枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶試驗要點

枯草芽孢桿菌產(chǎn)a-淀粉酶發(fā)酵試驗化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院摘要：以枯草芽孢桿菌（BacilusSubtilisBF—7658）為實驗菌株，通過種子擴(kuò)大培養(yǎng)，選出生長力旺盛的菌株進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵。通過測定不同發(fā)酵時間生產(chǎn)的酶活，來初步估計發(fā)酵最佳時期和終點。關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌，a-淀粉酶，液體搖瓶發(fā)酵，酶活淀粉酶是能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，包括a-淀粉酶、。-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。芽孢桿菌主要用來產(chǎn)生a-淀粉酶和異淀粉酶，其中a-淀粉酶又稱淀粉1，4-糊精酶，能夠切開淀粉鏈內(nèi)部的a-1，4-糖苷鍵，將淀粉水解為麥芽糖、含有6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖；而異淀粉酶又稱淀粉a-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支鏈淀粉分子分枝點處的a-1，6-糖苷鍵，將支鏈淀粉的整個側(cè)鏈切下變成直鏈淀粉。通過發(fā)酵實驗，我們可以以酶活為依據(jù)，初步估計發(fā)酵的最佳時期和發(fā)酵終點。實驗材料和方法一、實驗材料：（一） 實驗菌株：以枯草芽孢桿菌（BacilusSubtilisBF—7658）（二） 培養(yǎng)基：1、 種子培養(yǎng)液葡萄糖1%Tryptone（胰蛋白月東）:1%,YeastExtract（酵母提取物）：0.5%,NaCl（氯化鈉）:1%調(diào)pH7.2若配置固體培養(yǎng)基，則再加入1.5%瓊脂。2、 產(chǎn)淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)液玉米粉2.0%黃豆餅粉1.5%CaCl20.02%MgSO40.02%NaCl0.25%K2HPO40.2%檸檬酸鈉0.2%硫酸銨0.075%Na2HPO40.2%調(diào)節(jié)pH值7.0（三） 0.02M磷酸緩沖液（pH6.0）（四） 實驗儀器離心機(jī)、水浴鍋、250mL三角瓶、試管二、 實驗1、 分別按培養(yǎng)基配方配制種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。2、 種子斜面及種子液準(zhǔn)備-A.挑取單菌落從平板轉(zhuǎn)接于新鮮種子斜面培養(yǎng)基，37』，24h作菌種（3支/組）。-B.將配好的種子培養(yǎng)液按每瓶50mL分裝于250mL三角瓶中滅菌（100KPa20min）。-C.在無菌操作條件下，將活化的菌株接種于以上培養(yǎng)液中（每支斜面接兩瓶），37°C120r/min振蕩培養(yǎng)16h作種子液。（6瓶/組）3、 發(fā)酵培養(yǎng)-按15-20%的接種量接種于裝有50mL已滅菌菌發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中。37C培養(yǎng)48h。-在無菌操作條件下，每4h取樣2mL,測定酶活。40-48h酶活降低后結(jié)束實驗。三、 a淀粉酶活性測定⑴上清酶液：發(fā)酵液0.8ml5000rpm/5min，吸取上清0.5ml備用。（2） 吸取0.1mL標(biāo)準(zhǔn)糊精溶液，轉(zhuǎn)入裝有0.3mL標(biāo)準(zhǔn)碘液的瓷板空穴中，以此作為比色的標(biāo)準(zhǔn)。（3） 在比色管中加入2%可溶性淀粉液20mL，加磷酸緩沖液5mL，在60C水浴中平衡約5min，加入0.5mL上清酶液，立即計時，并充分混勻。（4） 定時（?15s）取出0.1mL反應(yīng)液于預(yù)先盛有0.3ml比色標(biāo)準(zhǔn)碘液的比色瓷板孔內(nèi)，當(dāng)顏色反應(yīng)由紫色逐漸變?yōu)榧t棕色，與標(biāo)準(zhǔn)孔色相同時，即為反應(yīng)終點，記錄時間t四、 計算酶活計算淀粉酶活力酶活力（U/mL）=（60/tx20x2%xn）o0.5?式中t為反應(yīng)時間（分），-n為酶液稀釋倍數(shù)，0.5是使用的酶液量（mL）,20是可溶性淀粉溶液體積ml五、 溶液配制碘原液：-1.1克碘化鉀加少量水溶解，加入碘0.55克，溶解后定容至25ml,貯于棕色瓶中；0.02M磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH6.0）-稱取45.23g磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）、8.07g檸檬酸，用水溶解并定容至1000mL，配好后用pH計校正其pH至6.0。比色用標(biāo)準(zhǔn)碘液：-取碘原液2ml，加碘化鉀20g，蒸餾水定容至500ml貯于棕色瓶中；2%可溶淀粉：-稱取可溶淀粉2克加少量水調(diào)成糊狀，在攪拌下緩緩加入約70mL沸水中，然后用水分次沖洗殘余淀粉后加入沸水，繼續(xù)加熱煮沸至透明（約20min），冷卻后加水定容至100ml。（當(dāng)天配制）。標(biāo)準(zhǔn)糊精溶液-稱取分析純糊精0.06克加少量水調(diào)勻，傾入80-90ml沸水中，冷卻后加水定容到100ml結(jié)果a-淀粉酶產(chǎn)生的時間在上述培養(yǎng)條件下，12小時之前蛋白酶活力較低，36小時達(dá)到高峰，繼續(xù)培養(yǎng)至60小時，酶活逐漸下降，結(jié)果見表1。表a-淀粉酶活力與培養(yǎng)時間的關(guān)系.

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