小分子與蛋白體外相互作用測(cè)定方法

小分子與蛋白體外相互作用測(cè)定方法。編輯：小余生物分子相互作用是一種基本的生命現(xiàn)象，其相互作用研究是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重大問題之一?，F(xiàn)在研究相互作用的技術(shù)有：平衡透析法、紫外可見吸收光譜、熒光光譜、電化學(xué)法等。隨著分子生藥研究深入，一些新的檢測(cè)技術(shù)問世，如微量熱泳動(dòng)技術(shù)（MST），那么當(dāng)我們做蛋白相互作用時(shí)，面對(duì)如此多的技術(shù)，該如何讓選擇？筆者將目前測(cè)定小分子與蛋白的體外相互作用，最常用的四種技術(shù)：熒光偏振免疫分析法（fluorescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PIA）、等溫量熱滴定儀（ITC）、表面離子體共振技術(shù)（SPR）等技術(shù)的原理、操作、應(yīng)用范圍以及優(yōu)缺點(diǎn)做一綜述，供各位研究者參考。其中FPIA和ITC是兩種經(jīng)典方法。熒光偏振免疫分析法（fluorescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PIA）1.1原理FPIA是一種定量免疫分析技術(shù)，其基本原理是熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的藍(lán)偏振光（485nm）照射后，吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，隨后回復(fù)到基態(tài)，并發(fā)出單一平面的偏振熒光（525nm）。偏振熒光強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)，與其激發(fā)時(shí)的轉(zhuǎn)動(dòng)速度呈反相關(guān)。FPIA最適宜檢測(cè)小至中等分子物質(zhì)，常用于藥物、激素的測(cè)定。1.2操作1.2.1首先針對(duì)所測(cè)蛋白，選擇一個(gè)陽性藥物，對(duì)陽性藥物進(jìn)行熒光標(biāo)記；1.2.2配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原（廠家在試劑盒中提供提供已知?jiǎng)┝康姆菢?biāo)記抗原）；1.2.3用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原與一定量的標(biāo)記抗原在一定條件下同限量的特異性抗體進(jìn)行反映；1.2.4反應(yīng)達(dá)到平衡后，以反應(yīng)變量作為縱坐標(biāo)，反應(yīng)劑量（一系列標(biāo)準(zhǔn)抗原）作為橫坐標(biāo)，做一條曲線，就得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原對(duì)反應(yīng)變量的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線；1.2.5在同等條件下，用待測(cè)抗原與一定量的標(biāo)記抗原與限量的特異性抗體進(jìn)行反應(yīng)，并用同樣的方法分離待測(cè)抗原中的B和F，測(cè)量其放射性，計(jì)算出B/F，在劑量反應(yīng)曲線上就可以查出對(duì)應(yīng)的抗原濃度。1.3注意在實(shí)際操作中要設(shè)置：一是標(biāo)準(zhǔn)抗原量為0，這是沒有標(biāo)準(zhǔn)抗原與標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)，標(biāo)記抗原和抗體結(jié)合達(dá)最大值；二是為了排除標(biāo)記抗原再發(fā)特異性結(jié)合時(shí)出現(xiàn)非特異性結(jié)合（與雜質(zhì)蛋白和容器的管壁結(jié)合等），設(shè)置一個(gè)非特異性結(jié)合管（NSB），NSB管用蒸餾水代替特異抗體，在相同條件下反應(yīng)后測(cè)的放射性。1.4優(yōu)缺點(diǎn)1.4.1優(yōu)點(diǎn)檢測(cè)限低，0.2ng/ml，精密度高，速度快，樣品用量少，儀器不用每日校準(zhǔn)，有顏色和渾濁的溶液不干擾檢測(cè)結(jié)果；1.4.2缺點(diǎn)儀器設(shè)備昂貴，藥品試劑盒專屬性強(qiáng)，需進(jìn)口，測(cè)一種特異性抗體，需要一種標(biāo)記抗原。等溫量熱滴定儀（ITC）2.1原理ITC是一種量熱或分析技術(shù)，即用一種反應(yīng)物滴定另一種反應(yīng)物，隨著加入滴定劑的數(shù)量的變化，測(cè)量反應(yīng)體系溫度的變化。滴定一般在盡可能接近絕熱的條件下進(jìn)行，被滴定物可以是液體或懸浮的固體；滴定劑可以是液體或氣體。溫度變化是由滴定劑與被滴定物間的化學(xué)作用或物理作用（例如一種有機(jī)分子吸附于固體表面）引起的。在一次實(shí)驗(yàn)中可以測(cè)定結(jié)合的親和力常數(shù)K，結(jié)合反應(yīng)中的焓變、熵變，結(jié)合位點(diǎn)，也可以測(cè)定有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的樣品。2.2操作2.2.1樣品池中加入待測(cè)大分子；2.2.2參照池中加入緩沖液；2.2.3將待測(cè)配體吸入注射器中；2.2.4注射器置于樣品池中；2.2.5調(diào)整溫度、攪拌速度和每次注射體積。2.3應(yīng)用分子相互作用（蛋白、核酸、多肽、藥物分子、脂類、金屬離子、小分子等等）、工藝過程的開發(fā)和控制、酶動(dòng)力學(xué)、藥物研發(fā)、非生物系統(tǒng)等。2.4優(yōu)點(diǎn)2.4.1無需熒光標(biāo)記，因?yàn)闊晒馑貙?duì)大分子的結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)會(huì)有影響；2.4.2操作簡(jiǎn)單（整個(gè)過程由計(jì)算機(jī)控制，再由Origin軟件分析ITC所得數(shù)據(jù)，減少了人為誤差給實(shí)驗(yàn)帶來的影響）；2.4.3樣品用量小，方法靈敏度和精密度高。（滴定池有兩種配制:1ml--所需配體100ul和250ul；190ul---所需配體50ul）；2.4.4測(cè)定時(shí)不需要制成透明清澈溶液，而且量熱試驗(yàn)完畢的樣品未遭破壞，還可以進(jìn)行后續(xù)生化分析等。表面離子體共振（SPR）3.1原理表面等離子共振是一種物理光現(xiàn)象。利用光在玻璃界面處發(fā)生全內(nèi)反射時(shí)的消逝波，可以引發(fā)金屬表面的自由電子產(chǎn)生表面等離子體子在入射角或波長(zhǎng)為某一適當(dāng)值的條件下，表面等離體子與消逝波的頻率和波數(shù)相等，二者將發(fā)生共振，入射光被吸收，使反射光能量急劇下降，在反射光譜上出現(xiàn)共振峰（即反射強(qiáng)度最低值）。當(dāng)緊靠在金屬薄膜表面的介質(zhì)折射率不同時(shí)，共振峰位置將不同。3.2操作3.2.1準(zhǔn)備偶聯(lián)物和分析物，純度高的偶聯(lián)物有利于特異性結(jié)合的分析判斷及結(jié)合參數(shù)分析；3.2.2選擇合適的芯片并插入固定于儀器系統(tǒng)；3.2.3將偶聯(lián)物固定于芯片表面，根據(jù)不同的分析要求，固定相應(yīng)的偶聯(lián)物的量；3.2.4將分析物進(jìn)樣與芯片表面使之與偶聯(lián)物結(jié)合，記錄傳感圖譜;3.2.5再生芯片表面，選擇合適的再生試劑（高鹽溶液、酸堿溶液等），去除與偶聯(lián)物相結(jié)合的分析物；3.2.6分析傳感圖譜，獲取相應(yīng)的分子相互作用信息。3.3應(yīng)用可與納米技術(shù)、液質(zhì)等技術(shù)連用，用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究、高通量篩選、分子相互作用、腫瘤相關(guān)DNA標(biāo)記等。3.4優(yōu)缺點(diǎn)3.4.1優(yōu)點(diǎn)可進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，無需樣品標(biāo)記，樣品用量少，靈敏度高，能測(cè)定渾濁甚至不透明樣品等；3.4.2缺點(diǎn)蛋白在芯片表面固定比較困難，非特異性結(jié)合等。微量熱泳動(dòng)技術(shù)（MST）4.1原理微量熱泳動(dòng)技術(shù)（MicroscaleThermophoresis,MST）通過測(cè)量微觀溫度梯度場(chǎng)中的分子移動(dòng)來分析生物分子間的相互作用。該技術(shù)能夠測(cè)量出分子大小、電荷以及水化層變化引起的移動(dòng)速度的改變，具有極高的靈敏度。4.2操作4.2.1查閱文獻(xiàn)確定蛋白穩(wěn)定狀態(tài)下的buffer緩沖液；4.2.2對(duì)所測(cè)蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記（MST115款儀器；若為MSTlaberfree款儀器則不需要對(duì)蛋白進(jìn)行標(biāo)記。具體選擇那款儀器測(cè)定應(yīng)根據(jù)蛋白的結(jié)構(gòu)確定，若蛋白分子中色氨酸多處于暴露狀態(tài)，則首選MSTlaberfree款儀器；否則MST115款儀器，選擇紅色或藍(lán)色染料對(duì)蛋白分子進(jìn)行熒光標(biāo)記）；4.2.3對(duì)標(biāo)記蛋白或蛋白進(jìn)行熒光測(cè)定（300<><>4.2.4配制1:1配體溶液，加入蛋白分子，混勻，儀器檢測(cè)。4.3應(yīng)用主要應(yīng)用于生物分子間互作領(lǐng)域，主要包括寡糖核苷酸間的互作、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與核酸之間、蛋白與藥物分子之間等。4.4優(yōu)點(diǎn)4.4.1不需固定蛋白；4.4.2對(duì)蛋白可以標(biāo)記測(cè)定，也可不標(biāo)記測(cè)定；4.4.3快速、高效；4.4.4接近天然的測(cè)量環(huán)境：可以在血清和細(xì)胞裂解液之中測(cè)量；4.4.5簡(jiǎn)單易操作：簡(jiǎn)單的樣品準(zhǔn)備和直觀的軟件界面等。綜上所述，上述4種方法是目前測(cè)定蛋白與分子互作的最常用的方法，其中熒光偏振免疫分析法（fluorescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PIA）和等溫量熱滴定儀（ITC）兩種方法被認(rèn)為是經(jīng)典方法。然而每種方法都不是萬能的，有自己長(zhǎng)處，我們應(yīng)結(jié)合自己實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，以及生物樣品的特性選擇合適的方法進(jìn)行檢測(cè)。目前，若是測(cè)定蛋白與分子體外互作，會(huì)首選MST，用該方法檢測(cè)得到一種結(jié)果，再用兩種經(jīng)典方法一一熒光偏振免疫分析法（fluorescencepolarizationimmunoassay,FPIA）或等溫量熱滴定儀（ITC）中一