論文資料Caco-2細胞模型及其應用的研究進展

Caco-2細胞模型及其應用的研究進展王敏，齊云基金工程基金工程：國家自然科學基金資助工程〔No.30672659〕作者簡介：王敏，女，碩士研究生*通訊作者〔中國協(xié)和醫(yī)科大學-中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所，北京100094〕摘要:目的介紹近幾年來Caco-2細胞模型在藥學方面應用的最新進展。方法依據(jù)近年來國內(nèi)外相關(guān)文獻資料，對有關(guān)Caco-2細胞模型自身及應用的開展進行了綜述。結(jié)果與結(jié)論Caco-2細胞模型本身的改進與優(yōu)化及該模型應用于改善口服藥物吸收、藥食相互作用等方面的研究取得了可喜的進展，而將Caco-2細胞模型應用于中藥吸收特點研究的動向值得關(guān)注。關(guān)鍵詞：Caco-2細胞模型；藥物吸收；藥食相互作用；中藥Caco-2細胞(thehumancolonadenocarcinomacelllines)模型作為藥物吸收研究的快速篩選工具，可在細胞水平上提供藥物分子透過小腸黏膜的吸收、分布、代謝、轉(zhuǎn)運以及毒性的綜合信息。由于Caco-2細胞與體內(nèi)藥物，特別是那些被動吸收的藥物具有良好相關(guān)性，已被廣泛用于藥物早期快速篩選過程中，并已成為研究藥物吸收機制，預測體內(nèi)吸收和藥物相互作用等的重要工具。近年來研究者們對模型不斷進行改進，在應用上也有諸多開展，本文將就近年這些研究動態(tài)進行綜述。1對Caco-2細胞模型的優(yōu)化研究盡管Caco-2細胞模型具有諸多優(yōu)點，但仍然存在某些缺陷，如形成完全分化并具有緊密連接的單層細胞生物膜所需培養(yǎng)時間較長〔21～28天〕；缺乏分泌黏液的功能，不似小腸上皮能夠形成黏液層；缺少或低表達某些藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體等。研究者們因此就這些缺陷對模型本身進行了一些改進。ChongS等[1]選用Biocoat腸上皮細胞分化環(huán)境〔BIEDE〕來培養(yǎng)Caco-2細胞，優(yōu)化了細胞培養(yǎng)條件，僅用3天即培養(yǎng)出完全分化的單層細胞膜，縮短了細胞培養(yǎng)時間。該模型采用polyethylenet-erealate代替非聚碳酸酯作為細胞生長支持物〔濾膜材料〕；用纖維膠原Ⅰ型代替鼠尾膠原Ⅰ型作為促進細胞黏附的細胞外蛋白基質(zhì)〔濾膜涂層〕；用丁酸代替含10％胎牛血清的DMEM作為培養(yǎng)基。小腸的吸收作用與粘液層的存在密切相關(guān)。小腸上皮粘液層的形成，取決于HT29細胞〔杯狀細胞〕分泌粘液的能力，與其相比，Caco-2細胞為單一細胞，缺乏分泌粘液的能力，從而無法形成與小腸上皮相似的粘液層，此外，由于HT29細胞的缺失，使得Caco-2細胞的旁路滲透能力也低于體內(nèi)狀態(tài)，為使Caco-2細胞模型具有與小腸上皮相似的粘液層，并獲得與體內(nèi)相似的細胞旁路滲透能力，Constanze等[2]將Caco-2細胞與HT29－MTX按不同比例共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TEER值〔跨膜電阻值〕較單用Caco-2細胞有所降低，而且水溶性小分子物質(zhì)經(jīng)共培養(yǎng)細胞模型的滲透能力高于單純的Caco-2細胞模型，有利于水溶性小分子物質(zhì)細胞轉(zhuǎn)運過程的研究。由于Caco-2細胞缺少某些首過代謝酶，而這些酶是影響藥物口服吸收和生物利用度的關(guān)鍵酶，Charles等[3]利用重組技術(shù)在Caco-2細胞中引入CYPcDNAs，從而提高了CYP3A4和CYP2A6的表達，開拓了Caco-2模型在研究藥物首過代謝方面的應用，提高了其體內(nèi)相關(guān)性。由于Caco-2細胞缺少或低表達小腸上皮細胞內(nèi)的某些藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體，因此，有人采用經(jīng)典的細胞生物學方法誘導藥物代謝酶的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在各種酶誘導劑如苯巴比妥、地塞咪松、β-萘黃酮存在下培養(yǎng)Caco-2細胞的亞克隆細胞，可誘導表達不同的酶系統(tǒng)[4]。如Caco-2細胞的亞克隆TC7細胞經(jīng)誘導后可增加CYP3A的表達，且高表達與刷狀緣相關(guān)的水解酶、蔗糖－麥芽糖異構(gòu)酶，以及?；悄懰徂D(zhuǎn)運系統(tǒng)；經(jīng)β-萘黃酮誘導可表達CYP1A1基因亞家族，以及高活性的UPD－葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶。這些性質(zhì)使TC7細胞成為有價值的體外腸道研究模型。另外，有研究發(fā)現(xiàn)Caco-2細胞在多孔膜上與100nM1α,25-二羥維生素D3共培養(yǎng)2周后可誘導Caco-2細胞內(nèi)CYP3A4mRNA的表達，與重組技術(shù)一樣也能形成一個用以研究藥物小腸吸收首過效應的細胞模型[5]。2Caco-2細胞模型在改善口服藥物吸收研究中的應用2.1各種藥物吸收促進劑的開發(fā)研究2.1.1親水性藥物及多肽類藥物往往表現(xiàn)出低的口服生物利用度，一個重要原因就是腸上皮細胞的緊密連接使得這些藥物經(jīng)細胞旁路的被動擴散受到限制。最近幾年，研究者們致力于開發(fā)能夠調(diào)節(jié)腸上皮細胞緊密連接〔但不破壞細胞單層完整性〕從而增加腸通透性的吸收促進劑〔如中鏈脂肪酸、殼聚糖及其衍生物〕[6]。有研究顯示，羥丙基－β環(huán)糊精和β－環(huán)糊精較殼聚糖更能提高優(yōu)降糖的溶出度，在Caco-2細胞通透性實驗中，將兩種環(huán)糊精和殼聚糖合用時，出現(xiàn)協(xié)同效應，較單用殼聚糖更能增加優(yōu)降糖的腸上皮通透性[7]。由于殼聚糖只在酸性環(huán)境中可溶，而腸腔為中性至堿性，研究者對殼聚糖的結(jié)構(gòu)進行了修飾，將殼聚糖局部季銨化，制成N－三甲基殼聚糖氯化物〔TMC〕，該物質(zhì)在中性環(huán)境下可溶，且仍然具有殼聚糖的黏膜黏附性質(zhì)〔由于殼聚糖分子中的氨基、羥基可與黏膜中的糖蛋白形成氫鍵而產(chǎn)生黏附作用〕，能夠刺激細胞支架的絲狀肌動蛋白重新排列，從而翻開腸上皮細胞的緊密連接，促進親水性藥物和肽類藥物經(jīng)細胞旁路的被動吸收[8]。VenturaCA等[9]采用雙氧甲基β－環(huán)糊精包合塞來考昔〔一種COX-2抑制劑〕，它們以范德華力互相結(jié)合，包合后的塞來考昔較單體具有更高的水溶性和溶出度，且環(huán)糊精能夠使腸上皮黏膜失去穩(wěn)定性，從而使塞來考昔經(jīng)腸上皮的通透性增高。2.1.2口服蛋白質(zhì)類藥物〔如胰島素〕在經(jīng)過小腸上皮時往往被上皮細胞的代謝酶水解，從而導致其生物利用度降低，失去療效，為此，研究者們開始研究一些分子載體來保護并運載藥物通過小腸上皮，以確保藥物以完整形式發(fā)揮其原有療效。此外，為提高一些水難溶性藥物的口服吸收能力，尋找與之相吻合的分子載體研究已在進行之中。2.1.22.1.2.1.1以最近開展了一種稱為eligen的技術(shù)[10]，該技術(shù)使用一些低分子量化合物作為胰島素轉(zhuǎn)運載體，它們能夠與肽類藥物以非共價鍵微弱地結(jié)合，從而增加藥物親脂性，使其更易通過小腸上皮。這種作用并不破壞腸上皮細胞的緊密連接，同時還可保護胰島素不被蛋白酶水解。LiangJF等[11]將胰島素與一種能夠跨細胞的肽〔CPP〕形成雜合體，該雜合體采用一種類似主動轉(zhuǎn)運的機制經(jīng)腸上皮吸收，其吸收效率較單用胰島素提高6～8倍，且能夠保護胰島素不被蛋白酶降解。MaoS等[12]將胰島素與PEG－三甲基殼聚糖通過殼聚糖多聚物的自組裝作用制成一種小分子量超微共聚體〔每個直徑200～400nm，帶正電荷，胰島素荷載率可達90％〕，通過Caco-2細胞對其的胞吞作用促進胰島素的攝取。LimCJ等[13]將胰島素連接到轉(zhuǎn)鐵蛋白〔Tf〕低聚體和轉(zhuǎn)鐵蛋白單體上，形成的雜合體分別為Agg-Tf-S-S-In、Mono-Tf-S-S-In,前者由于能夠使轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR發(fā)生交聯(lián)作用，從而較后者更能促進Tf-TfR復合物向Caco-2細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，并能使細胞內(nèi)的胰島素蓄積量升高，促進胰島素的吸收，更好地發(fā)揮降血糖的作用；而且轉(zhuǎn)鐵蛋白低聚體與胰島素的雜合體能夠緩慢持續(xù)地釋放胰島素，提示它作為蛋白和肽類藥物緩釋載體的可能性。2.1.2.1.2脂質(zhì)體作為一種有效的分子載體，廣泛應用于肽類藥物的保護及運載。王琰等[14]研究了脂質(zhì)體包裹胰島素、殼聚糖包覆脂質(zhì)體胰島素對胰島素透過Caco-2細胞的促進作用，結(jié)果顯示，脂質(zhì)體,特別是殼聚糖均可以增加胰島素的通透量。脂質(zhì)體可通過破壞脂質(zhì)雙分子層的有序排列,使其紊亂而增加所負載物質(zhì)的穿透生物屏障的能力,進而改變其通透性，而脂質(zhì)體微囊的內(nèi)水相還能保護胰島素的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象；由于殼聚糖帶有正電荷,而細胞帶有負電荷,殼聚糖包覆脂質(zhì)體后可能促進藥物的定向移動,使Caco-2細胞外表的藥物濃度局部增加,從而促進藥物向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，到達促進吸收作用。在采用Caco-2細胞模型研究人表皮生長因子〔rhEGF—肽類藥物〕治療胃潰瘍的實驗中，LiH等[15]發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體包裹后的人表皮生長因子〔rhEGF—肽類藥物〕向BL側(cè)(基底側(cè))轉(zhuǎn)運的速率較單用rhEGF時轉(zhuǎn)運速率低，但由于脂質(zhì)體的保護作用，使得rhEGF不被酶水解，從而脂質(zhì)體包裹后的藥物治療胃潰瘍會顯示出更好效果。SongKH等[16]研究發(fā)現(xiàn)，鮭降鈣素與外表活性劑〔如?；敲撗跄懰徕c—NaTDC〕合成的脂質(zhì)體前體藥物，能夠使Caco-2細胞單層流態(tài)化，同時TDC與鮭降鈣素形成親脂的離子對，也能加速鮭降鈣素向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運，從而提高生物利用度。2.1.2.2水難溶性藥物的弱溶解性，限制了其在體內(nèi)的吸收。為此，研究者們開始尋找針對水難溶性藥物的分子載體。FrancisMF等[17]將VitB12殘基通過2,2-乙二氧基雙乙胺基團連接到葡聚糖-g-聚氧乙烯十六烷基醚〔DEX-g-PEO-C16〕多聚微粒體上，該微粒體能將CsA〔一種水難溶性的免疫抑制劑〕包合入其疏水核中〔包合率達8.5%w/w〕，從而到達增大水溶性的作用。Caco-2細胞轉(zhuǎn)運實驗結(jié)果也說明，經(jīng)VitB12修飾的CsA包合物的PappAP-BL(細胞單層頂端至基底端的表觀通透系數(shù))值顯著高于未修飾的CsA包合物。PrabhuS等[18]研究發(fā)現(xiàn)，水溶性較小的非甾體抗炎藥吡羅昔康〔PXCM〕與磷脂載體DMPC〔二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿〕制成的固態(tài)分散體，能夠顯著提高PXCM的溶解度與溶出速率；在該固體分散體中再參加一定量的PEG4600，可使PXCM的釋放更加快速。而且，兩種處理方式皆可促進PXCM在Caco-2細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運。2.2為改善藥物吸收對其進行化學結(jié)構(gòu)的修飾為增加藥物的親脂性從而提高在小腸上皮的吸收，適當?shù)幕瘜W結(jié)構(gòu)修飾是必要的，制成酯質(zhì)前體藥物是目前采用最為廣泛的方法，該前體藥物進入小腸上皮后可在代謝酶作用下復原成原藥，從而發(fā)揮藥效。LandowskiCP等[19]將5-氟-2’-脫氧尿嘧啶核苷分別制成兩種氨基酸單酯，即5’-L-異亮氨酸單酯和5’-L-纈氨酸單酯。研究顯示，異亮氨酸單酯表現(xiàn)出更好的化學穩(wěn)定性和酶穩(wěn)定性—能夠保護5-氟-2’-脫氧尿嘧啶核苷的糖苷鍵不被胸腺嘧啶脫氧核苷磷酸酶水解；同時，與原藥相比，經(jīng)修飾后的酯類前藥經(jīng)PEPT1載體在Caco-2細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運也顯著提高，從而提高了原藥的口服吸收和治療指數(shù)。2-溴-5,6-二氯-1-(β-D-呋核亞硝脲)苯并咪唑〔BDCRB〕是有效的人巨細胞病毒選擇性抑制劑，但由于其在體內(nèi)很快被代謝，所以缺乏臨床應用價值。有研究發(fā)現(xiàn)[20]，將BDCRB制成氨基酸酯類前藥如1-天冬氨酸-BDCRB，能夠防止BDCRB被其代謝酶水解，從而提高其經(jīng)Caco-2細胞的吸收轉(zhuǎn)運。此外，氨基酸與BDCRB形成的酯鍵水解過程為一限速步驟，可使BDCRB緩慢持久地釋放，從而提高其在體內(nèi)的分布。3Caco-2細胞模型在藥食相互作用研究中的作用近年，越來越多的研究者采用Caco-2細胞模型研究藥物間相互作用，而對藥食相互作用研究甚少?，F(xiàn)今，有研究者也開始將注意力轉(zhuǎn)移到日常飲食對藥物口服吸收的影響上。飲茶人群的日益增加，使得茶葉漸漸成為藥食相互作用中備受關(guān)注的物質(zhì)。MonteiroR等[21]初步研究了綠茶和紅茶對有機陽離子—3H-MPP+〔由于藥物中主要成分往往以有機陽離子的形式存在〕經(jīng)Caco-2細胞轉(zhuǎn)運的影響，發(fā)現(xiàn)綠茶和紅茶均能增加3H-MPP+在Caco-2細胞內(nèi)的吸收。飲食中的多酚類物質(zhì)無處不在，它們被認為有利于人體健康，SaitoY等[22]研究了飲食中的幾個多酚類成分阿魏酸、咖啡酸、對羥基肉桂酸對抗糖尿病藥—那格列奈經(jīng)小腸吸收的影響，發(fā)現(xiàn)它們以不同的方式影響那格列奈/H+轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，從而抑制那格列奈的小腸吸收。另外有研究[23]發(fā)現(xiàn)，食物中的多酚類在Caco-2細胞中可以代謝為MRP-2的底物，能夠與OTA〔赫曲毒素A—一種經(jīng)食物傳播的真菌毒素〕競爭MRP-2，從而抑制了MRP-2對OTA的外排解毒作用，不利于人體健康。飲食中常見的黃酮類成分能夠影響小腸的分泌外排作用，OferM等[24]研究了六種黃酮類物質(zhì)〔橙皮素、槲皮素、山柰酚、繡線菊苷、異槲皮苷、柚皮素〕對P-gp底物他林洛爾經(jīng)Caco-2細胞的分泌外排作用的影響，發(fā)現(xiàn)這六種黃酮類均能抑制P-gp對他林洛爾的外排作用，但并不是與他林洛爾競爭P-gp的結(jié)合位點。4Caco-2細胞模型在中藥研究中的應用Caco-2細胞模型在中藥吸收研究中的應用更是近年才見報道。由于大局部中藥成分的吸收過程和機制還未明確，因此Caco-2細胞模型在中藥口服吸收研究方面具有廣泛應用前景。NishimuraN[25]發(fā)現(xiàn)小柴胡湯與降血糖藥甲苯磺丁脲合用，在給藥后的早期階段可以提高甲苯磺丁脲經(jīng)小腸上皮黏膜的通透性〔使用Caco-2細胞模型〕，增強其降血糖的作用。其后小柴胡湯將促進甲苯磺丁脲在Caco-2細胞內(nèi)的主動轉(zhuǎn)運，抑制其經(jīng)細胞旁路的被動擴散，同時,隨著小柴胡湯劑量增大，甲苯磺丁脲的吸收速率也隨之提高。WangY等[26]研究了銀杏葉提取物中的黃酮類化合物—槲皮素、山柰酚、異鼠李素在Caco-2細胞模型上的轉(zhuǎn)運機制，測得Papp,B-A值〔細胞單層基底端至頂端的表觀通透系數(shù)〕高于Papp,A-B值〔P<0.01〕，當P-gp抑制劑維拉帕米存在時，槲皮素、山柰酚、異鼠李素在細胞內(nèi)的濃度增高，推測槲皮素、山柰酚、異鼠李素均為P-gp的底物，P-gp的外排作用將降低槲皮素、山柰酚、異鼠李素在體內(nèi)的生物利用度。謝海棠等[27]運用Caco-2細胞模型,觀察了人參皂苷Rg3的攝取及代謝情況，發(fā)現(xiàn)Caco-2細胞對人參皂苷Rg3的攝取呈現(xiàn)時間及劑量依賴性,而且,代謝抑制劑疊氮鈉及2,4－二硝基酚的參加使得攝取速率明顯降低(與對照組相比P<0.01)，而人參皂苷Rg3在腸道中的代謝可能是其生物利用度低的原因之一。關(guān)溯等[28]研究了隱丹參酮在Caco-2細胞模型中的吸收機制，發(fā)現(xiàn)隱丹參酮從單層細胞層頂端到基底端的轉(zhuǎn)運速率〔Papp,A-B值〕大于基底端到頂端的轉(zhuǎn)運速率〔Papp,B-A值〕,隨著時間和藥物濃度的增加,藥物吸收呈飽和趨勢,且可被其結(jié)構(gòu)類似物丹參酮競爭性抑制，提示隱丹參酮在Caco-2細胞模型中的吸收主要是由載體介導的主動轉(zhuǎn)運,且該主動轉(zhuǎn)運的載體位于Caco-2細胞單層的頂端。5結(jié)語Caco-2細胞模型自80年代起就被廣泛應用于藥物的吸收、代謝、毒性方面的研究。早期研究者們常用此模型研究口服藥物在小腸的吸收轉(zhuǎn)運機制、預測被動擴散藥物在體內(nèi)的吸收、評價吸收過程中的藥物相互作用及藥物的高通量篩選等方面，對藥物的Ⅰ相、Ⅱ相代謝及藥物毒性的研究也有涉及。近年來，該模型在研究如何促進低口服生物利用度藥物在小腸的吸收及藥食相互作用等方面得到越來越廣泛的應用。另外，將Caco-2細胞模型用于中藥復方及有效成分口服吸收的研究趨勢也值得關(guān)注。REFERENCES[1]CHONGS,SANDRAAD,RICHARDAM.Evaluationofbiocoatintestinalepitheliumdifferentiationenvironment(3-Dayculturedcaco-2Cells)asanabsorptionscreeningmodelwithimprovedproductivity[J].PharmRes,1997,14:1835-1837.[2]CONSTANZEH,PETERL.Caco-2versusCaco-2/HT29-MTXCo-culturedCellLines:PermeabilitiesViaDiffusion,Inside-andOutside-Directedcarrier-mediatedTransport[J].JPharmSci,2000,89:63-75.[3]CHARLESLC,BRUCEWP,HUM.DevelopmentofCaco-2cellsexpressinghighlevelsofcDNA-derivedcytochromeP4503A4[J].PharmRes,1996,13:1635-1641.[4]WANGCH,QIUZY.DevelopmentofResearchesinCaco-2CellMode[J].JBiomedEng(生物醫(yī)學工程學雜志),2005,22(3):633-636.[5]AIBAT,SUSAM,FUKUMORIS,etal.TheeffectsofcultureconditionsonCYP3A4andMDR1mRNAinductionby1alpha,25-dihydroxyvitaminD(3)inhumanintestinalcelllines,Caco-2andLS180[J].DrugMetabPharmacokinet,2005,20(4):268-74.[6]CANO-CEBRIANMJ,ZORNOZAT,GRANEROL,etal.Intestinalabsorptionenhancementviatheparacellularroutebyfattyacids,Chitosansandothers:atargetfordrugdelivery[J].CurrDrugDeliv,2005,2(1):9-22.[7]ZERROUKN,CORTIG,ANCILLOTIS,etal.Influenceofcyclodextrinsandchitosan,separatelyorincombination,onGlyburidesolubilityandpermeability[J].EurJPharmBiopharm,2006,62(3):241-246.[8]VANDERMERWESM,VERHOEFJC,VERHEIJDENJH,etal.Trimethylatedchitosanaspolymericabsorptionenhancerforimprovedperoraldeliveryofpeptidedrugs[J].EurJPharmBiopharm.2004,58(2):225-35.[9]VENTURACA,GIANNONEI,PAOLINOD,etal.Preparationofcelecoxib-dimethyl-beta-cyclodextrininclusioncomplex:characterizationandinvitropermeationstudy[J].EurJMedChem,2005,40(7):624-31.[10]MALKOVD,ANGELOR,WANGHZ,etal.Oraldeliveryofinsulinwiththeeligentechnology:mechanisticstudies[J].CurrDrugDeliv,2005,2(2):191-7.[11]LIANGJF,YANGVC.Insulin-cellpenetrateingpeptidehybridswithimprovedintestinalabsorptionefficiency[J].BiochemBiophysResCommun,2005,335(3):734-8.[12]MAOS,GERNERSHAUSO,FISCHERD,etal.UptakeandTransportofPEG-Graft-Trimethyl-ChitosanCopolymer-InsulinNanocomplexesbyEpithelialCells[J].PharmRes,2005,22(12):2058-68.[13]LIMCJ,SHENWC,etal.Comparisonofmonomericandoligomerictransferringaspotentialcarrierinoraldeliveryofproteindrugs[J].JControlRelease,2005,106(3):273-86.[14]WANGY,LIZR,PANFY,etal.AstudyontranscellulartransportationofinsulinliposomesusingCaco-2cellmode[J].ChinesePharmacologicalBulletin(中國藥理學通報),2005,21(1):78~81.[15]LIH,ANJH,PARKJS,etal.Multivesicularliposomesfororaldeliveryofrecombinanthumanepidermalgrowthfactor[J].ArchPharmRes,2005,28(8):988-94.[16]SONGKH,CHUNGSJ,SHIMCK.Enhancedintestinalabsorptionofsalmoncalcitoninfromproliposomescontainingbilesalts[J].JControlRelease,2005,106(3):298-308.[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