章生物合成損傷修復(fù)

DNA的生物合成和損傷修復(fù)

DNABiosynthesisandDNADamageRepair第十五章第三篇基因信息傳遞DNA生物合成DNA復(fù)制（DNA指導(dǎo)的DNA合成）逆轉(zhuǎn)錄

(逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA指導(dǎo)的DNA合成)校正復(fù)制中可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤，并修復(fù)受到損傷的DNA。細(xì)胞中酶促修復(fù)系統(tǒng)：染色體DNA復(fù)制的一般特征ThegeneralfeaturesofreplicationofchromosomalDNA第一節(jié)一、DNA復(fù)制是半保留復(fù)制（1）全保留式（conservative），即恢復(fù)原來的DNA雙螺旋，并產(chǎn)生一個(gè)新的子代DNA雙螺旋；（2）半保留式（semiconservative），即新老搭配，由一條新合成的DNA鏈和一條復(fù)制模板鏈配對(duì)產(chǎn)生子代雙螺旋DNA；（3）散布式（dispersive），即復(fù)制模板鏈被分成許多小片段，散布于子代DNA中。兩條新合成的DNA鏈和兩條原來的復(fù)制模板鏈之間的結(jié)合方式可能性：密度梯度實(shí)驗(yàn)

——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制方式含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結(jié)果雙螺旋DNA復(fù)制時(shí)，復(fù)制區(qū)生長點(diǎn)的結(jié)構(gòu)呈Y形或叉形，稱之為復(fù)制叉。二、DNA復(fù)制的生長點(diǎn)形成復(fù)制叉目錄三、DNA復(fù)制是雙向復(fù)制

一個(gè)起點(diǎn)，兩個(gè)復(fù)制叉，雙向復(fù)制。兩個(gè)起點(diǎn)，兩個(gè)生長點(diǎn)，單向復(fù)制。一個(gè)起點(diǎn)，一個(gè)復(fù)制叉，單向復(fù)制。DNA鏈的合成3種方式：從一個(gè)DNA復(fù)制起點(diǎn)起始的DNA復(fù)制區(qū)域，它是一個(gè)獨(dú)立復(fù)制單位，包括復(fù)制起點(diǎn)和終點(diǎn)。復(fù)制子（replicon）前導(dǎo)鏈（leadingstrand）:DNA復(fù)制時(shí)，一條鏈的合成方向和復(fù)制叉前進(jìn)方向相同，可以連續(xù)復(fù)制合成的新鏈。后隨鏈（laggingstrand）:另一條鏈的合成方向與復(fù)制叉前進(jìn)方向相反，不能連續(xù)復(fù)制，只能分成若干小片段分別合成，然后連接起來形成新鏈。后隨鏈中的小片段稱為岡崎片段（Okazakifragments)。四、DNA復(fù)制為半不連續(xù)復(fù)制前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制，即DNA半不連續(xù)復(fù)制。3

5

3

5

3

5

3

5

前導(dǎo)鏈(leadingstrand)后隨鏈(laggingstrand)解鏈方向?qū)槠?

5

復(fù)制起點(diǎn)（origin）：指DNA復(fù)制所必需的一段特殊的DNA序列。五、復(fù)制起點(diǎn)由多個(gè)短重復(fù)序列組成E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

同向重復(fù)序列

反向重復(fù)序列5

3

5

3

酵母復(fù)制起點(diǎn)為自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicatingsequences，ARS）：酵母染色體含有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。元件A(富含A/T的共有序列)：結(jié)合一個(gè)特異的蛋白質(zhì)復(fù)合物──復(fù)制起點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物(ORC)。

3個(gè)序列(B1、B2和B3)可以增加復(fù)制起點(diǎn)的效率，其中B2的9個(gè)堿基與上述ARS共有序列相同。酵母復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)的一般特征:①由多個(gè)獨(dú)特的短重復(fù)序列組成。②短重復(fù)序列被多亞基的復(fù)制起始因子所識(shí)別并結(jié)合。③一般富含AT，利于雙螺旋DNA解旋，以產(chǎn)生單鏈DNA復(fù)制模板。DNA聚合酶不能從游離的核苷酸開始合成DNA鏈，必須由引物（primer）提供自由的3

-OH末端，通過加入核苷酸使之不斷延伸。所有細(xì)胞和多數(shù)病毒的DNA復(fù)制，首先利用模板合成一段RNA引物，這一過程為引發(fā)（priming）。RNA引物5

端的第一個(gè)核苷酸通常是pppA（個(gè)別為pppG）。六、DNA復(fù)制必須有引物（一）多數(shù)DNA復(fù)制使用RNA引物

174等噬菌體以雙鏈環(huán)形DNA的一條鏈上產(chǎn)生切口處的3

-OH為引物；腺病毒及某些線性DNA病毒以結(jié)合于病毒DNA的5

端磷酸基團(tuán)的末端蛋白上的dCTP的3

-OH為引物開始復(fù)制。（二）個(gè)別DNA復(fù)制以DNA或核苷酸為引物DNA聚合酶：催化合成DNADNA解旋酶（helicase）：解開DNA雙螺旋，暴露復(fù)制模板鏈引發(fā)酶：引發(fā)，即合成RNA引物，利用引物3’-OH開始延伸DNA連接酶：連結(jié)岡崎片段其它酶和蛋白因子七、DNA復(fù)制需要多種酶參與如：起穩(wěn)定作用的單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和改變DNA超螺旋狀態(tài)的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）等。DNA聚合酶的合成前誤差控制(presyntheticerrorcontrol)和校正控制(proofreadingcontrol)功能。細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)是DNA復(fù)制高度忠實(shí)性的重要因素。復(fù)制起始利用引物也是確保DNA復(fù)制忠實(shí)性的重要機(jī)制之一。八、DNA復(fù)制具有高度忠實(shí)性

DNA聚合酶的特征

FeaturesofDNApolymerases第二節(jié)一、DNA聚合酶的底物是dNTP和引物-模板連接處包括模板提供的單鏈DNA區(qū)（指導(dǎo)在引物的3

-OH加入互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸）和引物鏈-模板鏈互補(bǔ)雙鏈區(qū)兩部分。DNA聚合酶的底物：dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）引物-模板鏈接處(primer-templatejunction)二、DNA聚合酶的活性中心催化DNA合成DNA聚合酶具有監(jiān)控進(jìn)入的dNTP配對(duì)的能力。DNA聚合酶還能夠區(qū)分rNTP和dNTP，DNA聚合酶的活性中心對(duì)rNTP有空間排斥作用。只有當(dāng)正確的堿基配對(duì)形成之時(shí)，引物的3

-OH和進(jìn)入的dNTP的

-磷酸基團(tuán)才能處于適當(dāng)?shù)奈恢?，發(fā)生催化反應(yīng)，形成3

,5

-磷酸二酯鍵。三、DNA聚合酶半閉合右手結(jié)構(gòu)有3個(gè)結(jié)構(gòu)域聚合酶活性中心，位于手掌上部，即手指和拇指接合部；3

5

外切酶活性中心，位于手掌底部。手掌結(jié)構(gòu)域手指結(jié)構(gòu)域拇指結(jié)構(gòu)拇指手掌引物鏈?zhǔn)种妇酆厦富钚灾行耐馇忻富钚灾行哪０彐溔齻€(gè)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域的功能參與DNA聚合酶的構(gòu)象變化；結(jié)合模板鏈，使模板鏈在活性中心附近彎曲，導(dǎo)致模板鏈僅引物后面第一個(gè)堿基暴露于活性中心，以避免模板鏈的堿基與即將進(jìn)入的核苷酸堿基配對(duì)時(shí)發(fā)生混淆。手掌結(jié)構(gòu)域手指結(jié)構(gòu)域拇指結(jié)構(gòu)域具有聚合酶活性和監(jiān)測、校正功能。與合成的DNA相互作用，維持引物-模板鏈在活性中心的正確定位；使DNA聚合酶緊密結(jié)合底物并獲得連續(xù)合成DNA的能力。DNA聚合酶合成的進(jìn)行性（processivity）：即DNA聚合酶每次結(jié)合引物-模板連接處能夠引入一定數(shù)目的核苷酸。DNA聚合酶（核心酶）和一種可沿DNA滑動(dòng)的DNA夾子（slidingclamp）蛋白質(zhì)之間相互作用，可以進(jìn)一步增強(qiáng)DNA聚合酶的進(jìn)行性。四、可滑動(dòng)的DNA夾子增強(qiáng)DNA聚合酶的進(jìn)行性DNA聚合酶3

5

外切酶活性可以在新合成的DNA鏈的3’端去除錯(cuò)配的核苷酸。五、DNA聚合酶還有一個(gè)3’

5’外切酶活性中心DNA聚合酶手掌結(jié)構(gòu)域與錯(cuò)配堿基、新進(jìn)入的dNTP作用減弱，新合成的DNA鏈3

端的幾何形狀發(fā)生改變，DNA合成速度降低，3

5

外切酶活性增加；錯(cuò)配的DNA對(duì)聚合酶活性中心的親和力降低，引物-模板連接處從聚合酶活性中心滑動(dòng)到3

5

外切酶活性中心。錯(cuò)配的堿基被消除后，正確配對(duì)的引物-模板連接處又滑動(dòng)回到聚合酶活性中心，繼續(xù)合成DNA。作用過程：大腸桿菌DNA復(fù)制DNAreplicationinE.coli第三節(jié)一、在復(fù)制起點(diǎn)解旋酶和多種因子形成復(fù)合物DnaA、DnaB、DnaC、HU、促旋酶（gyrase，即拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ）、單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandbindingprotein,SSB)DNA復(fù)制需要6種蛋白因子：E.coliDNA復(fù)制起始

結(jié)合oriC的4個(gè)9bp反向重復(fù)序列形成復(fù)制起始復(fù)合物。作用于oriC的3個(gè)13bp正向重復(fù)序列，DNA在這3個(gè)位點(diǎn)解鏈，形成開放型復(fù)合物（opencomplex）。DnaA蛋白5

3

解旋酶作用產(chǎn)生兩條復(fù)制模板鏈激活引發(fā)酶DnaG蛋白DnaB蛋白與引發(fā)酶結(jié)合，形成引發(fā)體DnaB蛋白使一條DNA鏈圍繞著另一條旋轉(zhuǎn)，消除解旋產(chǎn)生的張力。促旋酶SSB蛋白HU蛋白穩(wěn)定解旋后的單鏈DNA構(gòu)象，有助于解旋。DNA結(jié)合蛋白，對(duì)復(fù)制起促進(jìn)作用。HU蛋白能夠使DNA發(fā)生折疊。E.coli中DnaB結(jié)合引發(fā)酶DnaG，催化合成RNA引物，其序列始于pppAG，模板鏈序列3

-GTC-5

，引物長度一般11~12個(gè)堿基。二、引發(fā)酶合成RNA引物負(fù)責(zé)切除RNA引物。三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA聚合酶Ⅰ可利用損傷尚未修復(fù)的DNA鏈作為模板合成DNA，但不能修復(fù)損傷。負(fù)責(zé)合成DNA。DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶ⅡTLS1Rev1TLS，體細(xì)胞高變1Pol

相對(duì)準(zhǔn)確的TLS（穿越環(huán)丁烷二聚體）1Pol

TLS1Pol

體細(xì)胞高變（somatichypermutation）1Pol

減數(shù)分裂相關(guān)的DNA損傷修復(fù)1Pol

TLS1Pol

DNA交聯(lián)損傷修復(fù)1Pol

DNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)4Pol

DNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)2~3Pol

線粒體DNA復(fù)制和損傷修復(fù)3Pol

堿基切除修復(fù)1Pol

合成引物4Pol

功能亞基數(shù)目真核生物TLS（translesionsynthesis）3PolⅤ(UmuC,UmuD)DNA損傷修復(fù)，穿越損傷合成（TLS）1PolⅣ(DinB)染色體DNA復(fù)制9PolⅢ全酶染色體DNA復(fù)制3PolⅢ核心酶DNA損傷修復(fù)1PolⅡ去除RNA引物，DNA損傷修復(fù)1PolⅠ功能亞基數(shù)目原核生物（E.coli）原核、真核細(xì)胞DNA聚合酶的類型和功能目錄２個(gè)核心酶1個(gè)

-復(fù)合物（

、

、

、

、

、

6種亞基）可滑動(dòng)的DNA夾子（含1對(duì)

-亞基）DNA聚合酶Ⅲ全酶結(jié)構(gòu)全酶結(jié)構(gòu)包括：

亞基（130000）主要功能是合成DNA

亞基具有3

5

外切酶活性（校正功能）

亞基可增強(qiáng)其活性

亞基可能起組裝作用核心酶由

、

和

亞基組成：2個(gè)

-亞基分別和1個(gè)核心酶相互作用，其柔性連接區(qū)可以確保在復(fù)制叉1個(gè)全酶分子的2個(gè)核心酶能夠相對(duì)獨(dú)立運(yùn)動(dòng)，分別負(fù)責(zé)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈。功能：

-復(fù)合物是DNA夾子加載蛋白，負(fù)責(zé)將可沿DNA鏈滑動(dòng)的一對(duì)

-亞基（DNA夾子）加載于DNA，使DNA聚合酶Ⅲ具有持續(xù)合成能力。

-復(fù)合物由6種亞基組成：

、

、

、

、

、

在復(fù)制叉同時(shí)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈5

3

外切酶：去除RNA引物3

5

外切酶：起校正作用DNA聚合酶活性：填補(bǔ)兩個(gè)岡崎片段之間的缺口DNA聚合酶Ⅰ有3個(gè)酶促活性結(jié)構(gòu)域:323個(gè)氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段：Klenow片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端枯草桿菌蛋白酶DNA-polⅠDNA連接酶（ligase）將兩個(gè)岡崎片段之間的缺口的3

羥基和5

磷酸基團(tuán)連接起來。Tus蛋白具有反解旋酶（contra-helicase）活性，識(shí)別并結(jié)合ter序列中共有序列，阻止DnaB蛋白的解旋作用，從而抑制復(fù)制叉前進(jìn)。Tus蛋白除了使復(fù)制叉停止運(yùn)動(dòng)以外，還可能造成復(fù)制體解體。四、Tus蛋白識(shí)別復(fù)制終點(diǎn)使復(fù)制終止在復(fù)制叉匯合點(diǎn)兩側(cè)約100kb處各有一個(gè)終止區(qū)（terD/A和terC/B）。當(dāng)oriC處于半甲基化狀態(tài)時(shí)，SeqA蛋白迅速結(jié)合半甲基化的GATC，阻止Dam甲基化酶與之結(jié)合，使復(fù)制起點(diǎn)不能被完全甲基化，同時(shí)阻止DnaA蛋白結(jié)合oriC。oriC的GATC被完全甲基化，DnaA蛋白就能與之結(jié)合，開始新的一輪復(fù)制。五、DNA甲基化保證復(fù)制起點(diǎn)在每個(gè)復(fù)制周期中僅起一次作用E.coli復(fù)制起點(diǎn)oriC含有11個(gè)拷貝GATC，這一回文序列中的A是Dam甲基化酶的靶位點(diǎn)。在復(fù)制過程中，DNA每復(fù)制10bp，復(fù)制叉前方的模板DNA雙螺旋就要繞其長軸旋轉(zhuǎn)一周，產(chǎn)生正超螺旋。拓?fù)洚悩?gòu)酶是一種可逆的核酸酶。它們可共價(jià)結(jié)合DNA分子上的磷酸基團(tuán)，切斷磷酸二酯鍵。六、DNA復(fù)制需要兩類DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶消除正超螺旋，使復(fù)制叉能夠順利前進(jìn)。維持E.coli、噬菌體和質(zhì)粒DNA復(fù)制起始模板DNA負(fù)超螺旋狀態(tài)。環(huán)形染色體復(fù)制后產(chǎn)生的兩個(gè)子染色體連環(huán)體解連環(huán)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶功能：E.coIi的TopoⅠ只作用于負(fù)超螺旋DNA，消除負(fù)超螺旋。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的功能：E.coli的TopoⅡ?qū)⑶胺疆a(chǎn)生的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的功能E.coli

的TopoⅣ功能是將復(fù)制產(chǎn)生的兩個(gè)子染色體從連環(huán)體中分離出來，催化連環(huán)和去連環(huán)過程。真核細(xì)胞DNA復(fù)制DNAreplicationineukaryotes第四節(jié)真核生物復(fù)制子多、岡崎片段短、復(fù)制叉前進(jìn)速度慢等；DNA復(fù)制從引發(fā)進(jìn)入延伸階段發(fā)生DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換；切除岡崎片段RNA引物的是核酸酶RNAseHⅠ和FEN1等。真核生物與原核生物DNA復(fù)制的差異：一、常見的真核細(xì)胞DNA聚合酶有5種A家族與大腸桿菌PolⅠ同源，包括Pol

和Pol

B家族與大腸桿菌PolⅡ同源，包括Pol

、

、

和ζC家族與大腸桿菌PolⅢ同源，僅在真菌中發(fā)現(xiàn)X家族與大腸桿菌DNA聚合酶并無同源性，卻與末端轉(zhuǎn)移酶同源，成員包括Pol

、

、

Y家族（UmuC/DinB超家族），近年發(fā)現(xiàn)一個(gè)特殊的真核及原核DNA聚合酶家族，成員包括Pol

、

、

和Rev1。

Pol

負(fù)責(zé)合成引物Pol

負(fù)責(zé)DNA復(fù)制、核苷酸切除修復(fù)和堿基切除修復(fù)Pol

的功能與Pol

相似（其確切功能尚待定）Pol

可能和堿基切除修復(fù)有關(guān)Pol

負(fù)責(zé)線粒體DNA復(fù)制和損傷修復(fù)常見的真核DNA聚合酶有5種：拓?fù)洚悩?gòu)酶，去除負(fù)超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除復(fù)制叉前方產(chǎn)生的正超螺旋TolⅠ和TolⅡDNA雙螺旋解鏈，參與組裝引發(fā)體DNA解旋酶連接岡崎片段DNA連接酶Ⅰ核酸酶，切除RNA引物RNAseHⅠ核酸酶，切除RNA引物FEN1DNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)Pol

/

合成RNA-DNA引物Pol

/引發(fā)酶有依賴DNA的ATPase活性，結(jié)合于引物-模板鏈，激活DNA聚合酶，促使PCNA結(jié)合于引物-模板鏈RFC激活DNA聚合酶和RFC的ATPase活性PCNA單鏈DNA結(jié)合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易結(jié)合DNARPA功能蛋白質(zhì)真核DNA復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的功能二、真核DNA復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的類型和功能與原核基本相似DNA聚合酶

（Pol

）分子含有4個(gè)亞基：（一）DNA聚合酶

/引發(fā)酶復(fù)合物合成RNA-DNA引物p180：催化亞基p48：具有引發(fā)酶活性p58：p48的穩(wěn)定性和活性所必需的p70：與組裝引發(fā)體有關(guān)功能：合成RNA引物反應(yīng)過程：調(diào)節(jié)：磷酸化的調(diào)節(jié)作用Pol

/引發(fā)酶復(fù)合物首先，合成RNA引物；其次，利用DNA聚合酶活性將引物延伸，產(chǎn)生起始DNA（initiatorDNA，iDNA）短序列，形成RNA-DNA引物；最后，Pol

/引發(fā)酶脫離模板鏈DNA，發(fā)生DNA聚合酶轉(zhuǎn)換（switch）。結(jié)構(gòu)：

p70、p34和p11組成異源三聚體功能：

（二）RPA的功能與E.coli的SSB相似復(fù)制蛋白A（replicationproteinA，RPA）結(jié)合單鏈DNA促使雙螺旋DNA解旋激活Pol

/引發(fā)酶活性為Pol

依賴復(fù)制因子C（RFC）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）合成DNA所必需。RPA三聚體與SV40T抗原結(jié)合，組裝引發(fā)體復(fù)合物所必需RPA參與DNA重組和修復(fù)。p140結(jié)合PCNAp40、p37和p36組成穩(wěn)定的核心復(fù)合物，具有依賴DNA的ATPase活性p38可能在p140和核心復(fù)合物之間起連接作用（三）RFC與E.coliDNA聚合酶Ⅲ的

-復(fù)合物功能相似復(fù)制因子C（replicationfactorC，RFC）結(jié)構(gòu)：有p140，p40，p38，p37、p365個(gè)亞基促使可滑動(dòng)的DNA夾子PCNA結(jié)合于引物-模板鏈，是Pol

在模板DNA鏈上組裝并形成具有持續(xù)合成能力全酶所必需的。RFC的功能：PCNA是Pol

的進(jìn)行性因子，使Pol

獲得持續(xù)合成能力。PCNA是協(xié)調(diào)DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、表觀遺傳和細(xì)胞周期調(diào)控的核心因子。PCNA水平是檢測細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)。PCNA能激活Pol

。（四）PCNA是可滑動(dòng)的DNA夾子增殖細(xì)胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）結(jié)構(gòu)：功能：同源三聚體，可形成閉合環(huán)形的可滑動(dòng)DNA夾子。p125：催化亞基，具有DNA聚合酶活性和3

5

核酸外切酶活性，其N端區(qū)與PCNA相互作用。p50：輔助PCNA激活p125（五）DNA聚合酶

合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈結(jié)構(gòu)：Pol

分子是異源二聚體（p125和p50）功能：Pol

合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈。DNA聚合酶

FEN1（flapendonuclease1）具有核酸內(nèi)切酶和5

3

核酸外切酶活性。FEN1參與去除岡崎片段5

端的RNA引物。（六）FEN1和RNAseHⅠ切除RNA引物RNAseHⅠ是核酸內(nèi)切酶，參與岡崎片段成熟時(shí)切除5

端RNA引物，底物RNA連接在DNA鏈的5

端，切割后在DNA鏈的5

端殘留一個(gè)核糖核苷酸，這個(gè)核苷酸再被FEN1切除。DNA復(fù)制需要DNA解旋酶打開DNA雙螺旋，使復(fù)制模板鏈得以暴露。（七）DNA解旋酶打開雙螺旋以暴露復(fù)制模板（八）真核復(fù)制叉有1個(gè)Pol

和2個(gè)Pol

復(fù)合物真核DNA復(fù)制叉模型Pol

/引發(fā)酶 合成RNA-DNA引物Pol

合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈RFC 識(shí)別引物iDNA的3

端并驅(qū)除Pol

/引發(fā)酶PCNA 結(jié)合DNA并引入Pol

RNAseHI/FEN1切除岡崎片段5

端的RNA引物真核生物復(fù)制過程中酶及功能Pol

（或Pol

） 填補(bǔ)岡崎片段之間的空隙DNA連接酶Ⅰ 封口RPA 穩(wěn)定解旋后的單鏈DNA解旋酶 復(fù)制叉的形成和移動(dòng)必不可少拓?fù)洚悩?gòu)酶 釋放復(fù)制叉前進(jìn)時(shí)產(chǎn)生的扭曲應(yīng)力三、引發(fā)和延伸發(fā)生DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換識(shí)別染色體DNA復(fù)制起點(diǎn)和DNA局部解旋后，Pol

/引發(fā)酶復(fù)合物結(jié)合于復(fù)制起點(diǎn)，這一步叫做引發(fā)體組裝。引發(fā)體組裝包括DNA解旋酶與Pol

/引發(fā)酶相互作用。（一）解旋酶與Pol

/引發(fā)酶相互作用組裝引發(fā)體前導(dǎo)鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期后隨鏈：發(fā)生于每個(gè)岡崎片段合成之際發(fā)生DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換的原因是Pol

不具備持續(xù)合成能力。DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白是RFC。（二）DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換真核DNA聚合酶轉(zhuǎn)換和后隨鏈合成首先RNAseHⅠ利用核酸內(nèi)切酶活性切割連接在岡崎片段5

端的RNA片段，在RNA-DNA引物連接點(diǎn)旁留下1個(gè)核糖核苷酸；然后FEN1利用5

3

核酸外切酶活性切除這最后一個(gè)核糖核苷酸。四、切除RNA引物有兩種機(jī)制解旋酶Dna2具有依賴DNA的ATPase和3

5

解旋酶活性，其解旋作用可以使前一個(gè)岡崎片段的5

端引物形成“蓋子”結(jié)構(gòu)，再由FEN1的內(nèi)切酶活性切除引物。依賴RNAseHⅠ/FEN1切除方式：依賴Dna2/FEN1切除方式：切除RNA引物的兩種機(jī)制RNAseHⅠ/FEN1Dna2/FEN1真核所有染色體DNA復(fù)制僅僅出現(xiàn)在細(xì)胞周期的S期，而且只能復(fù)制一次。五、真核染色體在每個(gè)細(xì)胞周期中只能復(fù)制一次（一）前復(fù)制復(fù)合物在G1期形成而在S期被激活真核細(xì)胞DNA復(fù)制的起始分兩步進(jìn)行，即復(fù)制基因的選擇和復(fù)制起點(diǎn)的激活。復(fù)制基因（replicator）是指DNA復(fù)制起始所必需的全部DNA序列。復(fù)制基因的選擇出現(xiàn)于G1期，基因組的每個(gè)復(fù)制基因位點(diǎn)均組裝前復(fù)制復(fù)合物（pre-replicativecomplex，pre-RC）。復(fù)制起點(diǎn)的激活出現(xiàn)于細(xì)胞進(jìn)入S期以后，這一階段將激活pre-RC，募集若干復(fù)制基因結(jié)合蛋白和DNA聚合酶，并起始DNA解旋。在原核細(xì)胞中，復(fù)制基因的識(shí)別與DNA解旋、募集DNA聚合酶偶聯(lián)進(jìn)行。而在真核細(xì)胞中，這兩個(gè)階段相分離可以確保每個(gè)染色體在每個(gè)細(xì)胞周期中僅復(fù)制一次。ORC至少募集兩種解旋酶加載蛋白Cdc6和Cdt1。復(fù)制起點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物（origin

recognitioncomplex，ORC）識(shí)別并結(jié)合復(fù)制基因。三種蛋白質(zhì)一起募集真核細(xì)胞解旋酶Mcm2-7。前復(fù)制復(fù)合物（pre-RC）的形成pre-RC磷酸化導(dǎo)致在復(fù)制起點(diǎn)組裝其它復(fù)制因子并起始復(fù)制，復(fù)制因子包括3種DNA聚合酶。DNA聚合酶在復(fù)制起點(diǎn)按一定順序組裝：首先Pol

和Pol

結(jié)合，然后是Pol

/引發(fā)酶。在S期，pre-RC被蛋白激酶（Ddk和Cdk）磷酸化，從而被激活。pre-RC的激活和組裝真核DNA復(fù)制叉（1）激活pre-RC，以起始DNA復(fù)制；（2）抑制形成新的pre-RC。（二）Cdk控制pre-RC的形成和激活真核細(xì)胞通過依賴細(xì)胞周期蛋白的蛋白激酶（cyclin-dependentkinases，Cdk）嚴(yán)格控制pre-RC的形成和激活。Cdk功能：在每個(gè)細(xì)胞周期過程中，僅有一次機(jī)會(huì)形成pre-RC，也僅有一次機(jī)會(huì)激活pre-RC。pre-RC在被激活后即解體，所暴露的復(fù)制基因可形成新的pre-RC并迅速結(jié)合ORC。但在S、G2和M期，高活性的Cdk抑制pre-RC的其它組分結(jié)合ORC。只有當(dāng)染色體分離和細(xì)胞分裂完成時(shí)，Cdk的活性消失，新的pre-RC才能形成。六、端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問題前導(dǎo)鏈產(chǎn)生完整的子染色單體。后隨鏈3

端留下縮短的未復(fù)制的ssDNA區(qū)。端粒（telomeres）由富含TG的重復(fù)序列組成。人的端粒重復(fù)序列為5’-TTAGGG-3

。這些重復(fù)序列多為雙鏈，但每個(gè)染色體的3’端比5

端長，形成單鏈ssDNA。這一特殊結(jié)構(gòu)可解決染色體末端復(fù)制問題。端粒酶（telomerase）是一種核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白質(zhì)組成。端粒酶以自己的RNA組分作為模板，以染色體的3

端ssDNA（后隨鏈模板）為引物，將端粒序列添加于染色體的3

端。這些新合成的DNA為單鏈。線粒體和噬菌體的DNA復(fù)制DNAreplicationinmitochondriaand

phages第五節(jié)線粒體DNA的D環(huán)（D-loop）復(fù)制噬菌體的滾環(huán)（rollingcircle）復(fù)制一、線粒體DNA按D環(huán)方式復(fù)制環(huán)形、雙螺旋DNA分子兩條鏈一條為重鏈（H鏈），另一條為輕鏈（L鏈）dNTPDNA-polγ

線粒體DNA分子特點(diǎn)：有特異的復(fù)制起點(diǎn)；環(huán)形線粒體DNA兩條鏈（H和L）的復(fù)制不同步D環(huán)或取代環(huán)（displacementloop）：線粒體DNA復(fù)制開始以H鏈作為模板合成新的L鏈，取代原來的L鏈并和H鏈互補(bǔ)，而原來的L鏈則保持單鏈狀態(tài)，形成類似英文字母D的區(qū)域；兩條鏈具有不同的復(fù)制起點(diǎn)和相反的合成方向；線粒體DNA復(fù)制也需要RNA引物。線粒體DNA復(fù)制特點(diǎn)：二、噬菌體DNA按滾環(huán)方式復(fù)制環(huán)形雙螺旋DNA分子；一條為模板鏈，另一條為非模板鏈。E.coli噬菌體DNA的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：僅以一條鏈作為模板合成若干環(huán)形DNA分子拷貝；噬菌體DNA復(fù)制的方式是滾環(huán)復(fù)制。噬菌體DNA復(fù)制特點(diǎn)：噬菌體DNA復(fù)制首先由它自己編碼的A蛋白在非模板鏈上造成缺口，再以所產(chǎn)生的游離3

端羥基作為引物，并在宿主細(xì)胞的DNA聚合酶、解旋酶和SSB蛋白等作用下合成新鏈，新鏈和模板鏈互補(bǔ)并取代了原來的非模板鏈。這種復(fù)制方式稱為滾環(huán)復(fù)制。滾環(huán)復(fù)制：3

-OH5

-P5

5

5

3

3

3

3

5'滾環(huán)復(fù)制5'

5

3

3

5

雙螺旋DNA在復(fù)制起點(diǎn)解鏈不一定導(dǎo)致兩條鏈同時(shí)復(fù)制，也可能利用一條鏈作為模板起始DNA合成。雙螺旋DNA的兩條DNA鏈的復(fù)制起點(diǎn)也可能處于不同的位置。滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)不對(duì)稱復(fù)制的存在說明：DNA損傷修復(fù)TheRepairofDNADamage第六節(jié)一、復(fù)制差錯(cuò)和化學(xué)/物理因素造成體內(nèi)DNA損傷DNA復(fù)制產(chǎn)生誤差化學(xué)或物理損傷轉(zhuǎn)座子（transposons）的轉(zhuǎn)座作用遺傳信息的突變來源：首先，在基因組中迅速找到錯(cuò)配的核苷酸；然后，準(zhǔn)確地校正錯(cuò)配核苷酸。二、錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)DNA復(fù)制中出現(xiàn)的差錯(cuò)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)（mismatchrepairsystem）能夠發(fā)現(xiàn)和修復(fù)DNA復(fù)制中錯(cuò)配的核苷酸，提高復(fù)制準(zhǔn)確率。錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)：（一）E.coli依賴Dam甲基化酶識(shí)別錯(cuò)配堿基所在的DNA鏈MutSMutLMutH錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)組成E.coli錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)復(fù)制差錯(cuò)Dam甲基化酶（methylase）使E.coli處于暫時(shí)的半甲基化狀態(tài)，標(biāo)記母鏈和新合成的DNA鏈，幫助新合成的DNA鏈被錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)識(shí)別并修復(fù)。模板鏈的GATC序列甲基化MutH僅切割新合成的DNA鏈MutH的切口位于錯(cuò)配核苷酸的5

側(cè)，使用外切酶Ⅶ或RecJ，按5

3

方向降解DNA；切口位于錯(cuò)配的3’側(cè)，則使用外切酶Ⅰ，按3

5

方向降解DNA。DNA聚合酶Ⅲ填補(bǔ)所產(chǎn)生單鏈DNA缺口。MSH（MutShomologs）蛋白與MutL同源的MLH和PMS蛋白（二）真核細(xì)胞利用岡崎片段連接前的DNA缺口辨別錯(cuò)配堿基所在的DNA鏈真核細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)無MutH，也無半甲基化標(biāo)記母鏈。錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)利用岡崎片段連接前的DNA缺口辨別錯(cuò)配堿基所在的DNA鏈。真核細(xì)胞核苷酸修復(fù)錯(cuò)配系統(tǒng)：三、多種化學(xué)或物理因素造成細(xì)胞DNA損傷堿基丟失堿基改變核苷酸插入或缺失DNA鏈斷裂DNA鏈間共價(jià)交聯(lián)DNA損傷類型其一，導(dǎo)致復(fù)制或轉(zhuǎn)錄障礙其二，導(dǎo)致復(fù)制后產(chǎn)生基因突變DNA損傷的結(jié)果:四、DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)有多種類型DNA聚合酶（Y-家族），如E.coli：UmuC嘧啶二聚體，無嘌呤位點(diǎn)跨損傷DNA合成E.coli：RecA和RecBCD雙鏈斷裂重組修復(fù)E.coli：UvrA,UvrB,UvrC,UvrD人：XPC,XPA,XPD,ERCCI-XPF,XPG嘧啶二聚體，堿基烷基化核苷酸切除修復(fù)DNA糖苷酶（即DNA糖基水解酶）堿基損傷堿基切除修復(fù)E.coli：DNA光裂合酶等嘧啶二聚體直接修復(fù)E.coli：MutS,MutL,MutH人：MSH,MLH,PMS復(fù)制差錯(cuò)錯(cuò)配修復(fù)酶損傷修復(fù)系統(tǒng)的類型修復(fù)對(duì)象：將DNA中因紫外線照射而形成的嘧啶二聚體分解。機(jī)制：細(xì)胞內(nèi)光裂合酶（photolyases）分子中生色基團(tuán)次甲四氫葉酸吸收光子并將FADH2激活生成的激發(fā)型FADH2，再將電子轉(zhuǎn)移給嘧啶二聚體，使其還原。分布：分布廣泛，除哺乳動(dòng)物外均有之。（一）直接修復(fù)（directrepair）系統(tǒng)利用酶簡單地逆轉(zhuǎn)DNA損傷光復(fù)活修復(fù)系統(tǒng)：修復(fù)對(duì)象：DNA中被甲基化修飾的鳥嘌呤（O6-甲基鳥嘌呤，與T配對(duì)）。機(jī)制：將甲基轉(zhuǎn)移到酶蛋白活性中心的Cys殘基側(cè)鏈上，使鳥嘌呤復(fù)原，避免發(fā)生突變。特點(diǎn)：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶一旦接受甲基就不再具有催化活性，修復(fù)代價(jià)高昂。O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶修復(fù)糖苷酶（glycosylases）識(shí)別、切除受損堿基，產(chǎn)生AP位點(diǎn)（apurinicorapyrimidinicsite）。AP內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)的5’端切斷磷酸二酯鍵。AP外切酶再切割A(yù)P位點(diǎn)的3’端。DNA聚合酶填補(bǔ)產(chǎn)生的缺口。最后DNA連接酶連接。（二）堿基切除系統(tǒng)修復(fù)切除受損堿基堿基切除修復(fù)（baseexcisionrepair,BER）對(duì)象：受損的堿基修復(fù)系統(tǒng)：E.coli堿基切除修復(fù)系統(tǒng)切除胞嘧啶自發(fā)脫氨基產(chǎn)生的尿嘧啶胞嘧啶脫氨基產(chǎn)生的尿嘧啶；氧化的鳥嘌呤（oxoG）；脫氨基的腺嘌呤；開環(huán)堿基；碳原子之間雙鍵變成單鍵的堿基等。

DNA糖苷酶識(shí)別的異常堿基包括：功能：利用DNA糖苷酶切除DNA復(fù)制前未去除的損傷堿基。自動(dòng)防故障（fail-safe）系統(tǒng)堿基切除修復(fù)系統(tǒng)切除鳥嘌呤氧化產(chǎn)物oxoGDNA聚合酶和連接酶以未損傷的DNA鏈為模板修補(bǔ)缺口。（三）核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)識(shí)別DNA雙螺旋變形核苷酸切除修復(fù)（nucleotideexcisionrepair,NER）系統(tǒng)識(shí)別DNA雙螺旋形狀的變形。E.coli的NER主要由4種蛋白質(zhì)組成：UvrAUvrBUvrCUvrD

UvrA識(shí)別DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)變形UvrB負(fù)責(zé)解鏈，募集核酸內(nèi)切酶UvrCUvrC在損傷部位的兩側(cè)切斷DNA鏈UvrD去除這兩個(gè)切點(diǎn)之間的DNA片段DNA聚合酶Ⅰ和連接酶填補(bǔ)缺口核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)XPC蛋白負(fù)責(zé)發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋中的變形XPA和XPD蛋白具有解旋酶活性核酸酶ERCC1-XPF切割損傷部位5’側(cè)，XPG切割3’側(cè)DNA聚合酶和連接酶負(fù)責(zé)填補(bǔ)產(chǎn)生的缺口高等真核生物的NER作用：NER不僅能夠修復(fù)整個(gè)基因組中的損傷，而且能拯救因轉(zhuǎn)錄模板鏈損傷而暫停轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶，即參與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)（transcription-coupledrepair）。作用方式：NER蛋白質(zhì)被募集于暫停的RNA聚合酶。轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)的意義：將修復(fù)酶集中于正在轉(zhuǎn)錄DNA，使該區(qū)域的損傷盡快得以修復(fù)。一、在核苷酸切除修復(fù)（包括轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)）時(shí)起DNA解旋酶的作用；二、在轉(zhuǎn)錄過程中打開DNA模板。真核轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)的核心是TFⅡH。TFⅡH分別參與兩個(gè)獨(dú)立過程：對(duì)于DNA雙鏈斷裂（double-strandbreak，DSB）損傷，細(xì)胞采用雙鏈斷裂修復(fù)，即重組修復(fù)（binationalrepair），通過與姐妹染色體正?？截惖耐粗亟M來恢復(fù)正確的遺傳信息。（四）重組修復(fù)系統(tǒng)能夠修復(fù)雙鏈斷裂