通過原位易錯(cuò)PCR一步構(gòu)建基因突變文庫(kù)

通過原位易錯(cuò)PCR—步構(gòu)建基因突變文庫(kù)王未未2張永昌2劉明杰2邵蔚藍(lán)1*【摘要】主要介紹一種通過原位易錯(cuò)PCR構(gòu)建隨機(jī)突變文庫(kù)的新技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)室最近發(fā)表的一項(xiàng)國(guó)際專利中，利用來源于海棲熱孢菌的極耐熱性DNA連接酶，在傳統(tǒng)PCR循環(huán)中加入一個(gè)連接步驟，即變性—退火—延伸—連接的四步循環(huán)法PCR，從而實(shí)現(xiàn)環(huán)狀質(zhì)粒的PCR指數(shù)擴(kuò)增(PPCP)。原位易錯(cuò)PCR中所用引物為一段線性雙鏈DNA，它含有與模板質(zhì)粒不同的篩選標(biāo)記，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌后，模板質(zhì)粒在篩選平板上被直接剔除。篩選到的陽(yáng)性突變子可用作模板直接進(jìn)入突變文庫(kù)的再次構(gòu)建，通過篩選獲得二級(jí)或多級(jí)累加的正突變。利用這種方法構(gòu)建了一個(gè)木聚糖酶基因和一個(gè)纖維素酶基因的隨機(jī)突變文庫(kù)，并篩選出具有正向突變的蛋白，證明以PPCP為基礎(chǔ)的原位易錯(cuò)PCR技術(shù)，為基因定向進(jìn)化提供了一種快速有效的隨機(jī)突變文庫(kù)構(gòu)建的新方法。期刊名稱】微生物學(xué)通報(bào)年(卷),期】2014(041)004總頁(yè)數(shù)】6【關(guān)鍵詞】定向進(jìn)化，隨機(jī)突變文庫(kù)，原位易錯(cuò)PCR，環(huán)狀質(zhì)粒擴(kuò)增(PPCP)基因定向進(jìn)化已經(jīng)成為蛋白質(zhì)工程中的一項(xiàng)重要技術(shù)。體外定向進(jìn)化不僅為研究酶的底物特異性和確定酶的催化活性位點(diǎn)、改善酶的熱穩(wěn)定性以及提高酶的作用溫度等方面提供了強(qiáng)有力的手段，而且有助于了解蛋白結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系［1-5］。在分子生物技術(shù)的發(fā)展過程中人們不斷地發(fā)展基因體外進(jìn)化和重組的方法，現(xiàn)在已經(jīng)建立了多種用于構(gòu)建隨機(jī)突變文庫(kù)的方法［6］。最常用的隨機(jī)突變的方法是易錯(cuò)PCR［7］。其原理是在PCR過程中通過調(diào)整Mg2+和Mn2+濃度等因素，提高Taq酶在擴(kuò)增過程中引入錯(cuò)配堿基的頻次，導(dǎo)致目標(biāo)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生適量的隨機(jī)突變［8］。早期的通過易錯(cuò)PCR構(gòu)建突變文庫(kù)的步驟包括：⑴以目標(biāo)基因?yàn)槟０逶谝族e(cuò)條件下進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出含有錯(cuò)配堿基的突變基因；(2)對(duì)易錯(cuò)PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體進(jìn)行酶切；(3)用DNA連接酶將突變基因連接到表達(dá)載體上；(4)將重組的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，獲得帶有各種不同突變基因的重組細(xì)胞群體，即基因突變文庫(kù)。構(gòu)建一個(gè)多樣化的基因突變文庫(kù)，需要從成千上萬個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選出所需要的正突變基因；上述方法就顯得很繁瑣，工作量很大［9-12］。另外，用Taq酶進(jìn)行的易錯(cuò)PCR會(huì)在DNA鏈的3’末端帶一個(gè)多余的堿基，因此在克隆前還需要修補(bǔ)DNA鏈或去除此堿基［13］。而且通過這種方法構(gòu)建的文庫(kù)中常常會(huì)產(chǎn)生不帶有目的基因片段或是帶有多個(gè)目的基因片段的質(zhì)粒［14］。因此早期發(fā)明的突變文庫(kù)的構(gòu)建方法步驟繁瑣、效率低下。為了提高構(gòu)建基因突變文庫(kù)的效率，Miyazaki和Takenouchi于2002年提出特大引物全質(zhì)粒擴(kuò)增法(Mega-WH0P)［15］;Wei等2004年對(duì)這個(gè)技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)和發(fā)展［16］。該擴(kuò)增方法以隨機(jī)突變后的目標(biāo)基因作為雙鏈互補(bǔ)的引物對(duì)(即特大引物，Megaprimers)，以含有原始基因的表達(dá)質(zhì)粒為模板(將此模板質(zhì)粒甲基化)，采用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出質(zhì)粒的全長(zhǎng)片段；再用DpnI酶處理，將甲基化了的模板質(zhì)粒降解，而新擴(kuò)增出的質(zhì)粒因?yàn)闆]有被甲基化，所以被完整保留。由于沒有DNA連接酶存在，利用引物和質(zhì)粒模板單向延伸產(chǎn)生的線性DNA新鏈不能作為模板進(jìn)行下一輪的擴(kuò)增，Mega-WH0P法不能實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增；此外，這種方法在轉(zhuǎn)化突變產(chǎn)物前還需要使用類似于DpnI這樣的酶來進(jìn)行一個(gè)模板消化的過程，步驟繁瑣。為解決以上問題，本文介紹一種新型的通過原位易錯(cuò)PCR構(gòu)建隨機(jī)突變文庫(kù)的方法，為廣大科技工作者提供一個(gè)更為方便快捷的構(gòu)建隨機(jī)突變文庫(kù)的方式。1原位易錯(cuò)PCR(Insituerror-pronePCR)技術(shù)原位易錯(cuò)PCR技術(shù)是本實(shí)驗(yàn)室最近發(fā)表的一項(xiàng)國(guó)際專利中公布的一種最新方法(PCT專利公開號(hào)：US-2012-0004142-A1)[17]。該發(fā)明專利的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)包括：(1)用一種極耐熱性DNA連接酶，在傳統(tǒng)PCR循環(huán)中加入一個(gè)連接步驟，即“變性—退火—延伸—連接”的四步循環(huán)，從而實(shí)現(xiàn)環(huán)狀質(zhì)粒的PCR指數(shù)擴(kuò)增(PPCP)；⑵PPCP和易錯(cuò)PCR相結(jié)合，在表達(dá)載體中對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行原位易錯(cuò)PCR，產(chǎn)生帶有隨機(jī)突變基因的環(huán)狀質(zhì)粒文庫(kù)；(3)在原位易錯(cuò)PCR過程中更替篩選標(biāo)記，產(chǎn)物與模板在平板篩選中自行分離。通過原位易錯(cuò)PCR進(jìn)行基因定向進(jìn)化的基本步驟如圖1所示，將目標(biāo)基因克隆到表達(dá)載體中構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒；同時(shí)，從序列互補(bǔ)但是帶有不同抗藥基因的載體質(zhì)粒中擴(kuò)增出線性載體DNA；再以表達(dá)質(zhì)粒為模板，線性載體DNA作引物，利用TaqDNA聚合酶在易錯(cuò)條件下對(duì)表達(dá)質(zhì)粒中的目標(biāo)基因進(jìn)行延伸；再通過極耐熱性連接酶的連接作用，擴(kuò)增出帶有突變基因的可直接用于轉(zhuǎn)化的環(huán)狀質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)通過易錯(cuò)PCR一步構(gòu)建基因突變文庫(kù)。這種方法省略了限制性酶切、酶連等繁瑣且低效的操作，可以用PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化。另外，由于引物片段中的抗性基因與PCR反應(yīng)中加入的模板質(zhì)粒所帶的抗性基因不同，無需對(duì)模板質(zhì)粒進(jìn)行降解，可直接將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后通過不同的篩選標(biāo)記選擇性地培養(yǎng)含突變基因的轉(zhuǎn)化子，將基因突變產(chǎn)物與原始模板分離，完全排除模板質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。2原位易錯(cuò)PCR技術(shù)的特點(diǎn)2.1原位易錯(cuò)PCR與MegaWHOP的不同之處原位易錯(cuò)PCR和MegaWHOP兩種方法雖然都要用到易錯(cuò)PCR技術(shù)，但是它們?cè)诒举|(zhì)上有所區(qū)別(表1)。雖然MegaWHOP的試劑盒已經(jīng)在美國(guó)市場(chǎng)上銷售，其方法并不符合PCR的基本原理；由于非指數(shù)擴(kuò)增，并且主要產(chǎn)物不是雙鏈環(huán)狀的DNA，MegaWHOP的效率勢(shì)必走低。原位易錯(cuò)PCR因基因在表達(dá)載體中的原位被誘導(dǎo)隨機(jī)突變而得名，所用的引物是通過高保真性擴(kuò)增的同源載體的線性雙鏈DNA;相對(duì)于MegaWHOP的特大引物(Megaprimer)而言，原位易錯(cuò)PCR所用的引物可謂“超(級(jí))大引物”，在國(guó)際專利中被稱為載體引物(Vector-primer)。“超大引物”與“特大引物”之間的另一個(gè)區(qū)別在于超大引物具有通用性。Mega-WHOP中所用的特大引物必須針對(duì)目標(biāo)基因及易錯(cuò)條件特別制備，適宜的片段大小為0.2-1.0kb;原位易錯(cuò)PCR中所用的“超大引物”是一個(gè)載體系列的公共序列，不論克隆到載體中的是哪一個(gè)基因，都可以用同一種引物進(jìn)行原位易錯(cuò)PCR。原位易錯(cuò)PCR引物的通用性和操作的簡(jiǎn)易性為我們帶來更大的便利是正突變的多輪疊加。如圖2所示，當(dāng)備有兩套帶有不同篩選標(biāo)記(如Ampr或Kanr)的超大引物時(shí)，可以輪番運(yùn)用這兩套引物，在篩選到正突變基因的基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行隨機(jī)誘變和篩選，獲得二級(jí)或多級(jí)累加的正突變。2.2原位易錯(cuò)PCR的技術(shù)要點(diǎn)環(huán)狀質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增(PPCP)技術(shù)中所使用的DNA連接酶需要有高度的熱穩(wěn)定性。經(jīng)過研究，來自極端嗜熱菌Thermotogamaritima(Tma)的DNA連接酶在95°C的半衰期超過30min，適合用于PCR過程［18］。TmaDNA連接酶只對(duì)粘性末端有連接作用，對(duì)平端則沒有連接作用，因此此酶在反應(yīng)中只將PCR產(chǎn)物連成環(huán)狀，不會(huì)對(duì)雙鏈的超大引物進(jìn)行相互連接或自身環(huán)化。TmaDNA連接酶連接過程中需要二價(jià)離子如Mg2+、Mn2+和Ca2+等的參與；其中添加Mn2+既可以增強(qiáng)連接作用，也是易錯(cuò)PCR常用的誘導(dǎo)堿基錯(cuò)配的條件。值得注意的是，此酶在反應(yīng)過程中需輔酶NAD+，因此，PPCP反應(yīng)體系中一定要添加NAD+。超大引物和普通PCR引物的要求一樣，要求3端的序列具有較強(qiáng)的特異性。因?yàn)槌洚?dāng)超大引物的雙鏈DNA片段變性解鏈后，正負(fù)鏈各自與互補(bǔ)的模板鏈退火成為引物，所以這段雙鏈DNA的兩端序列都應(yīng)當(dāng)具有特異性。設(shè)計(jì)超大引物時(shí)應(yīng)盡量避免在末端使用非編碼區(qū)的常見序列，如很多基因共有的類似啟動(dòng)子、終止子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至起始密碼子之間的引導(dǎo)序列等。超大引物可以通過PCR方法合成：以載體質(zhì)粒為模板，合成一對(duì)普通引物，用高保真性且產(chǎn)生平末端的DNA聚合酶，如Pfu和Pyrobest等來擴(kuò)增載體上的相應(yīng)區(qū)域，包括選擇標(biāo)記的編碼基因及兩側(cè)的其余序列。非常重要的是，PCR擴(kuò)增的超大引物的5’端必需經(jīng)過多聚核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化處理，才能在原位易錯(cuò)PCR中實(shí)現(xiàn)新鏈的首尾連接從而產(chǎn)生環(huán)狀DNA。原位易錯(cuò)PCR過程中，“變性—退火—延伸—連接”四步循環(huán)的溫度是個(gè)有趣的問題。由于使用的引物非常大：除了篩選標(biāo)記基因以外，篩選標(biāo)記的上游和下游各有幾百個(gè)與模板序列互補(bǔ)的堿基，其退火溫度可高于65°C；Taq酶的最適聚合溫度為72°C,但是在60°C也有較高的活性；TmaDNA連接酶的最適連接溫度是60°C,但是在70°C的活性高達(dá)最高活性的80%[18]。因此，原位易錯(cuò)PCR過程中除變性溫度為94°C以外，退火、延伸與連接的溫度非常接近，都可以在65-72°C之間選擇，甚至可以合并為一步任其連續(xù)進(jìn)行。有效的平板篩選技術(shù)或高通量篩選方法是利用原位易錯(cuò)PCR技術(shù)進(jìn)行基因定向進(jìn)化的必要條件。對(duì)于許多酶基因?qū)嵤┒ㄏ蜻M(jìn)化，平板篩選技術(shù)的缺乏是主要瓶頸問題，但是這個(gè)問題不在本文討論之列。3原位易錯(cuò)PCR應(yīng)用實(shí)例在中國(guó)發(fā)明專利(ZL200910025925.0)文獻(xiàn)中介紹的實(shí)例包括一個(gè)木聚糖酶和一個(gè)纖維素酶基因的定向進(jìn)化過程和試驗(yàn)條件［19］。實(shí)例中采用pHsh系列載體構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，其優(yōu)點(diǎn)包括：(1)載體質(zhì)粒小，轉(zhuǎn)化率高；(2)載體系列中有不同篩選標(biāo)記供選擇；(3)該系統(tǒng)質(zhì)粒為溫控型，可以通過在不同溫度下培養(yǎng)來控制表達(dá)水平［20］。試驗(yàn)流程如圖1所示，實(shí)驗(yàn)者首先將嗜熱疏棉狀絲孢菌的木聚糖酶基因xynA和海棲熱袍菌纖維素酶基因celB分別克隆到帶有抗藥基因Ampr的載體pHsh-amp(Gen-BankaccessionNo.FJ571619)中構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pHsh-xynA［21］和pHsh-celB；再用一對(duì)小引物擴(kuò)增同一系列的帶有抗藥基因Kanr的載體pHsh-kan(GenBankaccessionNo.FJ571619)，產(chǎn)生的線性dsDNA經(jīng)過磷酸化即可用作超大引物。原位易錯(cuò)PCR在20pL反應(yīng)體系中進(jìn)行，含有pHsh-xynA或pHsh-celB模板DNA30ng帶有Kanr的超大引物DNA200ng,TaqDNA聚合酶0.5U,極耐熱性TmaDNA連接酶0.1pg,以及0.2mmol/LdNTPs,2.0mmol/LMgCl2,0.5mmol/LMnCl2,0.5mmol/LNAD+和PCR緩沖液。這次試驗(yàn)中采用的PCR循環(huán)程序?yàn)椋?5°C5min;94°C1min,72°C1.5min,60°C2min,共15個(gè)循環(huán)；60°C10min。瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果表明，加入TaqDNA聚合酶和TmaDNAligase的PCR反應(yīng)中,環(huán)狀質(zhì)粒條帶中DNA量有明顯的提高［19］。PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞（PromegaCorp，Madison，WI，USA），將pHsh-xynA的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物涂布在含有2%木聚糖和卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板上，將pHsh-celB的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物涂布在含有2%CMC和卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板上，分別放置在30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10h后轉(zhuǎn)到42°C恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)5-6h［20］（圖3），菌落周圍的透明圈或凹陷圈的大小表明基因突變導(dǎo)致酶活性發(fā)生很大的變化。4總結(jié)自1993年第一次成功運(yùn)用易錯(cuò)PCR以來［22］，在短短的十幾年中，各種進(jìn)化方法層出不窮。文中介紹的原位易錯(cuò)PCR方法適用于任何可用于克隆的表達(dá)載體，最好使用能夠在大腸桿菌中表達(dá)的載體。已知的適用于此方法的選擇標(biāo)記也有很多，比如文中所使用的抗性基因。同樣，需要突變的目的基因也可以是任何編碼序列。可以是一個(gè)蛋白的全長(zhǎng)編碼序列，也可以是一段RNA序列或一段調(diào)控序列等。此方法中連接反應(yīng)和PCR反應(yīng)同步進(jìn)行，建議參考文中提供的反應(yīng)溫度設(shè)定熱循環(huán)程序。MnCl2濃度與易錯(cuò)PCR的突變頻率相關(guān)，推薦濃度范圍為0.05-0.50mmol/L，建議對(duì)小于1kb的目標(biāo)基因采用較高M(jìn)n2+濃度，對(duì)大于1kb的基因適當(dāng)降低其濃度。極耐熱性TmaDNA連接酶和NAD+按照文中實(shí)例用量使用，其他酶和試劑濃度按常規(guī)PCR條件使用。此方法的反應(yīng)條件需要根據(jù)具體情況，比如突變基因的大小、類型或研究者需要的突變率進(jìn)行微調(diào)，并沒有具體的、通用的標(biāo)準(zhǔn)，這可能需要使用者根據(jù)實(shí)際情況對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。突變子的篩選方法也因目標(biāo)基因性質(zhì)而異，與本技術(shù)沒有直接關(guān)系。參考文獻(xiàn)：ChirumamillaRR,MuralidharR,MarchantR,etal.Improvingthequalityofindustriallyimportantenzymesbydirectedevolution[J].MolecularandCellularBiochemistry,2001,224(1/2)：159-168.CherryJR,FidantsefAL.Directedevolutionofindustrialenzymes：anupdate[J].CurrentOpinioninBiotechnology,2003,14(4)：438-443.EijsinkVG,GaseidnesS,BorchertTV,etal.Directedevolutionofenzymestability[J].BiomolecularEngineering,2005,22(1/3)：21-30.YuanL,KurekI,EnglishJ,etal.Laboratory-directedproteinevolution[J].MicrobiologyandMolecularBiologyReviews,2005,69(3)：373-392.BhatMK.Cellulasesandrelatedenzymesinbiotechnology[J].BiotechnologyAdvances,2000,18(5)：355-383.OttenLG,QuaxWJ.Directedevolution：selectingtoday'sbiocatalysts[J].BiomolecularEngineering,2005,22(1/3)：1-9.[7]CadwellRC,JoyceGF.RandomizationofgenesbyPCRmutagenesis[J].PCRMethodsandApplications,1992,2(1)：28-33.KammannM,LaufsJ,SchellJ,etal.RapidinsertionalmutagenesisofDNAbypolymerasechainreaction(PCR)[J].NucleicAcidsResearch,1989,17(13)：5404.MiyazakiK,TakenouchiM.CreatingrandommutagenesislibrariesusingmegaprimerPCRofwholeplasmid[J].Biotechniques,2002,33(5)：1033-1038.NakaniwaT,TadaT,TakaoM,etal.Aninvitroevaluationofathermostablepectatelyasebyusingerror-pronePCR[J].JournalofMolecularCatalysisB-enzymatic,2004,27(2/3)：127-131.ZhangJH,DawesG,StemmerWP.DirectedevolutionofafucosidasefromagalactosidasebyDNAshufflingandscreening[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1997,94(9)：4504-4509.KimMS,LeiXG.EnhancingthermostabilityofEscherichiacoliphytaseAppA2byerror-pronePCR[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2008,79(1)：69-75.HuG.DNApolymerase-catalyzedadditionofnontemplatedextranucleotidestothe3'endofaDNAfragment[J].DNAandCellBiology,1993,12(8)：763-770.[14]ShenB.PCRapproachestoDNAmutagenesisandrecombination：anoverview[J].MethodsinMolecularBiology,2002,192：167-174.MiyazakiK,TakenouchiM.CreatingrandommutagenesislibrariesusingmegaprimerPCRofwholeplasmid[J].Biotechniques,2002,33(5)：1033-1038.WeiD,LiM,ZhangX,etal.Animprovementofthesite-directedmutagenesismethodbycombinationofmegaprimer,one-sidePCRandDpnItreatment[J].AnalyticalBiochemistry,2004,331(2)：401-403.

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