第10章-吸光光度法

吸光光度法第10章物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收，朗伯－比爾定律的意義、有關(guān)計(jì)算和應(yīng)用，顯色條件的選擇，吸光光度分析儀器及其測(cè)量條件的選擇，吸收曲線與工作曲線的繪制、作用，吸光光度法的應(yīng)用，示差光度法的原理。教學(xué)重點(diǎn)第1節(jié)物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收和光吸收的根本定律一、光的根本性質(zhì)吸光光度法

是基于被測(cè)物質(zhì)的分子

對(duì)光

具有選擇吸收的特性而建立的分析方法。光的電磁波性質(zhì)

射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見光400-750nm光的波粒二象性波動(dòng)性粒子性

E光的折射光的衍射光的偏振光的干預(yù)光電效應(yīng)E：光子的能量〔J,焦耳〕：光子的頻率〔Hz,赫茲〕：光子的波長(zhǎng)〔cm〕c：光速〔2.99791010cm.s-1〕h：Plank常數(shù)〔6.625610-34J.s焦耳.秒〕二、可見光與溶液的顏色〔物質(zhì)對(duì)光的吸收〕物質(zhì)的顏色與光的關(guān)系完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光單色光、復(fù)合光、光的互補(bǔ)單色光復(fù)合光光的互補(bǔ)單一波長(zhǎng)的光由不同波長(zhǎng)的光組合而成的光假設(shè)兩種不同顏色的單色光按一定的強(qiáng)度比例混合得到白光，那么就稱這兩種單色光為互補(bǔ)色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補(bǔ)。藍(lán)黃紫紅綠紫黃綠綠藍(lán)橙紅藍(lán)綠物質(zhì)吸收光的本質(zhì)光作用于物質(zhì)時(shí)，物質(zhì)吸收了可見光，而顯示出特征的顏色，這一過程與物質(zhì)的性質(zhì)及光的性質(zhì)有關(guān)。物質(zhì)對(duì)光的吸收物質(zhì)對(duì)光的吸收滿足Plank條件h

S2S1S0S3E2E0E1E3h

h

h

透光度〔透射比〕定義：T取值為0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光I0透射光ItIrIa一束平行單色光通過任何均勻、非散射的固體、液體或氣體介質(zhì)I0=Ia+It+Ir

I0=Ia+It

三、光吸收的根本定律——朗伯—比耳定律〔Lambert-beer’slaw〕朗伯—比耳定律

Lambert–BeerLawI0dbbItII-dIdI∝NIN：薄層中的吸光粒子數(shù)N=N0cdSdbN0

：阿伏加德羅常數(shù)

dS：捕獲面積，薄層中被光照射的面積。c：吸光溶液的濃度N=k′

cdb故

dI∝NI=Ik′cdbdI=-Ik

cdb,dI/I=-k

cdb積分得或得吸光度A與透光度TAbsorbanceandtransmittanceT：透光率A：吸光度1.00.50ACA100500T%TT=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù)b

：吸光層的厚度，光程，cmc：吸光物質(zhì)的濃度，g/L,mol/LK：比例常數(shù)入射光波長(zhǎng)物質(zhì)的性質(zhì)溫度取值與濃度的單位相關(guān)c：mol/LK

摩爾吸光系數(shù)，L·

mol–1·

cm-1c：g/LK

a吸光系數(shù)，L·

g–1·

cm-1c：g/100mLK

比吸光系數(shù)相互關(guān)系MolarAbsorptivityAbsorptivitySpecificextinctioncoefficient吸光系數(shù)a比吸光系數(shù)桑德爾〔Sandell〕靈敏度SS值表示光程〔pathlenth)為1cm吸收池測(cè)得吸光度為0.001時(shí)，每mL溶液中待測(cè)物質(zhì)的微克數(shù)。單位為g．cm-2。Sandell靈敏度與的關(guān)系摩爾吸光系數(shù)

靈敏度靈敏度吸光度的加合性

多組分體系中，如果各組分之間無相互作用，其吸光度具有加合性，即第2節(jié)吸光光度計(jì)及吸收光譜

一、光度分析法的幾種類型1、目視比色法標(biāo)準(zhǔn)系列（色階）未知樣品特點(diǎn)利用自然光比較吸收光的互補(bǔ)色光準(zhǔn)確度低〔半定量〕不可分辨多組分方法簡(jiǎn)便，靈敏度高2、光電比色法3、分光光度法〔紫外-可見分光光度法〕UV-VISUltravioletVisualSpectroscopy0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示I0It參比樣品入射光I0透射光It請(qǐng)注意與定義比較未考慮吸收池和溶劑對(duì)光子的作用二、分光光度計(jì)及其根本部件紫外-可見分光光度計(jì)組件光源單色器吸收池比色皿檢測(cè)器信號(hào)輸出氫燈，氘燈，185~350nm；鹵鎢燈，250~2000nm.根本要求：光源強(qiáng)，能量分布均勻，穩(wěn)定作用：將復(fù)合光色散成單色光棱鏡光柵玻璃，350~2500nm,石英，185~4500nm平面透射光柵，反射光柵玻璃，光學(xué)玻璃，石英作用：將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并放大光電管，光電倍增管，光電二極管，光導(dǎo)攝像管〔多道分析器〕表頭、記錄儀、屏幕、數(shù)字顯示0.5cm、1cm、2cm、3cm單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)差值光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示切光器721型分光光度計(jì)儀器結(jié)構(gòu)示意圖1722型分光光度計(jì)吸收光譜〔光吸收曲線〕測(cè)量某物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)單色光的吸收程度，以波長(zhǎng)〔〕為橫坐標(biāo)，吸光度〔A〕為縱坐標(biāo)，繪制吸光度隨波長(zhǎng)的變化可得一曲線，此曲線即為吸收光譜。(a)(b)(c)(d)220240260280

nm

A0000(a)聯(lián)苯〔己烷溶劑〕；一些典型的紫外光譜(b)苯〔己烷溶劑〕；(c)苯蒸汽；(d)Na蒸汽。吸收光譜的討論：〔1〕同一種物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸光度不同。吸光度最大處對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱為最大吸收波長(zhǎng)λmax〔2〕不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似λmax不變。而對(duì)于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和λmax那么不同。ABA

A

C增大〔3〕吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一?！?〕在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測(cè)定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長(zhǎng)的重要依據(jù)?！?〕不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長(zhǎng)下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。吸收定律與吸收光譜的關(guān)系A(chǔ)C吸收定律A或

吸收光譜A

C

max第3節(jié)顯色反響及其影響因素顯色反響：在光度分析中，將無色或淺色的待測(cè)組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩x子或絡(luò)合物的反響有機(jī)物質(zhì)官能團(tuán)強(qiáng)吸收直接測(cè)定UV-VIS官能團(tuán)弱吸收衍生化反響UV-VIS顯色反應(yīng)無機(jī)物質(zhì)通常通過顯色反響生成吸光系數(shù)大的有色物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，以提高靈敏度332+桔紅色

max鄰二氮菲顯色劑：與被測(cè)組分生成有色化合物的試劑

1、對(duì)顯色反響的要求1、顯色反響的靈敏度要高，其摩爾吸收系數(shù)應(yīng)比較大。2、顯色反響的選擇性要高3、有色化合物的組成要恒定，化學(xué)性質(zhì)要穩(wěn)定4、比照度要大，即有色化合物與顯色劑之間的顏色差異應(yīng)盡可能大。一般要求有色化合物與顯色劑的最大吸收波長(zhǎng)之差應(yīng)大于60nm。5、顯色過程要易于控制。重現(xiàn)性2、顯色劑無機(jī)顯色劑有機(jī)顯色劑a.磺基水楊酸屬于OO型螯合劑，主要用于測(cè)定Fe3+

酸度不同，絡(luò)合物配比不同，顏色也不同b.丁二酮肟屬于NN型螯合劑，主要用于測(cè)定Ni2+

形成紅色絡(luò)合物c.1,10-鄰二氮菲屬于NN型螯合劑，主要用于測(cè)定Fe2+

形成橘紅色絡(luò)合物e.偶氮胂Ⅲ〔鈾試劑Ⅲ〕屬于偶氮類螯合劑，主要用于測(cè)定Th(Ⅳ)、Zr(Ⅳ)、U(Ⅳ)等d.二苯硫腙屬于含S顯色劑，主要是萃取光度法測(cè)定Cu2+、Pb2+、Zn2+、Cd2+、Hg2+等的試劑f.鉻天青S

屬于三苯甲烷類螯合顯色劑，主要用于測(cè)定Al3+g.結(jié)晶紫屬于三苯甲烷類堿性染料，主要用于測(cè)定Tl3+混配化合物由一種金屬離子與兩種不同配體通過共價(jià)鍵結(jié)合成的三元絡(luò)合物3、多元絡(luò)合物b.離子締合物金屬離子先與配體形成絡(luò)陰離子或絡(luò)陽離子，再與帶反電荷的離子生成離子締合物由三種或三種以上的組分所形成的絡(luò)合物，目前應(yīng)用較多的是三元絡(luò)合物c.金屬離子-配體-外表活性劑體系二、影響顯色反響的因素1、反響體系的酸度2、顯色劑的用量3、顯色反響時(shí)間4、顯色反響溫度5、溶劑6、溶液中共存離子的影響1、酸度的選擇酸度的影響影響顯色劑的平衡濃度和顏色

M+nR=MRnOH-H+影響被測(cè)組分的存在狀態(tài)

RH

=R-+H+

1

2影響絡(luò)合物的組成

例，磺基水楊酸–Fe3+pH=1.8~2.5FeR紫紅色pH=4~8FeR2棕褐色pH=8~11.5FeR3黃色酸度的選擇理論計(jì)算以作圖可得適宜pH范圍實(shí)際工作中，作A~pH曲線，尋找適宜pH范圍。ApHM+nR=MRnOH-H+2、顯色劑的用量M+nR=MRn定量反響實(shí)際工作中，作A~CR

曲線，尋找適宜CR范圍。ACR3、溫度的選擇實(shí)際工作中，作A~T曲線，尋找適宜反響溫度。ATATATATAT4、反響時(shí)間的選擇實(shí)際工作中，作A~t曲線，尋找適宜反響時(shí)間。5．溶劑提高靈敏度、反響速率，影響溶解度、組成6．溶液中共存離子的影響第4節(jié)吸光光度分析及誤差控制測(cè)量波長(zhǎng)的選擇無干擾，選擇

max有干“吸收最大，干擾最小〞的原那么擾，A

A

待測(cè)溶液吸光度的選擇控制A=0.2~0.8方法選擇c選擇b1、非單色光影響小2、靈敏度高一、測(cè)量條件的選擇參比液的選擇原那么：扣除非待測(cè)組分的吸收以顯色反響為例進(jìn)行討論M+R=M-R

max試液 顯色劑溶劑吸光物質(zhì)參比液名稱及組成無吸收無吸收光學(xué)透明溶劑參比溶劑基質(zhì)吸收無吸收

吸收試液參比不加顯色劑的試液無吸收吸收

吸收試劑參比不加試液的溶液基質(zhì)吸收吸收吸收吸收退色參比顯色劑+試液+

待測(cè)組分的掩蔽劑假設(shè)欲測(cè)M-R的吸收

maxA〔樣〕=A〔待測(cè)吸光物質(zhì)〕+A〔干擾〕+A〔池〕A〔參比〕=A〔干擾〕+A〔池〕目的：消除由于吸收池壁及溶劑、試劑對(duì)入射光的反射和吸收帶來的誤差，并可扣除干擾的影響二、吸光光度分析的方法微量組分的分析單組分的測(cè)定純物質(zhì)或共存物質(zhì)不干擾1、標(biāo)準(zhǔn)比較法A=εbcsA=εbcx2、標(biāo)準(zhǔn)曲線法〔工作曲線法〕橫坐標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度〔參加體積〕ACs縱坐標(biāo)：相應(yīng)的吸光度cs與cx相近多組分的測(cè)定解聯(lián)立方程法A

XY

1

2根據(jù)加合性原那么解聯(lián)立方程，可求得Cx,Cy

為物質(zhì)的特征參數(shù)，可通過配制標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)得。ACs(x)三、對(duì)朗伯-比耳定律的偏離主要原因非單色光吸光質(zhì)點(diǎn)的相互作用負(fù)誤差正誤差介質(zhì)不均勻引起的偏離1、非單色光引起的對(duì)吸光定律的偏離對(duì)吸收光譜而言，b和c固定，反映了

隨波長(zhǎng)變化的情況，單一波長(zhǎng)，

固定；不同波長(zhǎng)，

不同。因此，非單色光將導(dǎo)致對(duì)吸光定律的偏離。A或

12在實(shí)際工作中，入射光通常具有一定的帶通。為了防止非單色光帶來的影響，一般選用峰值波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。1對(duì)應(yīng)的

1較小2對(duì)應(yīng)的

2較大選用峰值波長(zhǎng)，也可以得到較高的靈敏度。2、吸光質(zhì)點(diǎn)間相互作用引起的對(duì)吸光定律的偏離質(zhì)點(diǎn)間的靜電作用質(zhì)點(diǎn)間的締合作用質(zhì)點(diǎn)間的化學(xué)反響例，聚合引起的對(duì)吸光定律的偏離單體：2

max=660nm二聚體：

max=610nmAC

max=660nmA

660nm610nm化學(xué)反響的影響M+L=ML

max吸光定律光度法測(cè)定通常在一個(gè)較大的濃度范圍內(nèi)作工作曲線，當(dāng)′或隨著濃度的變化而變化，或隨著副反響的變化而變化時(shí)，就表現(xiàn)出對(duì)吸光定律的偏離。實(shí)際計(jì)算四、消除干擾的方法

1、控制溶液酸度2、參加掩蔽劑3、改變干擾離子的價(jià)態(tài)4、利用參比溶液消除顯色劑和某些共存有色離子的干擾6、選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)7、別離干擾離子5、增加顯色劑用量五、吸光度測(cè)量的誤差吸光度標(biāo)尺刻度是不均勻的光度計(jì)中透光度的標(biāo)尺刻度是均勻的透光度讀數(shù)誤差△T約為±0．01A=εbcdA=εbdcdc為測(cè)量結(jié)果c的測(cè)量誤差dA為測(cè)量吸光度A時(shí)的測(cè)量誤差A(yù)=－lgT=－0.434lnTT在15%-65％〔吸光度A在之間〕，測(cè)量的相對(duì)誤差較小。T=36.8％或A=0.434時(shí)，測(cè)量結(jié)果的相對(duì)誤差最小。第5節(jié)其他吸光光度法高濃度示差吸光光度法1、根本原理常規(guī)法以空白溶劑為參比示差法以濃度為Cs的標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比A△C△CxA′〔Cx>Cs〕適宜高

濃度的測(cè)定思考：（Cx

Cs）時(shí)情況怎樣？2、示差法的誤差方法定量原理相對(duì)誤差常規(guī)法示差法∴Tr>Tx∵I0>Is有結(jié)論：示差法提高了準(zhǔn)確度例題例題dT=0.01,樣品Tx=2.00%,標(biāo)準(zhǔn)Ts=10.0%示差法常規(guī)法誤差示差法誤差示差法提高準(zhǔn)確度的實(shí)質(zhì)常規(guī)法TxT051050100

落在測(cè)量誤差較大的范圍高濃度示差法T051050100TrTsTs

落在測(cè)量誤差較小的范圍示差法通過改變儀器的定位使透射率的刻度標(biāo)尺讀數(shù)擴(kuò)展示差法通過提高測(cè)量的準(zhǔn)確度提高了方法的準(zhǔn)確度結(jié)論：雙波長(zhǎng)分光光度法光源單色器單色器檢測(cè)器切光器狹縫吸收池

不需空白溶液作參比；但需要兩個(gè)單色器獲得兩束單色光(λ1和λ2)；以參比波長(zhǎng)λ2處的吸光度Aλ2作為參比，來消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復(fù)雜試樣時(shí)顯示出很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性、測(cè)量精密度等方面都比單波長(zhǎng)法有所提高。

雙波長(zhǎng)分光光度法21A

XY∵∴Y

的存在不干擾

X的測(cè)定

因只用一個(gè)吸收池，而且以試液本身對(duì)某一波長(zhǎng)的光的吸光度為參比，因此，消除了因試液與參比液及兩個(gè)吸收池之間的差異所引起的測(cè)量誤差，提高了測(cè)量的準(zhǔn)確度。選擇波長(zhǎng)組合λ1、λ2的根本要求：1、選定的波長(zhǎng)λ1和λ2處干擾組分應(yīng)具有相同吸光度，即：ΔAy=ΔAyλ2－ΔAyλ1=0故：ΔAx+y=ΔAx=(εxλ2－εxλ1)bcx此時(shí)：測(cè)得的吸光度差ΔA只與待測(cè)組分x的濃度呈線性關(guān)系，而與干擾組分y無關(guān)。假設(shè)x為干擾組分，那么也可用同樣的方法測(cè)定y組分。

可采用作圖法選擇符合上述兩個(gè)條件的波長(zhǎng)組合。2、在選定的兩個(gè)波長(zhǎng)λ1和λ2處待測(cè)組分的吸光度應(yīng)具有足夠大的差值。導(dǎo)數(shù)分光光度法

在雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)上，如果使用的兩個(gè)波長(zhǎng)很接近，進(jìn)行同時(shí)掃描，并保持兩波長(zhǎng)差不變，便可獲得一階導(dǎo)數(shù)光譜。導(dǎo)數(shù)光譜：吸光度隨波長(zhǎng)變化率對(duì)波長(zhǎng)的曲線n階導(dǎo)數(shù)1、能夠分辨兩個(gè)或兩個(gè)以上嚴(yán)重重疊的吸收峰

2、能夠分辨吸光度隨波長(zhǎng)急劇上升處所掩蓋的弱吸收峰

3、能夠確認(rèn)寬闊吸收帶的最大吸收波長(zhǎng)

導(dǎo)數(shù)光譜譜帶比原吸收光譜窄，減少了與干擾譜帶交迭的可能性，提高了抗干擾能力。導(dǎo)數(shù)光譜可去除背景干擾，提高分別率。

導(dǎo)數(shù)分光光度法在多組分同時(shí)測(cè)定、渾濁樣品分析、消除背景干擾、加強(qiáng)光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)以及復(fù)雜光譜的辨析等方面，顯示了很大的優(yōu)越性。導(dǎo)數(shù)分光光度法定量分析的理論根底：1、峰-谷法2、基線法3、峰-零法測(cè)量導(dǎo)數(shù)光譜峰值的方法：第六節(jié)吸光光度法的應(yīng)用一、痕量金屬分析二、臨床分析三、食品分析(酶聯(lián)免疫法)四、其他應(yīng)用弱酸和弱堿解離常數(shù)的測(cè)定

設(shè)某波長(zhǎng)下，HB和B-都有吸收，b=1cm，根據(jù)吸光度的加和性：在高酸度時(shí)，弱酸幾乎以HB形式存在：在強(qiáng)堿性時(shí)，弱酸幾乎以B-形式存在：∴

絡(luò)合物的組成的測(cè)定摩爾比法測(cè)絡(luò)合比〔飽和法〕M+nR=MRnCM,固定；CR,從0開始增大在特定波長(zhǎng)測(cè)定

R=0,

M=0,

MRn>0ACR/CMn

R>0,

M>0,

MRn=0ACR/CMn等摩爾連續(xù)變化法〔Job〕測(cè)絡(luò)合比M+nR=MRnCM+CR=常數(shù)CM/C從0→1在特定波長(zhǎng)測(cè)定

R=0,

M=0,

MRn>000.51.0ACM/C0.33n=1,CM/C=0.5n=2,CM/C=0.3300.51.0ACM/C

R>0,

M>0,

MRn=0填空1、苯酚在水溶液中摩爾吸收系數(shù)ε為6.17×103moL/L，假設(shè)要求使用1cm吸收池時(shí)的透光度為0.15～0.65，那么苯酚的濃度應(yīng)控制在2、多組分分光光度法可用解聯(lián)立方程的方法求得各組分的含量，這是基于3、在紫外可見分光光度計(jì)中，在可見光區(qū)使用的光源是燈；用的棱鏡和比色皿的材質(zhì)可以是；而在紫外光區(qū)使用的光源是