手把手教你雙熒光素酶報告實驗

手把手教你雙熒光素酶報告實驗螢光素酶是理想的報告基因，因為哺乳動物細(xì)胞中不含內(nèi)源性螢光素酶，一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶，同時在所有的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，它的光產(chǎn)物具有最高的量子效率，檢測靈敏度高。熒光素酶報告基因被廣泛用于miRNA靶基因驗證。熒光素酶報告基因的原理在于miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用，可以將目的基因3’UTR區(qū)域構(gòu)建至pGL3-basic載體中報告基因Luciferase的后面，構(gòu)建熒光素酶質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，通過比較過表達(dá)或者干擾miRNA后，檢測報告基因表達(dá)的改變（監(jiān)測螢光素酶的活性變化）可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用。結(jié)合定點突變等方法進(jìn)一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。同時，為了減少內(nèi)在的變化因素，比如：培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等對實驗準(zhǔn)確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinillaluciferase）的質(zhì)粒（phRL-TK）作為對照質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提供轉(zhuǎn)錄效率的內(nèi)對照，使測試結(jié)果不受實驗條件變化的干擾。在測量過程中，首先加入熒光素酶檢測試劑 LuciferaseAssayReagentII時產(chǎn)生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶活性。定量螢火蟲熒光強(qiáng)度之后，再在同一樣品中加入Stop&GloReagent試劑，將上述反應(yīng)淬滅，并同時啟動海腎熒光素酶反應(yīng)，進(jìn)行第二次測量，稱之為雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?。下面就介紹一下螢光素酶實驗檢測步驟：一、樣品準(zhǔn)備：1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞（1） 細(xì)胞鋪板：將細(xì)胞按50%的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)12孔板內(nèi)。（2） 轉(zhuǎn)染：16h左右細(xì)胞約70%時轉(zhuǎn)染螢光素酶報告基因質(zhì)粒，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。首先設(shè)計四組：空白組（轉(zhuǎn)染試劑+細(xì)胞）質(zhì)粒組質(zhì)粒+miRNANC組質(zhì)粒+miRNAmimics組2.1配制質(zhì)粒組：按照每空50ng質(zhì)粒，同時每孔20ul無血清培養(yǎng)基計算需用量，標(biāo)記為A。2.2配制miRNANC/mimics:miRNANC/mimics的終濃度為20nM，同時每孔20ul無血清培養(yǎng)基計算需用量，分別標(biāo)記為B、C。2.3配制對應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑：按照每孔0.5口L轉(zhuǎn)染試劑，同時每孔20ul無血清培養(yǎng)基計算需用量，標(biāo)記為D。2.3稀釋好的四組試劑常溫孵育5min。2.4將稀釋好的質(zhì)粒DNA和miRNAmimics分別和對應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑混勻，常溫孵育20min。2.5將2.4步驟中試劑對應(yīng)加入孔中。2.6轉(zhuǎn)染6h后，換新鮮完全培養(yǎng)基。2雙報告基因檢測(1)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染36-48h后，棄去培養(yǎng)基，用100pL1XPBS清洗細(xì)胞。(2)傾斜12孔板，吸干剩余的PBS。(3)去離子水將5XPLB(裂解液)稀釋成1XPLB(現(xiàn)配現(xiàn)用)，使用前放到常溫。(4)每孔加50口L稀釋好的1XPLB，置搖床振搖20-30min以保證裂解緩沖液完全裂解細(xì)胞。(5)選用白色不透光的96孑L酶標(biāo)板中每孔加步驟4的上清液10口L,加入100"預(yù)先混好的LuciferaseAssayReagentII,2s后測數(shù)據(jù)，檢測熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。注意此步需在避光條件下進(jìn)行。(6)測定結(jié)束后，每孔添加 100口L預(yù)先混好的Stop&GloReagent，靜止2s后，測數(shù)據(jù)，檢測內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度(7)記錄讀數(shù):每個樣品會有3個數(shù)值：RLU1—螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度，RLU2—內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度，計算兩組數(shù)據(jù)比值，即RLU1/RLU2。(8)分析數(shù)據(jù)：比較1、2組可以發(fā)現(xiàn)由于對照組未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，因此檢測不到熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。比較3、4組，由于轉(zhuǎn)染microRNAmimics進(jìn)行mi