎng)液取出，用超聲波或反復(fù)凍融破碎宿主細(xì)胞，盡快離心，并將含病毒的上清液按每管1.0ml分裝于無(wú)菌離心管（1.5ml）中，冷凍保存于-80℃?zhèn)溆谩?）取待測(cè)消毒劑，用滅菌硬水稀釋至所需濃度的1.25倍，于20℃±1℃水浴中備用。4）取100μl有機(jī)干擾物質(zhì)與100μl病毒原液混合，于20℃±1℃水浴中作用5min，加入0.8ml待檢消毒劑，立即混勻并記時(shí)。作用規(guī)定時(shí)間，立即取出0.1ml，加入中和劑中混勻；或用經(jīng)鑒定合格的除藥方法處理。5）陽(yáng)性（病毒）對(duì)照組試驗(yàn)中，用無(wú)菌去離子水代替消毒劑。6）各組分別進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，可采用終點(diǎn)稀釋法或噬斑法進(jìn)行。7）試驗(yàn)重復(fù)3次。8）終點(diǎn)稀釋法操作步驟：先用細(xì)胞維持培養(yǎng)液對(duì)待滴定樣本做10倍系列稀釋，然后在96孔培養(yǎng)板上滴定各稀釋度樣本中殘留的病毒量，每個(gè)稀釋度做4孔（各孔中應(yīng)該已經(jīng)長(zhǎng)滿單層的宿主細(xì)胞），在37℃，放置1h～2h，以確保殘留病毒全部吸附在細(xì)胞上。取出培養(yǎng)板，更換細(xì)胞維持培養(yǎng)液。繼續(xù)放入二氧化碳培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）培養(yǎng)，逐日在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，連續(xù)觀察3d，逐孔觀察并記錄細(xì)胞病變情況。終點(diǎn)稀釋法病毒感染滴度的計(jì)算：以半數(shù)細(xì)胞感染劑量（TCID50）表示。9）噬斑法操作步驟：先用細(xì)胞維持培養(yǎng)液對(duì)待滴定樣本做10倍系列稀釋，然后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，滴定各稀釋度樣本中殘留的病毒量。接種細(xì)胞前，將生長(zhǎng)致密的單層細(xì)胞中的培養(yǎng)液傾出，加入1ml待測(cè)樣品，放置37℃吸符1h～2h，傾出樣液，加入含0.8%瓊脂的細(xì)胞維持液3ml，冷卻后翻轉(zhuǎn)細(xì)胞瓶，放置37℃培養(yǎng)48h～72h。然后每瓶細(xì)胞加入2ml甲醛溶液固定數(shù)分鐘，用自來(lái)水沖洗后加結(jié)晶紫溶液染色數(shù)分鐘，沖洗干凈后計(jì)數(shù)。細(xì)胞瓶?jī)?nèi)圓形不著色的透明區(qū)即為一個(gè)蝕斑單位，每毫升測(cè)試樣品中的病毒含量計(jì)算：pfu/ml＝平板平均蝕斑數(shù)×稀釋倍數(shù)注意：為了便于計(jì)數(shù)，病毒蝕斑數(shù)一般控制在每細(xì)胞瓶10pfu～30pfu。（5）平均滅活對(duì)數(shù)值的計(jì)算平均滅活對(duì)數(shù)值按下式計(jì)算：設(shè)陽(yáng)性（病毒）對(duì)照組平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的為N0，試驗(yàn)（消毒）組平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）為Nx。平均滅活對(duì)數(shù)值=logNo－logNx（6）評(píng)價(jià)規(guī)定1）脊灰病毒滅活試驗(yàn)，可用于評(píng)價(jià)醫(yī)療器械、食具、物體表面和皮膚用化學(xué)消毒劑對(duì)病毒的滅活效果。病毒的滅活滴度，應(yīng)達(dá)到4個(gè)對(duì)數(shù)值。2毒的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)合格。同時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組病毒滴度對(duì)數(shù)值應(yīng)在5～7之間。（7）注意事項(xiàng)1）操作人員應(yīng)具有基本的病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)工作經(jīng)驗(yàn)，盡量使用移液器與無(wú)菌一次性吸頭。2）在殺菌試驗(yàn)中，每次均應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。3）如使用病毒載體進(jìn)行試驗(yàn)，可參照上述懸液定量試驗(yàn)程序，并遵照病毒學(xué)原理進(jìn)行適當(dāng)修改后使用。1.10.8艾滋病病毒滅活試驗(yàn)（1）目的測(cè)定消毒劑對(duì)艾滋病病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）滅活所需的劑量，以驗(yàn)證對(duì)該病毒污染物消毒實(shí)用劑量。（2）實(shí)驗(yàn)原理用細(xì)胞感染法測(cè)定消毒劑作用前后（或?qū)嶒?yàn)組與對(duì)照組）樣本中HIV的量。以細(xì)胞病變作為判斷指標(biāo)，確定各組病毒的感染滴度，計(jì)算消毒劑對(duì)HIV的滅活對(duì)數(shù)值。（3）安全防護(hù)試驗(yàn)中要求采取嚴(yán)密防護(hù)措施。我國(guó)規(guī)定所有接觸HIV的試驗(yàn)均需在生物安全三級(jí)（biologicalsafetylevel3，BSL3）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，并制定有相應(yīng)的安全防護(hù)措施。在HIV滅活試驗(yàn)時(shí)，必須嚴(yán)格按照有關(guān)安全規(guī)定進(jìn)行。（4）試驗(yàn)分組1）試驗(yàn)組。根據(jù)所測(cè)消毒劑對(duì)其他微生物的殺滅或滅活劑量估計(jì)，設(shè)立適宜的濃度與作用時(shí)間組（不少于1個(gè)濃度，3個(gè)作用時(shí)間），對(duì)作用時(shí)間的設(shè)計(jì)應(yīng)不短于30s。所設(shè)組應(yīng)能測(cè)出使HIV全部滅活所需的最低有效劑量（藥物濃度與作用時(shí)間）。2）陽(yáng)性對(duì)照組。用去離子水代替消毒劑，按試驗(yàn)組規(guī)定步驟加入HIV懸液進(jìn)行試驗(yàn)和培養(yǎng)，觀察HIV生長(zhǎng)是否良好。3）陰性對(duì)照組。用不含HIV的完全培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，觀察所用培養(yǎng)基有無(wú)污染，細(xì)胞是否生長(zhǎng)良好。4）消毒劑對(duì)細(xì)胞毒性組。取100μl待測(cè)消毒劑，加入含有100μl用完全培養(yǎng)基制備的MT4細(xì)胞懸液（含細(xì)胞400000個(gè)/ml）的96孔培養(yǎng)板內(nèi)。置二氧化碳溫箱（37℃）中培養(yǎng)7d，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，確定消毒劑對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性的最高稀釋度。（5）HIV懸液定量滅活試驗(yàn)操作程序1）從液氮中取出凍存的MT4細(xì)胞，在37℃溫水中迅速融化，并用細(xì)胞維持液洗滌兩次后，轉(zhuǎn)種于加有10ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶中。逐日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收獲細(xì)胞用于消毒試驗(yàn)。2）從液氮中取出凍存HIV-1毒種，接種于含10ml細(xì)胞懸液（含細(xì)胞700000個(gè)/ml～800000個(gè)/ml）培養(yǎng)瓶中。逐日觀察病變，待3/4細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收獲病毒。收獲時(shí)，將培養(yǎng)液取出，盡快離心，并將含病毒的上清液按每管0.5ml分裝于無(wú)菌離心管（1.5ml）中，冷凍保存于-80℃?zhèn)溆?。如不能立即離心，可暫將培養(yǎng)瓶冷凍保存于-20℃，并爭(zhēng)取盡快離心分裝。3）目的，確定最高稀釋度。為防止污染培養(yǎng)液，必要時(shí)在試驗(yàn)前需將消毒劑過(guò)濾除菌。4）取50μl待檢消毒劑，與50μl病毒原液混合。在規(guī)定溫度作用一定時(shí)間（根據(jù)試驗(yàn)要求確定作用時(shí)間和溫度），立即加入0.9ml用完全培養(yǎng)基制備的MT4細(xì)胞懸液（400