環(huán)境生物技術(shù)課件

第八章污染物生物毒性和致突變性的微生物學(xué)監(jiān)測(cè)方法第一節(jié)污染物生物毒性的微生物監(jiān)測(cè)方法第二節(jié)污染物致突變性的微生物監(jiān)測(cè)方法生物測(cè)試（Bioassay）的概念：指系統(tǒng)地利用生物的反應(yīng)測(cè)定一種或多種污染物或環(huán)境因素單獨(dú)或聯(lián)合存在時(shí)所導(dǎo)致的影響或危害。注釋1：所利用的生物反應(yīng)包括分子、細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體、種群、群落、生態(tài)系統(tǒng)各級(jí)水平上的反應(yīng)。注釋2：生物測(cè)試不同于常規(guī)的物理、化學(xué)檢測(cè)。前者能夠測(cè)定污染物對(duì)生物機(jī)體的影響，而后者只能測(cè)定污染物的濃度。例如：通過水污染的生物測(cè)試可獲得以下數(shù)據(jù)：各種環(huán)境因素如DO、pH、溫度、混濁度等對(duì)生命的有利以及不利的濃度或強(qiáng)度；污染物對(duì)受測(cè)生物的毒性；各種水生生物對(duì)污染物的相對(duì)敏感性；廢水所應(yīng)處理的程度；允許的污染物排放濃度等。毒性試驗(yàn)常用參數(shù)致死劑量或致死濃度（LethalDose，LethalConcentration）絕對(duì)致死劑量或致死濃度（LD100、LC100）半數(shù)致死劑量或濃度（LD50、LC50）最小致死劑量或濃度（MLD、MLC）最大耐受劑量或濃度（LD0、LC0）最大無作用劑量（MaximumNo－effectLevel）每日容許攝入量（AcceptableDailyIntake）最高容許濃度（MaximumAllowableConcentration）毒作用帶急性毒作用帶（Acute－toxicEffectZone）慢性毒作用帶（Chronic－toxicEffectZone）半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）和半數(shù)抑制濃度（IC50）:影響或抑制微生物正常生理指標(biāo)值50%所需的待測(cè)物濃度。檢測(cè)毒性的手段：動(dòng)物檢測(cè)、微生物檢測(cè)動(dòng)物檢測(cè)急性毒性：研究化學(xué)物質(zhì)大劑量一次染毒或24小時(shí)內(nèi)多次染毒動(dòng)物所引起的毒性的試驗(yàn)。其目的是短期內(nèi)了解該物質(zhì)的毒性大小和特點(diǎn)，并為進(jìn)一步開展其他毒性試驗(yàn)提供設(shè)計(jì)依據(jù)。急性毒性試驗(yàn)類型哺乳動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)水生生物急性毒性試驗(yàn)蚯蚓急性毒性試驗(yàn)觀察時(shí)間為2周，以半數(shù)致死濃度LC50表示。微生物檢測(cè)選擇一項(xiàng)或幾項(xiàng)生理指標(biāo)為指征，根據(jù)代謝物影響或抑制這些指征的程度來判斷毒性的強(qiáng)度。評(píng)價(jià)指標(biāo)多為EC50或IC50（二）試驗(yàn)方法菌種復(fù)蘇：2%NaCl，懸液樣品處理：系列稀釋，調(diào)pH6-8，滲透壓2%NaCl毒性測(cè)定：測(cè)試管加入樣品和菌液，以苯酚作陽性有機(jī)毒物對(duì)照，以ZnSO4.7H2O作陽性無機(jī)毒物對(duì)照，蒸餾水為陰性對(duì)照。15oC培養(yǎng)5min或15min。光量抑制百分率：（陰性對(duì)照組指標(biāo)值-實(shí)驗(yàn)組指標(biāo)值）陰性對(duì)照組指標(biāo)值通過回歸方程計(jì)算IR為50%時(shí)的樣品劑量，IC50質(zhì)量控制：同一劑量平行管間的發(fā)光強(qiáng)度差異值小于20%，苯酚和硫酸鋅的IC50有一定范圍。x100%IR=（三）方法評(píng)價(jià)與傳統(tǒng)魚類96h毒性試驗(yàn)相比具有良好的一致性。1991年Diane對(duì)100種化學(xué)物質(zhì)的毒性測(cè)試結(jié)果表明兩者的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.85?？梢愿鶕?jù)細(xì)菌生物發(fā)光試驗(yàn)的發(fā)光抑制率進(jìn)行毒性分級(jí)。各實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的重現(xiàn)性好可用于生物傳感器分析國際標(biāo)準(zhǔn)化組織將該方法作為檢測(cè)化合物或廢水毒性的標(biāo)準(zhǔn)方法之一（ISO9509）。（一）試驗(yàn)原理毒性污染物抑制硝化作用的酶類，導(dǎo)致對(duì)底物的利用能力或產(chǎn)物的生成量下降。通過測(cè)定底物或產(chǎn)物的變化來檢測(cè)毒性作用的程度。利用亞硝化單胞菌或硝化桿菌屬，或用活性污泥。二、硝化細(xì)菌—硝化作用抑制試驗(yàn)（二）試驗(yàn)方法（以硝化桿菌屬為例）增殖細(xì)菌至108個(gè)/ml。加入菌液、NaNO2溶液及樣品（不同濃度），以蒸餾水為對(duì)照。培養(yǎng)（30oC4h)、檢測(cè)NO2-比較樣品組與對(duì)照組硝化作用強(qiáng)度，可得IC50與Microtox靈敏度相當(dāng)，與魚類毒性試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性為0.45。美國國家環(huán)保局認(rèn)可的毒性測(cè)試方法。（一）實(shí)驗(yàn)原理藻類對(duì)水體污染反應(yīng)十分敏感。毒物抑制光合作用，藻類生長(zhǎng)量減少。常用硅藻、柵藻、小球藻。（二）試驗(yàn)方法繁殖藻種配制培養(yǎng)基，滅菌。加入待測(cè)物，接種。培養(yǎng)。恒溫（28-30°C），光照。測(cè)定生長(zhǎng)量（或其他指標(biāo)），繪制生長(zhǎng)曲線。計(jì)算最大生長(zhǎng)率。（μmax）（三）結(jié)果與評(píng)價(jià)三、藻類—生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)又稱為微型生物群落監(jiān)測(cè)法，廣泛用于水環(huán)境的毒性監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)。微生物包括細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、藻類及小型輪蟲。國家標(biāo)準(zhǔn)：水質(zhì)微型生物群落監(jiān)測(cè)PFU法(

(GB/T12990-91)

（一）試驗(yàn)原理正常條件下自然水環(huán)境的微型生物群落種類、分布、構(gòu)成有一定規(guī)律，外界環(huán)境因素的干擾下，群落的平衡被破壞，結(jié)構(gòu)特征也隨之變化。通過分析微型群落結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)，判斷水環(huán)境的質(zhì)量狀況或污染物質(zhì)的毒性特征。檢測(cè)結(jié)果有很強(qiáng)的生態(tài)學(xué)意義。PFU法是在群落水平上的,是較物種水平、種群水平更高的,因此它能提供較大的環(huán)境真實(shí)性。四、原生動(dòng)物—微尺度群落級(jí)毒性試驗(yàn)最常用的方法是PFU（聚氨酯泡沫塑料塊）法。聚氨酯泡沫塑料塊的孔徑100-150um，微型生物可以進(jìn)入其內(nèi)，能收集到85%的種類，具有環(huán)境真實(shí)性。一定時(shí)間內(nèi)，原生動(dòng)物種群構(gòu)成會(huì)達(dá)到平衡，而有害物會(huì)破壞這一平衡，比較試驗(yàn)組和對(duì)照組的群落結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)，即可評(píng)價(jià)水體質(zhì)量與污染程度。（二）試驗(yàn)方法與評(píng)價(jià)把PFU分別浸入對(duì)照水體和調(diào)查水體，不同時(shí)段后，擠出液體，對(duì)原生動(dòng)物鑒定和計(jì)數(shù)。PFU中微型生物的結(jié)構(gòu)與功能參數(shù)：異養(yǎng)性指數(shù)（HI）=微型生物灰份量/葉綠素a量原生動(dòng)物群落多樣性指數(shù)（d）=（S-1）/lnN(S為原生動(dòng)物種類數(shù)，N為10ml擠出液中原生動(dòng)物個(gè)數(shù)）T90：達(dá)到90%Seq所需的時(shí)間（Seq：平衡時(shí)原生動(dòng)物種數(shù)）G:原生動(dòng)物群集速度常數(shù)評(píng)價(jià)：污染程度高，S、d降低嚴(yán)重污染的水域中，原生動(dòng)物的群集速度亦很低，隨著水質(zhì)的清潔程度提高，原生動(dòng)物的群集速度亦迅速提高。溢流口24小時(shí)內(nèi)僅群集了3種耐污鞭毛蟲。而通惠河沿岸的站點(diǎn)，如24小時(shí)內(nèi)，雙橋站點(diǎn)群集了19種，東關(guān)站點(diǎn)群集了33種，對(duì)照站點(diǎn)溫榆河群集了37種。

檢測(cè)待測(cè)物的毒性（種類損傷法）：清潔水體中浸泡的PFU擠出液（接近平衡期的、未成熟的群落。未成熟群落要比成熟群落對(duì)污染的毒性反應(yīng)敏感得多）混合不同濃度的待測(cè)物，培養(yǎng)一定時(shí)間后鏡檢原生動(dòng)物種數(shù)，計(jì)算待測(cè)物影響原生動(dòng)物種數(shù)的EC50（medianeffectconcentration，半數(shù)效應(yīng)濃度）（一）脫氫酶活性試驗(yàn)原理：脫氫酶作用下，無色的氯化三苯基四氮唑（TTC）受氫后變?yōu)榧t色的三苯甲基（TF），分光光度計(jì)485nm處比色，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求的TF產(chǎn)生量，計(jì)算脫氫酶活性?？梢缘贸龃郎y(cè)物的EC50.五、活性污泥毒性檢測(cè)法（二）呼吸抑制試驗(yàn)有毒物抑制微生物呼吸作用，使耗氧量和CO2的產(chǎn)生量下降。檢測(cè)化合物和廢水毒性。瓦勃氏呼吸儀測(cè)定消耗的氧量：堿溶液吸收CO2，反應(yīng)瓶中壓力的降低完全是氧消耗的結(jié)果。溶解氧電極測(cè)定耗氧量：瓶塞上的溶解氧電極記錄溶解氧；相對(duì)耗氧速率=污泥的呼吸好氧速率/內(nèi)源性呼吸好氧速率x100%優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便靈敏快速經(jīng)濟(jì)缺點(diǎn)：檢測(cè)結(jié)果有一定范圍的變異性；不能完全代替哺乳動(dòng)物毒性試驗(yàn)。適用：快速篩選大批量樣品用細(xì)菌生物發(fā)光抑制試驗(yàn)，廢水處理影響效果用活性污泥毒性檢測(cè)法，評(píng)價(jià)水質(zhì)的生態(tài)學(xué)特征用微尺度群落級(jí)毒性試驗(yàn)。微生物學(xué)檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)一、基因突變?cè)囼?yàn)（一）鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）1、原理野生型his+營養(yǎng)缺陷性his+

致突變物可使該菌的基因發(fā)生回復(fù)突變。美國Ames教授1975年正式建立的方法第二節(jié)污染物致突變性的微生物檢測(cè)方法正向突變回復(fù)突變?cè)囼?yàn)菌株：曾推薦的5株：TA1535、TA1537、TA1538、TA98、TA10083年修訂之后：TA97、TA98、TA100、TA102賦予其他附加突變：uvrB突變：失去DNA切割修復(fù)能力，敏感性增加；rfa突變：脂多糖屏障卻失，大分子透入；組入某些質(zhì)粒提高回變能力。后來一套6株組氨酸缺陷型菌株：TA7001、TA7002、TA7003、TA7004、TA7005、TA7006.方便檢出堿基的變異。每次試驗(yàn)可使用一種或幾種菌株，只要有任何一株發(fā)生大量的回復(fù)突變，即為陽性結(jié)果。哺乳動(dòng)物微粒體酶：微粒體中含有混合功能的氧化酶系；有降解作用：把化學(xué)物變成低毒或無毒物排出；有激活作用：使化學(xué)物變成具有親電子性質(zhì)，導(dǎo)致毒性增強(qiáng)，成為致突變物或致癌物。哺乳動(dòng)物微粒體酶系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱S9混合液）：從肝勻漿中制??；加入S9混合液使體外測(cè)試條件更接近于人體內(nèi)代謝條件。2、試驗(yàn)方法紙片點(diǎn)試法：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+菌液+S9+表層培養(yǎng)基紙片蘸取待測(cè)物至于培養(yǎng)皿中間培養(yǎng)37oC,48h,觀察結(jié)果。長(zhǎng)出密集菌落的為陽性，只長(zhǎng)出少量散在菌落的為陰性。平皿摻入法：最高的誘發(fā)回變菌落數(shù)為自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍或以上屬陽性結(jié)果。3、應(yīng)用與評(píng)價(jià)175種已知致癌物進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)157種為陽性，陽性吻合率90%；陰性吻合率87%。初篩報(bào)警手段。已被我國食品安全毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序、農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法、新藥毒理學(xué)研究指導(dǎo)原則、化妝品安全性評(píng)價(jià)程序和方法等列為評(píng)價(jià)致突變性的必做試驗(yàn)。1、原理致突變物使發(fā)光細(xì)菌暗變異菌株突變，恢復(fù)一定的發(fā)光能力。菌株：蝠魚發(fā)光桿菌的暗變異菌株SD-18和RC93、費(fèi)氏弧菌的暗變異株P(guān)f-13、明亮發(fā)光桿菌T3小種的暗變異株T9171。2、方法細(xì)菌復(fù)蘇、增殖、分裝測(cè)試管培養(yǎng)（20°C、）、24h后開始測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，以后每隔3-4天測(cè)定一次。發(fā)光強(qiáng)度為對(duì)照管發(fā)光強(qiáng)度的3倍或以上即為陽性。（二）發(fā)光細(xì)菌試驗(yàn)（一）SOS顯色試驗(yàn)SOS修復(fù)是指DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)時(shí)所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)胞的生存率，但留下的錯(cuò)誤較多，故又稱為錯(cuò)誤傾向修復(fù)（error-pronerepair），使細(xì)胞有較高的突變率。致突變物→DNA損傷→細(xì)菌SOS修復(fù)→測(cè)定SOS修復(fù)能力→（通過大腸桿菌PQ37菌株的顯色反應(yīng)）二、DNA損傷修復(fù)試驗(yàn)PQ37菌株的特點(diǎn)：操縱子融合方法構(gòu)建的，將SOS反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中的sfiA基因與編碼β-半乳糖苷酶的基因lacZ融合在一起（報(bào)告基因），β-半乳糖苷酶通過Xgal培養(yǎng)基和β–ONPG培養(yǎng)基來顯色，分別產(chǎn)生藍(lán)色和黃色。定性試驗(yàn)：Xgal培養(yǎng)基平板，紙片點(diǎn)試,出現(xiàn)藍(lán)色色素即為陽性。定量試驗(yàn)：液體培養(yǎng)基（含待測(cè)樣品）,37°C,2h,加入β–ONPG顯色一定程度，終止反應(yīng)，420nm處測(cè)吸光度。R大于2且具有劑量關(guān)系，則為陽性結(jié)果。應(yīng)用評(píng)價(jià)：敏感性與準(zhǔn)確性與Ames試驗(yàn)相當(dāng)，某些方面優(yōu)于后者，可以相互補(bǔ)充。（二）聚合酶缺陷型菌株試驗(yàn)致癌物使DNA受損，聚合酶缺陷型菌株在DNA受損后無修復(fù)能力，不能生存，抑菌圈出現(xiàn)。E.coliP3478(polA-),對(duì)照為野生型菌株E.coliW3110(polA+)。點(diǎn)試法、混菌法，分別出現(xiàn)抑菌圈和有空白的生長(zhǎng)線（抑菌現(xiàn)象）。對(duì)直接突變作用的烷化劑較為敏感，對(duì)需要代謝活化的化合物不敏感。（三）重組缺陷型菌株試驗(yàn)重組缺陷型菌株失去修復(fù)能力，致癌性物質(zhì)使DNA受損，重組缺陷型菌株不能生長(zhǎng)，原理與聚合酶缺陷型菌株試驗(yàn)相似?？莶菅挎邨U菌H17(recA+）對(duì)照，全線生長(zhǎng)枯草芽孢桿菌M45(recA-）試驗(yàn)，抑菌現(xiàn)象（四）溶源性細(xì)菌試驗(yàn)原理：原噬菌體誘變劑烈性噬菌體（噬菌體誘導(dǎo)現(xiàn)象）

→裂解非溶源性細(xì)菌（作為指示菌）→固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)噬菌斑菌株：E.colik12(λ)——溶源性E.colik12(S)—