蛋白質(zhì)分析鑒定

第六章

蛋白質(zhì)的分析和鑒定技術(shù)

.第一節(jié)

蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)分析.蛋白質(zhì)由氨基酸構(gòu)成，具有氨基酸的一些功能基團，保存了一些氨基酸的性質(zhì)，但又發(fā)生了質(zhì)的變化，具備一些氨基酸沒有的性質(zhì)。.、蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點兩性解離：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，解離情況比氨基酸復(fù)雜得多。在特定的pH值范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)解離產(chǎn)生帶正電荷或負電荷的基團，分折蛋白質(zhì)的滴定曲線可得到各解離基團的PK′值.等電點pI

指某一pH值時，蛋白質(zhì)所帶正負電荷恰好相等，凈電荷為0，此時溶液的pH值稱為等電點。蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量由蛋白質(zhì)分子中可解離基團的種類和數(shù)目、溶液pH值所決定。

pH大于pI，蛋白質(zhì)帶負荷，電場中向陽極移動

pH=pI，電場中不移動，蛋白質(zhì)沉淀出，此時導(dǎo)電率、滲透壓、粘度等均達最低值。

pH小于pI，蛋白質(zhì)分子帶正電荷，電場向陰極移動。.蛋白質(zhì)的等離子點〔特征常數(shù)〕：指在純水中〔即沒有其它鹽類存在〕蛋白質(zhì)的正離子數(shù)等于負離子數(shù)的pH值。因蛋白質(zhì)的等電點不是一成不變的，它隨溶劑性質(zhì)、離子強變等因素而改變。.二、蛋白質(zhì)分子的大小相對分子質(zhì)量Mr從一萬到幾百萬或更大，對Mr的測定，按性質(zhì)分兩類：

1.根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子量利用化學(xué)分析定量測定蛋白質(zhì)中某一特殊元素的含量，并假定蛋白質(zhì)分子中含1個這種元素，.2.用物理化學(xué)方法來測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量是目前常用的方法，包括測定質(zhì)點的：擴散系數(shù)、沉降超離心、凝膠過濾、滲透壓等。滲透壓測定法最為方便，但準確度較差，超離心法最為準確，但需昂貴的超速離心機，.三、蛋白體的膠體性質(zhì)膠體：指質(zhì)點大小在1nm-100nm范圍內(nèi)所構(gòu)成的分散系統(tǒng)蛋白分子直徑2nm-20nm，其溶液是膠溶液并且其分子外表分布有親水氨基酸的極性R基，是一種親水膠體，具有親水膠體的性質(zhì)：1、具有半通透性2、丁達爾效應(yīng)3、布朗運動等。.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大，在溶液中形成的顆粒大，不能通過半透膜。透析：利用蛋白質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)將其與小分子物質(zhì)分開的別離方法.四、蛋白質(zhì)的沉淀作用蛋白質(zhì)保持穩(wěn)定的親水膠體狀態(tài)，這種穩(wěn)定性主要由兩因素決定：1、水化作用存在有極性R基〔—NH2、—COOH、—OH等〕，故蛋白質(zhì)分子外表結(jié)合有一層水分子，稱為水化膜，其可防止分子互碰而聚集。.2、電荷排斥作用蛋白質(zhì)是兩性分子，一定pH值下，分子帶相同電荷，同性電荷互斥，使分子不能聚集。由此，改變穩(wěn)定性的條件，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性被破壞，從溶液中沉淀出來：a參加脫水劑除去水膜b使pH=pIc參加電解質(zhì)使質(zhì)點外表失去同種電荷。.

五、蛋白質(zhì)的變性作用

天然蛋白質(zhì)受到理化因素的影響，氫鍵、鹽鍵等次級鍵維系的高級結(jié)構(gòu)遭到破壞，分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，致使生物學(xué)性質(zhì)、理化性質(zhì)改變的現(xiàn)象。

.物理因素：加熱、紫外線、X—射線、超聲波化學(xué)因素：強酸、強堿、尿素、乙醇、三氯醋酸等蛋白質(zhì)變性后，結(jié)構(gòu)雖有改變，但組成成分和Mr沒有改變.六、蛋白質(zhì)的顏色反響

可作為蛋白質(zhì)定性定量測定的依據(jù).1、茚三酮反響(NinhydrinReaction)α－氨基酸和水化茚三酮(苯丙環(huán)三酮戊烴)功能時，產(chǎn)生藍色反響，由于蛋白質(zhì)是由許多α－氨基酸組成的，所以也呈此顏色反響。

.2、雙縮脲反響(BiuretReaction)

蛋白質(zhì)在堿性溶液中和硫酸銅功能呈現(xiàn)紫紅色，稱雙縮脲反響。凡分子中含有兩個以上－CO－NH－鍵的化合物都呈此反響，蛋白質(zhì)分子中氨基酸是以肽鍵相連，因此，所有蛋白質(zhì)都能和雙縮脲試劑發(fā)生反響。.3、米倫反響(MillonReaction)蛋白質(zhì)溶液中參加米倫試劑(亞硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混和液)，蛋白質(zhì)首先沉淀，加熱那么變?yōu)榧t色沉淀，此為酪氨酸的酚核所特有的反響，因此含有酪氨酸的蛋白質(zhì)均呈米倫反響。.第二節(jié)蛋白質(zhì)分析技術(shù).氨基酸序列分析電泳技術(shù)空間結(jié)構(gòu)分析生物質(zhì)譜技術(shù).多肽鏈中氨基酸序列分析怎樣才能確定蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)呢？測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，就是要確定蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸殘基的排列順序，其根本戰(zhàn)略是由Sanger開創(chuàng)的肽鏈端基分析法與不同切點的肽片段拼對法的巧妙結(jié)合。.確定蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)，一般需要經(jīng)過以下步驟：純化待測的蛋白質(zhì)分子，測定其分子量并確定分子中多肽鏈的數(shù)目。對于由兩條及兩條以上多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，那么需將其拆開〔斷裂二硫鍵〕并單獨別離出來。.2.分析多肽鏈的氨基酸組成。將多肽鏈用酸或酶完全水解，再用離子交換樹脂〔或用高效液相色譜〕將各種氨基酸別離開，測定其含量并計算各種氨基酸組成的百分比。以下圖表示蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物通過Moor-SteinDowex50離子交換柱層析的自動分析結(jié)果。.3.端基分析分析確定多肽鏈的N-末端和C-末端氨基酸殘基，作為整條多肽鏈的標志點。N-末端測定多用二硝基氟苯法和丹磺酰氯法，C-末端的測定可用肼解法和羧肽酶法。.4.將多肽鏈裂解為小肽段。采用專一的化學(xué)法或蛋白酶水解法可在特定的位點將大分子的多肽鏈局部降解為小肽段，再采用適當?shù)膭e離方法，將這些小肽段分別別離開來。.5.肽片段的氨基酸順序分析。采用Edman降解法，分別分析測定各肽片段的氨基酸排列順序。該法用異硫氰酸苯酯標記N-末端氨基酸殘基，然后將其水解并別離出來加以鑒定，剩余的肽片段回收后再進行下一個殘基的分析測定。如此循環(huán)操作，就可以將一條肽片段的全部氨基酸順序排列出來。.電泳技術(shù)紙電泳醋酸纖維薄膜電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳〔PAGE)(可分為圓盤電泳和垂直平板電泳〕瓊脂糖凝膠電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦(IEF)雙向電泳毛細管電泳.在外加電場作用下，帶電的蛋白質(zhì)顆粒在電場中移動的速度〔v〕取決于電場強度(E)，所帶的凈電荷(q)，蛋白質(zhì)的分子量、分子形狀以及與介質(zhì)的摩擦系數(shù)(f)。.聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳〔PAGE)是利用聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的電泳法，聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙稀酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙稀酰胺交聯(lián)而成的多孔網(wǎng)狀凝膠。不連續(xù)PAGE有別離膠、濃縮膠和樣品膠。PAGE分辨率很高。.電泳過程.SDS-聚丙烯酰胺凝膠〔SDS〕電泳法

SDS〔十二烷基磺酸鈉〕是一種陰離子型外表活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約11.4比例結(jié)合。每一個蛋白質(zhì)分子都因為結(jié)合了許多的SDS而帶有大量的負電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷那么可以忽略。該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而別離蛋白質(zhì)。用分子量的蛋白質(zhì)作為標準，那么可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。.雙向電泳：2-DE技術(shù)依然是大多數(shù)蛋白質(zhì)組研究中別離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的首選技術(shù)。.雙向電泳分析中的樣品制備制備原那么：應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)〔包括多數(shù)疏水性蛋白〕，且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾〔如酶性或化學(xué)性降解等〕。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。.樣品的溶解是2-DE成功別離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一。溶解的目標：1、樣品中非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個多肽的溶解液〔否那么樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點，相應(yīng)的表示單個多肽的點的強度會下降〕；2、溶解方法必須允許可能干擾2-DE別離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除；3、溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。.增加樣品溶解性的手段變性劑：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。外表活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團后，還常需至少一種外表活性劑來溶解疏水基團。常用的外表活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。復(fù)原劑：在變性劑和外表活性劑聯(lián)用條件下，加用復(fù)原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦〔TBP〕進行復(fù)原。.起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和外表活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否那么這些蛋白質(zhì)在其處于PI點時會發(fā)生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2％〔w/v)。濃度過高會使IEF的速度降低。另外，為了保證實驗的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。.一維固相pH梯度等電聚焦〔IEFwithIPG〕：IPG膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團，它們構(gòu)成了分布在pH3~10不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計算后，將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團通過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通過這種方式生成的IPG不會發(fā)生電滲透作用，因而可以進行特別穩(wěn)定的IEF別離到達真正的平衡狀態(tài)。....IPGIEF中pH梯度的選擇

常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預(yù)試驗確定。.兩維間的平衡

一維結(jié)束后可馬上進行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－80°保存數(shù)月。但在二維電泳前一定要進行膠條的平衡，以便于被別離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而在SDS是電泳能順利進行。.二維SDS同普通SDS類似。但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，因為在IPG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認為非限制性IEF膠〔低濃度丙烯酰胺膠〕充當了濃縮膠。..凝膠的圖像處理分析和典型流程凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點檢測和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋：2-DE數(shù)據(jù)庫的建立：.雙向電泳的分類非變性2D：兩向均在非變性條件下進行，這樣別離的蛋白質(zhì)點的等電點和表觀分子量同生理條件下獲得的這些蛋白的值是一樣的非變性/SDS-2D：第一向采用非變性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的條件下進行。適于分析非共價鍵連接的蛋白－蛋白間的相互作用。.非變性/復(fù)原/SDS-2D：非變性條件下IEF聚焦，之后用8M尿素＋5%β-ME＋2%SDS進行平衡，再進行第二向SDS-PAG電泳。此時別離的蛋白質(zhì)點可進行點的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鑒定，提供關(guān)于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息。變性2D：樣品先用2%SDS＋5%β-ME＋95℃變性5min，IEF在8M尿素＋1%NP-40條件下進行，之后膠條用2%SDS＋5%β-ME平衡，然后進行SDS。該技術(shù)適于DNA序列和多肽結(jié)構(gòu)的分析，或分析被碳氫鍵連接和其它翻譯后修飾所引起的多肽結(jié)構(gòu)微異質(zhì)性，但此方式顯示的大于100Kd的蛋白質(zhì)點少于第三種方式.毛細管電泳

capillaryelectrophoresis.毛細管電泳capillaryelectrophoresis是利用被分析離子在電場作用下移動的速率不同而到達別離的目的，這種技術(shù)主要用來分析在毛細管緩沖溶液中能離解為離子的物質(zhì)。

.以毛細管為別離通道，高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分析技術(shù)?？蓪⒂猩锘瘜W(xué)意義的復(fù)雜化合物在不改變其性質(zhì)的前提下進行別離.優(yōu)點:操作簡單，試樣量少，別離效率高，本錢低等。缺點：在遷移時間上的重現(xiàn)性，進樣的準確性和檢測靈敏度方面比高效液相色譜法稍遜。.毛細管電泳的根本原理離子的電泳遷移率不同，在電場中移動的速度不一樣，利用這個原理可以把不同的離子彼此別離。電泳遷移率與分析物質(zhì)所帶電荷呈正比，與摩擦阻力系數(shù)呈反比。如果兩種物質(zhì)帶有不同的電荷或者通過緩沖溶液移動的摩擦力不同，那么這兩種物質(zhì)可以彼此別離。.毛細管電泳裝置.毛細管電泳在蛋白質(zhì)分析的應(yīng)用分子量的測定等電點的測定肽譜分析〔指紋圖〕測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)遷移率的測定.檢測方法紫外吸收、激光誘導(dǎo)熒光數(shù)據(jù)記錄參量：峰面積、峰高、峰間距.蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分析二級結(jié)構(gòu)測定通常采用圓二色光譜(circulardichroism，CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量。

-螺旋的CD峰有222nm處的負峰、208nm處的負峰和198nm處的正峰三個成分；而

-折疊的CD譜不很固定。.X衍射晶體分析(X-raycrystallography).核磁共振.瑞士科學(xué)家?guī)鞝柼亍ぞS特里希那么創(chuàng)造了“利用核磁共振技術(shù)測定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)法〞。這種方法的優(yōu)點是可對溶液中的蛋白質(zhì)進行分析,進而可對活細胞中的蛋白質(zhì)進行分析,能獲得“活〞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),其意義非常重大。這種方法的原理選擇生物大分子中的質(zhì)子(氫原子核)作為測量對象,連續(xù)測定所有相鄰的2個質(zhì)子之間的距離和方位,這些數(shù)據(jù)經(jīng)計算機處理后就可形成生物大分子的三維結(jié)構(gòu)圖。.

核磁共振(NuclearMagneticResonance-NMR)現(xiàn)象是1946年由哈佛大學(xué)的伯塞和斯坦福大學(xué)的布洛赫用不同的方法在各自的實驗室里觀察到的。核磁共振分析技術(shù)是利用通過對核磁共振譜線特征參數(shù)的測定來分析物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì).NMR不破壞被測樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu),是一種無損檢測方法.由于不同的原子核吸收不同的電磁波,因而通過測定和分析受測物質(zhì)對電磁波的吸收情況就可以判定它含有哪種原子,原子之間的距離有多大,并據(jù)此分析出它的三維結(jié)構(gòu)。.

最初,核磁共振技術(shù)主要用于核物理研究方面,用它測量各種原子核的磁矩,誤差僅是0.003%～0.005%。1985年,維特里希等人公布了第一次利用NMR法測定的溶液中蛋白質(zhì)———蛋白酶抑制劑IIA(proteinaseinhibitorIIA)的結(jié)構(gòu)(如圖4所示)。1990年用NMR測定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有23個,而到1994年一年測定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)上升到100個。1997年,維特里希應(yīng)用NMR方法測定的一種蛋白質(zhì)———蛋白感染素(prionprotein)的結(jié)構(gòu)。.在水溶液中,大約有一半的蛋白質(zhì)鏈呈現(xiàn)出規(guī)那么、緊密的三維結(jié)構(gòu),而另一半那么非常松。目前,科學(xué)家已經(jīng)利用這一方法繪制出15%～20%的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。.質(zhì)譜分析法質(zhì)譜分析法是化學(xué)領(lǐng)域中一種非常重要的分析方法。它通過測定分子質(zhì)量和相應(yīng)的離子電荷實現(xiàn)對樣品中分子的分析。質(zhì)譜分析用于生物活性分子的研究具有如下的優(yōu)點:靈敏度極高,能為亞微克級試樣提供信息,適用于復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定和結(jié)構(gòu)測定。質(zhì)譜技術(shù)具有非常強的結(jié)構(gòu)分析能力,并且樣品用量極少(～10-11g)。19世紀末科學(xué)家已經(jīng)奠定了這種方法的根底,1912年科學(xué)家約瑟夫·湯普生(JosephThompson)第一次利用它獲得對小分子的分析結(jié)果...首先將成團的生物大分子拆成單個的生物大分子,并將其電離,使之懸浮在真空中,然后讓它們在電場的作用下運動。不同的分子通過指定距離的時間不同,質(zhì)量小的分子速度快些,質(zhì)量大的分子速度慢些,通過測量不同分子通過指定距離的時間,就可計算出分子的質(zhì)量。.質(zhì)譜圖與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)

<不同于UV;NMR>

質(zhì)譜是唯一可以給出精確分子量，對化合物分子式確實定起決定性的作用。

質(zhì)譜法的優(yōu)勢：根本原理..蛋白質(zhì)分析技術(shù)〔2〕一、WesternBlot二、ELISA三、免疫熒光技術(shù)四、免疫組織化學(xué)技術(shù)五、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù).一WesternBlot1原理：將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳別離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進行反響，洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，參加標記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反響一段時間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標記抗體，參加適合標記物的檢測試劑進行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進行特異性蛋白的半定量。.2操作過程SDS電泳轉(zhuǎn)膜〔PVDF或硝酸纖維素膜〕封閉一抗洗滌酶標二抗反響洗滌顯色或化學(xué)發(fā)光顯影...二、ELISA1原理：ELISA的根底是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。在測定時，受檢標本與固相載體外表的抗原或抗體起反響。再參加酶標記的抗原或抗體，也通過反響而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。參加酶反響的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。測定方法具有很高的敏感度〔pg-ng/ml水平〕，并且重復(fù)性好。.ELISA常用的酶和底物

辣根過氧化物酶，底物為OPD,深桔黃色，檢測波長492nm；TMB，藍綠色，檢測波長450nm堿性磷酸酶，底物為PNPP〔對－消基苯磷酸酯〕,黃色檢測波長405nm可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆?/p>

.ELISA各步驟及反響時間包被：24－36h，蛋白濃度