男性精液分析技術(shù)新進(jìn)展課件

1男性精液分析技術(shù)新進(jìn)展WHO5th主要內(nèi)容精液分析標(biāo)準(zhǔn)程序可選擇性實驗研究性實驗精子制備精子制備精子冷凍質(zhì)量保證附錄WHO5th主要內(nèi)容精液分析：標(biāo)準(zhǔn)程序：精液采集和初步肉眼觀察、精子濃度和精子總數(shù)的測定、精子活力分級、精子形態(tài)學(xué)評估、非精子成分可供選擇的試驗：多重精子缺陷指數(shù)、WBC免疫細(xì)胞化學(xué)染色、精子宮頸粘液相互作用、精漿生化、CASA研究實驗：活性氧、頂體反應(yīng)、精子卵細(xì)胞相互作用、精子透明帶結(jié)合、去透明帶倉鼠卵穿透試驗、精子染色質(zhì)檢測WHO5th主要內(nèi)容精子制備：精子制備技術(shù)：精子的洗滌、直接上游法、非連續(xù)密度梯度法精子冷凍保存：冷凍方法、保護(hù)劑配制質(zhì)量保證：內(nèi)部質(zhì)量控制外部質(zhì)量控制附錄：參考值、生物安全、質(zhì)控圖的使用等精子濃度和精子總數(shù)的測定精子濃度精子密度改為精子濃度增加計數(shù)池的面積，每份標(biāo)本均采用兩次取樣、兩次稀釋和兩次計數(shù)，每次計數(shù)至少200個精子，且兩次計數(shù)在95%可信區(qū)間精子總數(shù)：強(qiáng)調(diào)一次射精的精子總數(shù)能夠反映睪丸生精功能，因次必須準(zhǔn)確測定精液的體積5精子濃度和精子總數(shù)的測定

年輕人老年人

差異精子濃度(106/ml) 73 64 NS精液量(ml) 3.2 1.8 P<0.05

精子數(shù)量(106/總數(shù))206 74 P<0.05

Ngetal.2004精液體積的測量推薦：稱重后按1.0g/ml比重?fù)Q算為體積（1.043-1.102g/ml）

精液體積的測量XXX不推薦的方法：在收集管（杯）中轉(zhuǎn)移對顯微鏡的要求精子濃度和活力必須使用相差顯微鏡無論是手工方法還是CASA都要求使用20倍正相差物鏡下精子圖像精子計數(shù)的要求推薦使用改良牛鮑氏計數(shù)板制備兩份分別稀釋的樣本不能將同一份稀釋樣本加入到兩個計數(shù)池內(nèi)不要兩次計數(shù)同一計數(shù)池精子計數(shù)的要求只對完整精子（包括頭和尾）進(jìn)行計數(shù)以精子頭部位進(jìn)行計數(shù)，尾的定向不重要，方格的邊界由三線的中間線標(biāo)明，計數(shù)精子頭的大部分位于兩條內(nèi)線之間，而并非大部分頭部在兩條外線之間為避免相鄰方格內(nèi)的同一精子的重復(fù)計數(shù)，頭部位于劃分兩個相鄰方格線上的精子，應(yīng)只計兩條垂直界線之一上的精子。例如，精子大部分的頭部位于L型，中央界線或在其左邊的，可計數(shù)，而中央界線上方或右邊的不予計數(shù)精子計數(shù)的質(zhì)控要求每份標(biāo)本重復(fù)取樣2次，分別計數(shù)200個精子，計數(shù)結(jié)果符合要求的，結(jié)果可以接受（取兩次的均值）超過誤差范圍的必須重新取樣重復(fù)計數(shù)2次對于一定總數(shù)兩個重復(fù)計數(shù)可接受的差異p32頁精子計數(shù)可接受誤差的應(yīng)用例1:第1個計數(shù)池計數(shù)201個精子第2個計數(shù)池計數(shù)245個精子兩次總數(shù)為201+245=446兩次計數(shù)差為245-201=44查表總數(shù)為446時，預(yù)期隨機(jī)誤差不能超出41所以需要重新制備稀釋標(biāo)本重新進(jìn)行計數(shù)精子計數(shù)可接受誤差的應(yīng)用例2：第1個計數(shù)池計數(shù)220個精子第2個計數(shù)池計數(shù)218個精子兩次總數(shù)為220+218=438兩次計數(shù)差為220-218=2查表總數(shù)為438時，預(yù)期隨機(jī)誤差不能超出41所以計數(shù)的數(shù)值是可以接受的，即取二者的均值計算精子濃度低精子濃度標(biāo)本的計數(shù)精子濃度過低，需要檢測更多個視野如果每高倍鏡視野精子數(shù)小于4個，可不考慮精確計數(shù)，給出濃度約小于1×106/ml即可活力的分類精子活力的分級：前向運(yùn)動精子（PR）：精子運(yùn)動活躍、線性運(yùn)動或者在較大的范圍內(nèi)運(yùn)動,不考慮運(yùn)動的速度非前向運(yùn)動精子（NP）：精子運(yùn)動但不活躍，如精子在較小的范圍內(nèi)運(yùn)動，精子頭部輕微移位或僅有鞭毛擺動不運(yùn)動精子（IM）：精子完全不動精子活力分析的質(zhì)控每份標(biāo)本重復(fù)取樣2次，每次至少計數(shù)200個精子，以常見活力類型為評價對象，結(jié)果符合要求的，可以接受（取2次的均值）超出誤差范圍的重新取樣2次重復(fù)分析重復(fù)計數(shù)200個精子（總數(shù)400）確定平均值的兩個百分率之間的可接受差異p19頁精子活力分析百分比的計算要求百分比要調(diào)整為最接近的整數(shù)若百分比是0.5%則將其調(diào)整至最接近的偶數(shù)，如將32.5%調(diào)降至32%，而將3.5%調(diào)升至4%這些四舍五入成的百分比全部加起來可能不等于100%精子活力分析可接受誤差的應(yīng)用例1：重復(fù)計數(shù)200個精子評估精子的活力結(jié)果如下：PR型精子分別是30%和50%NP型精子是5%和15%IM型精子是65%和35%最常見活力級別是IM型，均值為50%，差值是30%在均值為50%的情況下，隨機(jī)誤差的上限是10%，得出的差異超出10%，應(yīng)需重新制作兩份標(biāo)本進(jìn)行評估21精子活力分析可接受誤差的應(yīng)用例2：重復(fù)計數(shù)200個精子評估精子的活力結(jié)果如下：PR精子分別占37%和28%NP精子分別占3%和6%IM精子分別占60%和66%最常見活力級別是IM型，均值為63%，差值是6%在均值為63%時，隨機(jī)誤差上限是10%，結(jié)果是可接受的報告結(jié)果如下：運(yùn)動型精子占32%，非運(yùn)動型精子占4%，完全不動型精子占63%（構(gòu)成比不到100%）精子形態(tài)分析推薦使用Papanicolaou、shorr或Diff-Quik染色每份標(biāo)本制備雙份涂片進(jìn)行重復(fù)分析每張涂片至少分析200個精子兩次分析結(jié)果的差異在允許范圍內(nèi)的，最終結(jié)果取兩次的均值；超出允許范圍的需要重新讀片（不必重新制片）23精子形態(tài)學(xué)評估標(biāo)準(zhǔn)精子包括頭、頸、中段、主段和末端由于通過光學(xué)顯微鏡很難觀察到精子末端，因此可以認(rèn)為細(xì)胞是由頭（和頸）和尾（中段和主段）組成只有頭和尾都正常的精子才認(rèn)是正常的所有處于臨界狀態(tài)的精子均認(rèn)為是異常人類精子結(jié)構(gòu)圖精子形態(tài)學(xué)評估標(biāo)準(zhǔn)由于人精子形態(tài)的多樣性，造成精子形態(tài)評估的困難。精子形態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)是從性交后宮頸粘液回收的精子，或者從卵子透明帶回收的精子來定義的，這樣的精子具有潛在受精能力在評估精子正常形態(tài)時應(yīng)采用嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)（Krugeretal.,1986;Menkveldetal.,1990;Coetzeeetal.,1998）精子形態(tài)學(xué)評估標(biāo)準(zhǔn)（a，b）在體外從透明帶中回收的精子（c）性交后從宮頸內(nèi)粘液中收集的精子，用巴氏染色法染色精子形態(tài)學(xué)分析包括以下步驟精液涂片的制備固定和染色封片精子形態(tài)評估（應(yīng)制備雙份涂片重復(fù)評估，每張涂片應(yīng)評估至少200個精子）雙份片評估（百分率）結(jié)果比較（差異是否在可接受范圍內(nèi)，如果不可接受，重新讀片）取平均值，報告結(jié)果精液涂片的制備充分混勻精液樣本?？焖偃?，避免精子從混懸的精液樣本中沉降。重復(fù)取樣前，再次混勻精液樣本。根據(jù)精液樣本具體不同情況，采用不同的涂片方式。（a）對于未稀釋的精液，采用拉薄技術(shù)，將一滴精液（S）沿成角的載玻片背側(cè)邊緣展開，向前拖拉制成涂片。（b）對于洗滌的精液，采用滴管法，水平持滴管（P）推進(jìn)，將一滴精子懸液（SS），沿載玻片的表面展開。正常精液標(biāo)本使用拉薄技術(shù)，取一滴精液在載玻片的表面上涂片。磨砂載玻片的兩面，用不起毛軟紙擦干凈。用HB或No.2鉛筆，在載玻片的磨砂處標(biāo)記上身份編號、日期。根據(jù)精子密度，取5-10μl的精液滴在載玻片的一端。用第二張載玻片作為拉片，沿著載玻片的表面拖拉精液滴。涂片經(jīng)空氣干燥后，立即固定、染色。

一開始，可以用10μl的精液，45°角度，一秒鐘的時間涂片為了減少涂片上精子間的相互重疊，如果需要，可以改變上述參數(shù)（10μl，45°，1秒）精液的粘稠度越低，涂片的拉薄技術(shù)發(fā)揮得越好，拉薄技術(shù)不適用于高度粘稠的精液拉薄技術(shù)精子密度低的標(biāo)本假如精子密度低于2×106/ml，濃縮標(biāo)本粘稠精液標(biāo)本精漿高度粘稠時涂片往往是厚而不均，可以按與液化不良精液標(biāo)本相同的處理方法或者使用洗滌的方法處理。

染色方法推薦的染色方法有Papanicolaou染色法Shorr染色法Diff-Quik染色法。用上述三種染色方法，在光學(xué)顯微鏡亮視野下觀察，精子頭部的頂體區(qū)染成淡藍(lán)色paleblue，頂體后區(qū)染成深藍(lán)色darkblue，中段可能染成紅色，尾部染成藍(lán)色或淡紅色reddish。通常位于頭部背后或中段周圍的胞漿小滴染成粉紅色、紅色（巴氏染色）或者橘紅色（Shorr染色）。改良巴氏染色步驟1、80%乙醇30秒2、50%乙醇30秒3、純水30秒4、Harris蘇木精4分鐘5、純水30秒6、酸性乙醇4—8次*7、流水洗5分鐘8、50%乙醇30秒9、80%乙醇30秒10、95%乙醇至少15分鐘11、橙黃G61分鐘12、95%乙醇30秒13、95%乙醇30秒14、95%乙醇30秒15、EA-501分鐘16、95%乙醇30秒17、95%乙醇30秒18、100%乙醇15秒19、100%乙醇15秒主要溶液的作用乙醇固定細(xì)胞；并且使細(xì)胞脫水蘇木精使細(xì)胞核染成藍(lán)色酸性乙醇去除胞漿中非特定區(qū)域的染料（脫色）自來水去除未與細(xì)胞核結(jié)合的蘇木精橙黃G-6

使胞漿染成粉紅色EA-50

使胞漿染成粉紅色WHO第4版與第5版巴氏染色主要步驟比較內(nèi)容WHO第4版WHO第5版總步驟：23步19步固定液：95%乙醇+95%乙醚95%乙醇濃度梯度：80%、70%、50%80%、50%50%、70%、80%、90%（10秒）50%、80%、95%(15分）蘇木精時間：3分4分橙黃G6時間：2分1分EA-50時間：5分1分酒精浸入時間：各10次各30秒1、第5版共19步，第4版共23步，減少了4個步驟。2、由于蘇木精后沒有流水沖洗，導(dǎo)致染液殘留較多，酸性乙醇的更換頻率明顯增加。3、第5版染色所需時間較4版約增加10分鐘以上。4、染色效果相似。WHO第4版與第5版巴氏染色總結(jié)WHO第4版與第5版染色效果比較WHO第4版WHO第5版精子封片前的處理有兩種液體封片劑：溶于乙醇的和不溶于乙醇。使用溶于乙醇的封片劑，染色完成后，在涂片未干的情況下立即使用該封片劑進(jìn)行封片。使用不溶于乙醇的封片劑，將涂片在二甲苯中浸1分鐘（在通風(fēng)柜中操作），瀝干1-2秒鐘后立即封片，封片時應(yīng)保持涂片的濕潤。精子涂片的封片1、滴2-3小滴封片劑在載玻片上。2、將蓋玻片（24mm×50mm或24mm×60mm最合適）直接放置在載玻片上。3、蓋玻片先接觸封片劑，從載玻片的長邊開始放置，以防止產(chǎn)生氣泡。4、如有需要，輕輕地按壓蓋玻片的頂端以使氣泡移到載玻片的邊緣。5、擦掉載玻片底下多余的二甲苯（如果使用二甲苯）。6、在通風(fēng)柜內(nèi)，把已封片的涂片水平地放在載玻片烘干架上，或者放在吸水紙上干燥24小時。篇幅染色方法觀察方法參考值第一版10頁改良勃－利二氏染色巴氏染色顯微鏡40倍物鏡下觀察80.5±19.4%第二版13頁吉姆薩染色改良巴氏染色勃－利二氏染色相差顯微鏡40倍物鏡下觀察；也可用100倍油鏡，明視野觀察50％第三版13頁濕片法吉姆薩染色改良巴氏染色勃－利二氏染色Shorr染色×100油鏡亮視野觀察濕片法30％第四版15頁改良巴氏染色Shorr染色Diff－Quik法×100油鏡亮視野及至少×10的目鏡下觀察*15％第五版49頁改良巴氏染色Shorr染色Diff－Quik法×100油鏡亮視野及至少×10的目鏡下觀察4％（下限）WHO不同版本精子形態(tài)學(xué)內(nèi)容比較精子頭部判斷標(biāo)準(zhǔn)分類WHO第5版WHO第4版正常標(biāo)準(zhǔn)精子頭外形上應(yīng)該光滑、輪廓規(guī)則，大體上呈橢圓形；長度95%可信限區(qū)間為3.7-4.7um；寬度95%可信限區(qū)間為2.5-3.2um；長寬比95%可信限區(qū)間為1.3-1.8頂體界限清晰，占頭部的40%-70%精子頭的形狀必須是橢圓形的，長度為4.0～5.0μm;寬為2.5～3.5μm；長寬比為1.50～1.75之間頂體界限清晰，占頭部的40%-70%異常標(biāo)準(zhǔn)有空泡的頭（超過2個空泡）或（未染色的空泡區(qū)域占頭部的20%以上）頂體后區(qū)有空泡頂體過小或頂體過大的頭（小于頭部的40%或大于頭部的70%）有空泡的頭（未染色的空泡區(qū)域占頭部的20%以上）頂體過小頭（小于頭部的40%）頂體過大頭（大于頭部的70%）WHO第5版與第4版精子形態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)比較精子頸和中段判斷標(biāo)準(zhǔn)分類WHO第5版WHO第4版正常標(biāo)準(zhǔn)中段應(yīng)細(xì)，規(guī)則，大約與頭部長度相等，并且主軸與頭部長軸一致；長度95%可信限區(qū)間為3.3-5.2um寬度95%可信限區(qū)間為0.5-0.7um中段應(yīng)細(xì)，大約為頭部長度的1.5倍，并且在軸線上緊貼頭部寬度＜1μm異常標(biāo)準(zhǔn)缺陷包括：頸部急劇彎曲中段非對稱地接在頭部、粗的或不規(guī)則的中段、異常細(xì)的中段以及上述缺陷的任何組合缺陷包括：頸部“彎曲”（頸和尾形成的角度大于頭部長軸的90％）中段非對稱地接在頭部、粗的或不規(guī)則的中段、異常細(xì)的中段以及上述缺陷的任何組合WHO第5版與第4版精子形態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)比較精子主段判斷標(biāo)準(zhǔn)分類WHO第5版WHO第4版正常標(biāo)準(zhǔn)主段應(yīng)是直的，均一的，比中段細(xì)，其長約45μm。主段應(yīng)是直的，均一的，比中段細(xì)，非卷曲的，其長約為45μm異常標(biāo)準(zhǔn)主段缺陷包括：短、多尾、發(fā)卡形、斷裂主段急劇彎曲、主段寬度不規(guī)則、主段卷曲以及上述缺陷的任何組合

主段缺陷包括：短、多尾、發(fā)卡形、斷裂主段彎曲（＞90度）、主段寬度不規(guī)則、主段卷曲以及上述缺陷的任何組合精子胞漿小滴判斷標(biāo)準(zhǔn)胞漿小滴體積小于精子頭部的1/3（大于1/3過量殘留胞漿）胞漿小滴體積小于精子頭部的1/3WHO第5版與第4版精子形態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)比較WHO第5版與第4版精子形態(tài)學(xué)評估標(biāo)準(zhǔn)的主要區(qū)別1、頭部外形輪廓判斷變的寬松，僅要求大致成橢圓形。2、對頭部空泡的判斷更嚴(yán)格，多于2個空泡或者頂頭后區(qū)空泡，都判斷為異常。3、中段的長度有原來頭部的1.5倍縮短為1倍，并且寬度比第4版要更細(xì)。4、尾部只有尖銳的折角才判斷為異常，而不再以彎曲角度90度為界限。5、胞漿小滴的標(biāo)準(zhǔn)無差異。WHO第5版手冊中的精子圖譜分析424個細(xì)胞精子：364個正常：93個異常：254個未評估：17個非精子：58個頭部異常：201個中段異常：134個尾部異常：35個胞漿小滴：12個未分類：2個備注：1、第4版圖譜中僅評估47個精子，其中正常精子8個，異常精子39個2、未評估：由于聚焦不好或精子重疊。3、非精子細(xì)胞包括：巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、降解的白細(xì)胞、上皮細(xì)胞、細(xì)菌等共14Plate形態(tài)圖片的評估注釋的進(jìn)一步說明頭部形狀（8）梨形頭部形狀（見插圖2.13b）圓形頭部形狀（見插圖2.13c）側(cè)視精子精子直立時的側(cè)面形狀小頭頭部尺寸扁平底精子頭不是橢圓面作底部錐形頭部形狀（見插圖2.13a）不定形頭部形狀（見插圖2.13d）大頭針狀不認(rèn)為是精子，無染色體頂體（3）頂體＜40％頂體面積小于精子頭部的40％頂體＞70％頂體面積大于精子頭部的70％無頂體頂體缺失空泡（3）vac空泡＞2vac大于2個空泡PAvac頂體后區(qū)有空泡胞漿滴（2）細(xì)胞漿細(xì)胞漿的額外殘留，或者胞漿小滴，根據(jù)大小判斷＞1/3異常的胞漿小滴（大于頭部的1/3）（ERC）＜1/3正常的胞漿小滴（小于頭部的1/3）（CD）CD胞漿小滴ERC過量殘留的細(xì)胞漿（見插圖2.13n）中段和主段（8）彎曲不自然的折角（見插圖2.13g和e）卷曲明顯易判的異常雙尾明顯易判的異常插入尾部插入的位置位于頭部長軸的一側(cè)輪廓不規(guī)則外形輪廓不規(guī)則環(huán)狀尾部彎曲成環(huán)狀粗明顯易判的異常太長明顯易判的異常細(xì)胞（9）桿菌細(xì)菌退化的白細(xì)胞明顯易判的異常退化的精子細(xì)胞明顯易判的異常巨噬細(xì)胞白細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞單核細(xì)胞無顆粒白細(xì)胞上皮細(xì)胞來自男性泌尿生殖管道精子細(xì)胞未成熟的生殖細(xì)胞精母細(xì)胞未成熟的生殖細(xì)胞多核型白細(xì)胞多核型白細(xì)胞未分類的未評估（2）由于精子重疊或者聚焦不清楚重疊頭部被尾部遮擋聚焦難以聚焦（未評估）其他異常明顯易判的異常缺陷明顯易判的異常正常類似在宮頸粘液中找到的精子ifPPOK不是在所有的照片中都能看到精子的尾部（如果不包括尾部，其他部分是正常的，那么該精子可以被認(rèn)為是正常精子）精子形態(tài)學(xué)評估正常形態(tài)精子百分率與受精率相關(guān)異常形態(tài)精子的類型、部位和程度更重要1、頭部外形對于頭部異常的描述梨形錐形扁平底輪廓不規(guī)則

大頭針樣無定形頭小頭圓頭2、空泡多于2個空泡頂體后區(qū)空泡表面有空泡空泡>20%3、頂體頂體>70%

頂體<40%

對于頭部異常的描述

對于頸和中段異常的描述

增粗輪廓不規(guī)則插入彎曲1、中段異常2、胞漿小滴胞滴小于1/3（CD）胞滴大于1/3(ERC)

對于尾部異常的描述

雙尾環(huán)狀卷曲短尾粗彎曲非精子細(xì)胞（一）退化的巨噬細(xì)胞多核型白細(xì)胞上皮細(xì)胞

桿菌單核細(xì)胞吞噬中的巨噬細(xì)胞退化的白細(xì)胞巨噬細(xì)胞

精子細(xì)胞生精細(xì)胞精母細(xì)胞

分裂中的精母細(xì)胞分裂中的精子細(xì)胞退化的精子細(xì)胞

非精子細(xì)胞（二）未評估精子難以聚焦重疊

未分類細(xì)胞

重復(fù)計數(shù)200個精子（精子總數(shù)400）得出的兩個百分率平均后可接受的差異68精子形態(tài)分析可接受誤差的應(yīng)用例1：重復(fù)計數(shù)200個精子后，正常形態(tài)精子百分比分別為18%和9%均值為14%，差值為9%查表可見均值為14%，樣本誤差允許范圍為7%本次評估誤差超出7%，需要重新評估69精子形態(tài)分析可接受誤差的應(yīng)用例2：重復(fù)計數(shù)200個精子后，正常形態(tài)精子百分比分別為10%和14%均值為12%，差值為4%查表均值為12%，樣本誤差允許范圍為7%本次評估樣本誤差低于7%，本次評估值可接受，均值12%出報告70精液參數(shù)采用3大洲8個國家的400-1900份一年內(nèi)使女方受孕的男性精液標(biāo)本的原始數(shù)據(jù)在統(tǒng)計方面，由于各項精液參數(shù)的高值都不可能對生育產(chǎn)生危害，所以采用單側(cè)參考區(qū)間，并以第5百分位數(shù)作為參考下限，不像一般統(tǒng)計學(xué)分析那樣采用雙側(cè)參考區(qū)間和第2.5百分位數(shù)參考值區(qū)間雙側(cè)：血清2.5%---------95%----------2.5%單側(cè)：精液5.0%-------------------------95%

WHO5手冊精液參考值下限參數(shù)參考值下限精液體積（ml）1.5（1.4-1.7）精子總數(shù)（106/次射精）39（33-46）精子濃度（106/ml）15（12-16）總活動率（PR+NP，%）40（38-42）前向活動率（PR，%）32（31-34）存活率（存活精子，%）58（55-63）精子形態(tài)學(xué)（正常形態(tài)，%）4（3.0-4.0）精液參數(shù)其他參數(shù)pH≥7.2過氧化物酶陽性白細(xì)胞（106/ml）<1.0MAR試驗（附著粒上的活動精子%）<50免疫珠試驗（附著珠上的活動精子%）<50精漿鋅（μmol/射精）≥2.4精漿果糖（μmol/射精）≥13精漿中性葡糖苷酶（mU/射精）≥20關(guān)于WHO5使用中的思考精子計數(shù)分析“精子密度”改為“精子濃度”表達(dá)更準(zhǔn)確密度的概念為每單位體積物質(zhì)的質(zhì)量，濃度的概念是單位體積內(nèi)物質(zhì)的個數(shù)，所以用“精子濃度”最為恰當(dāng)因此應(yīng)該用“spermconcentration”，代替“spermdensity”來表示精子濃度75關(guān)于WHO5使用中的思考精子計數(shù)工具《WHO5》推薦血球計數(shù)池作為精子的計數(shù)工具，但CASA在我國使用率高達(dá)80%血球計數(shù)池為一開放池，有一定深度，計數(shù)時樣本稀釋，分析過程受周圍環(huán)境條件、加樣、分析時間、水分蒸發(fā)等影響，分析結(jié)果偏高《WHO5》未考慮和評價男科實驗室廣泛應(yīng)用的Makler、Macro、Microcell、cell-vu等使用更加方便76關(guān)于WHO5使用中的思考精子計數(shù)分析《WHO5》精子濃度分析方法和參考值下調(diào)的推薦，精子濃度參考值的確定，應(yīng)考慮地區(qū)、種族、環(huán)境、氣候、季節(jié)采樣時間的差異。占世界人口1/5的中國未參加調(diào)查(張樹成教授課題）精子總數(shù)的意義比精子濃度更為重要，我國并未引起重視77關(guān)于WHO5使用中的思考精液量測定用比重法測量精液比重，麻煩、費時、易污染，不易推廣（科研必用）利用轉(zhuǎn)移量筒測量法，丟失精液可達(dá)0.3-0.9ml有刻度廣口量杯測量精液體積：可行78關(guān)于WHO5使用中的思考精子活力分析WHO5將精子活力4級分級改為了3級，把WHO4中的a級和b級合并為前向運(yùn)動精子（PR),這一合并是沒有考慮精子前向運(yùn)