實驗室大致實驗操作模式課件

紫杉醇前體依賴于MEP途徑合成的分子調(diào)控機理Ⅱ—TcMCT和TcMCS基因的克隆與功能研究植物學專業(yè)碩士研究生楊穎舫指導教師廖志華教授

西南大學生命科學學院2010年6月4日星期六1/6/2024目錄研究內(nèi)容及技術(shù)路線2

研究結(jié)果與分析3

結(jié)論與展望

4

背景概況及目的

1

1/6/2024南方紅豆杉的概況

種名：南方紅豆杉學名：Taxuschinese

別名：刺柏松，紫杉，紫柏松科屬：紅豆杉科、紅豆杉屬保護等級：國家Ⅰ級重點保護野生植物（國務(wù)院1999年８月４日批準）產(chǎn)地分布：產(chǎn)于我國長江流域以南，常生于海拔1000-1200m以下山林中，星散分布.背景概況及目的1/6/2024為什么要研究紅豆杉

世界衛(wèi)生組織（WHO）2008年12月9日發(fā)布報告稱

2010年，癌癥將超越心臟病成為全球頭號殺手。

而吸煙、攝入過多高脂肪食品、人口老齡化以及世界人口持續(xù)增長等因素是造成癌癥患者與日俱增的原因。

WHO預計，在全球范圍內(nèi)，新增癌癥病例和癌癥患者死亡率也將會以每年1％的速度遞增，而在中國、俄羅斯和印度這些國家增長速度會更快。

報告說：“全球癌癥患者在上世紀最后30年里翻了一番，估計這一數(shù)字在2020年前將再翻一番，2030年前將增至上世紀最后30年的3倍?！边@意味著到2030年，全球?qū)⑿略?700萬癌癥病例，死于癌癥的人數(shù)將達到1700萬人。

背景概況及目的1/6/2024紫杉醇一種高效的抗癌藥物紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種四環(huán)二萜化合物,也是目前所了解的一種可以促進微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物。紫杉醇是一種有絲分裂抑制劑，使腫瘤細胞停止在G2期和M期，直至死亡，進而起到抗腫瘤作用。紫杉醇還可調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫功能，對腫瘤細胞起殺傷或抑制作用。通過Ⅱ-Ⅲ臨床研究，紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤有一定療效。

紫杉醇分子式：C47H51NO14

物理性質(zhì)：白色結(jié)晶體粉末。無臭，無味。不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有機溶劑。背景概況及目的1/6/2024

紫杉醇合成研究傳統(tǒng)育種技術(shù)培育紅豆杉栽培品種紫杉醇的化學全合成和半合成分離培養(yǎng)與紅豆杉共生的產(chǎn)紫杉醇微生物利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇利用基因工程遺傳改良周期長效率低步驟長產(chǎn)率低副產(chǎn)物多含量低菌種易衰退產(chǎn)量低（1）紅豆杉離體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的成功，為利用基因工程技術(shù)遺傳改良紅豆杉奠定了良好的實踐基礎(chǔ)；（2）把植物次生代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因?qū)胫参锘蚱渌锓N中高效表達用于生產(chǎn)有用的次生代謝物質(zhì)有諸多成功報道。優(yōu)勢背景概況及目的1/6/2024基于RACE技術(shù)的同源性克隆方法克隆了南方紅豆杉中的兩個基因（MCT和MCS）TcMCT和TcMCS基因的功能驗證TcMCT基因的原核表達和酶活測定TcMCT基因的組織差異表達研究內(nèi)容1/6/2024技術(shù)路線1/6/2024ABC

TcMCT基因的獲得研究結(jié)果與分析基因克隆1/6/2024TcMCT

全長cDNA序列及編碼的氨基酸序列質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽全長：1293-bpORF：942-bp5端非編碼區(qū)：58-bp3端：249-bp編碼313個氨基酸分子量約為34.3kDa等電點：8.96研究結(jié)果與分析基因克隆1/6/2024

h表示α-螺旋，e表示β-片層，t表示β-轉(zhuǎn)角，c表示隨意卷曲；30.13%的α-螺旋、21.15%β-片層、8.97%β-轉(zhuǎn)角和39.74%隨意卷曲構(gòu)成。

TcMCT蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預測基因克隆研究結(jié)果與分析1/6/2024“★”表示CTP結(jié)合位點TcMCT氨基酸序列多重比對紅框表示MEP的結(jié)合位點TcMCT分別與銀杏(Ginkgobiloba)的MCT、和擬南芥(Arabidopsisthaliana)的MCT具有較高的同源性，同源性分別為59.3%、56.9%，相似性分別為69.1%、65.5%。

研究結(jié)果與分析基因克隆1/6/2024細菌來源MCT用○表示；植物來源用三角表示，其中被子植物用▲表示，裸子植物用△表示。分支上的數(shù)字為Bootstrap值(重復1000次)。TcMCT系統(tǒng)進化樹基因克隆研究結(jié)果與分析1/6/2024

TcMCT三級結(jié)構(gòu)預測α-螺旋用紅色螺旋狀表示，β-片層用藍色板狀表示，隨機卷曲用灰色繩狀表示。鋅離子結(jié)合位點用不同顏色小球標注出基因克隆研究結(jié)果與分析TcMCT具有兩個高度保守的活性位點底物MEP結(jié)合位點：Arg102-Lys109底物CTP結(jié)合位點：Arg239-Lys2951/6/2024TcMCT基因的功能驗證功能驗證利用攜帶有pAC-BETA質(zhì)粒的大腸桿菌菌株XL1-Blue來驗證TcMCT蛋白的功能，通過轉(zhuǎn)入攜帶有TcMCT基因的pTrc質(zhì)粒，

TcMCT在大腸桿菌中超表達，與pAC-BETA共同推動代謝流往下游流動，生產(chǎn)黃色的類胡蘿卜素。研究結(jié)果與分析1/6/2024TcMCT重組蛋白的誘導

Marker123456789第1泳道為M15誘導前；2.M15空菌，37℃誘導4h后；3.pQE30轉(zhuǎn)化到M15菌，誘導前；4.pQE30轉(zhuǎn)化到M15菌，37℃誘導4h后；5.TcMCT-pQE30轉(zhuǎn)化到M15菌，誘導前；6.TcMCT-pQE30轉(zhuǎn)化到M15菌，16℃低溫誘導20h；7.TcMCT-pQE30轉(zhuǎn)化到M15菌，37℃誘導4h；8.TcMCT-pQE30轉(zhuǎn)化到M15菌，37℃誘導4h后上清；9.TcMCT-pQE30轉(zhuǎn)化到M15菌，37℃誘導4h后沉淀蛋白表達97KD66KD55KD42KD31KD21KD14KD研究結(jié)果與分析1/6/2024過Ni-NTA親和樹脂純化TcMCT重組蛋白的的SDS

Marker1234567第1泳道為結(jié)合緩沖液緩沖液(pH7.0)洗柱洗出的雜蛋白；第2泳道10mmol.L-1咪唑洗柱；第3泳道為25mmol.L-1咪唑結(jié)合緩沖液洗柱，洗脫下來的TcMCT重組蛋白；第4-7泳道是用50，70，90，100mmol.L-1咪唑梯度結(jié)合緩沖液洗柱洗柱，徹底洗脫目的蛋白蛋白表達97KD66KD55KD44KD31KD21KD14KD研究結(jié)果與分析1/6/2024通過分子篩進一步純化TcMCT蛋白蛋白表達TcMCT重組蛋白通過superdex-200凝膠柱的洗脫曲線

通過分子篩收集61-67管TcMCT重組蛋白的SDS

97KD66KD55KD44KD31KD21KD14KD61626364656667Marker研究結(jié)果與分析1/6/2024TcMCT重組蛋白含量測定蛋白表達考馬斯亮蘭法(Bradford法)測定重組蛋白含量由此標準曲線，根據(jù)TcMCT蛋白測出的A595值，即可查出蛋白質(zhì)含量。得出TcMCT蛋白的含量為0.2mg/ml。研究結(jié)果與分析1/6/2024TcMCT重組蛋白的酶活性測定蛋白表達采用無機焦磷酸法測定酶活：反應在底物濃度充分，酶量固定的情況下反應體系在0-50min，OD值的變化量，繪制曲線計算出酶的活性為9(U/mg)。

研究結(jié)果與分析1/6/2024TcMCT重組蛋白在25℃下的CD圖譜

用圓二譜色儀(eireulardichroism,CD)在25℃下對TcMCT二級結(jié)構(gòu)進行了測定結(jié)果為:α-helix70.9%，β-sheet0%，β-turn0%，randomcoil29.1%。TcMCT預測的二級結(jié)構(gòu)包含30.13%的α-螺旋、21.15%β-折疊片、8.97%β-轉(zhuǎn)角和39.74%隨意卷曲蛋白表達研究結(jié)果與分析1/6/2024組織差異表達TcMCT基因的標準曲線圖18S基因的標準曲線圖研究結(jié)果與分析1/6/2024組織差異表達TcMCT和18S基因的溶解曲線圖TcMCT和18S基因的擴增曲線圖研究結(jié)果與分析1/6/2024TcMCT在南方紅豆杉中不同組織的表達水平組織差異表達研究結(jié)果與分析1/6/2024DD

TcMCS基因的獲得基因克隆研究結(jié)果與分析1/6/2024TcMCS全長cDNA序列的分析TcMCS全長為1081-bp，包含一段長度為744bp的ORF及一段長度為16-bp的5-端非編碼區(qū)和321-bp的3’端非編碼區(qū)編碼一個由247個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)預測的分子量約為26.1kDa等電點(pI)為8.97基因克隆研究結(jié)果與分析1/6/2024TcMCS全長cDNA序列及編碼的氨基酸序列質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽基因克隆研究結(jié)果與分析1/6/2024

TcMCS蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預測

h表示α-螺旋，e表示片層，t表示β-折疊，c表示隨意卷曲

TcMCS包含26%的α-螺旋、23%β-折疊片、7%β-轉(zhuǎn)角和44%隨意卷構(gòu)成

基因克隆研究結(jié)果與分析1/6/2024“★”表示底物結(jié)合的活性位點TcMCS氨基酸序列多重比對基因克隆TcMCS分別與TaxusmediaMCS((93.9%identity)、

Cephalotaxusfortunei(73.7%identity)

、GinkgobilobaMCS(61.7%identity)和ArabidopsisthalianaMCS(60.3%identity)具有很高的同源性。

研究結(jié)果與分析1/6/2024TcMCS系統(tǒng)進化樹裸子植物來源的MCSs用〇表示，被子植物用

表示，細菌用▲表示，分支上的數(shù)字為Bootstrap值(重復1000次)?；蚩寺⊙芯拷Y(jié)果與分析1/6/2024TcMCS蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測α-螺旋用紅色螺旋表示，β-片層用黃色板狀箭頭表示，隨機卷曲用綠色繩狀表示。活性位點的殘基(His79、His208、Asp212、Ser213、Glu216、Arg218、His223）在圖上標注基因克隆TcMCS單體結(jié)構(gòu)圖

TcMCS行使功能和晶體堆積時均以三聚體形式存在，即三個亞基的β-折疊片面對面形成類β桶結(jié)構(gòu)，α-螺旋包裹在亞基的外圍。研究結(jié)果與分析1/6/2024TcMCS基因的功能驗證利用攜帶有pAC-BETA質(zhì)粒的大腸桿菌菌株XL1-Blue來驗證TcMCS蛋白的功能，通過轉(zhuǎn)入攜帶有TcMCS基因的pTrc質(zhì)粒，TcMCS在大腸桿菌中超表達，與pAC-BETA共同推動代謝流往下游流動，生產(chǎn)黃色的類胡蘿卜素。

TcMCS基因的功能驗證功能驗證研究結(jié)果與分析1/6/2024結(jié)論與展望（1）首次從南方紅豆杉中克隆出紫杉醇前體代謝途徑中兩個基因MCT和MCS全長cDNA，對其進行了詳盡的生物信息學分析；（2）原核表達TcMCT蛋白，Ni-NTA柱親和層析獲得約35KD的TcMCT重組蛋白。用圓二色譜儀對TcMCT進行二級結(jié)構(gòu)測定，該重組蛋白中含有α-helix70.9%，β-sheet0%，β-turn0%，randomcoil29.1%。重組蛋白能夠催化MEP和CDP生成CDP-ME，具有2-C-甲基-D-赤醇-4-磷酸胱氨酰轉(zhuǎn)移酶的活性；（3）顏色互補試驗表明TcMCT基因和TcMCS基因的表達可以加速大腸桿菌體內(nèi)β-胡蘿卜素的合成；（4）RT-PCR技術(shù)對