常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用

生物化學(xué)與分子生物學(xué)編輯ppt常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第二十章編輯ppt第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)MolecularHybridizationandBlottingTechnique編輯ppt核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過(guò)程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理編輯ppt復(fù)性RNADNA編輯ppt〔一〕印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting〞，譯為印跡技術(shù)。編輯ppt用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針〞，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在?！捕程结樇夹g(shù)編輯ppt二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用〔一〕DNA印跡(Southernblotting)〔二〕RNA印跡(Northernblotting)〔三〕蛋白質(zhì)的印跡(Westernblotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。編輯ppt其他：斑點(diǎn)印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點(diǎn)陣(DNAarray)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)編輯ppt三種印跡技術(shù)的比較編輯ppt分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③編輯ppt放射自顯影照片編輯pptDNA芯片技術(shù)編輯ppt第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用ThePrincipleandApplicationof

PCRTechnology編輯ppt5

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TemplateDNA一、PCR技術(shù)的工作原理5

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25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。編輯pptPCR技術(shù)原理示意圖編輯pptPCR的根本反響步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C編輯ppt模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+PCR體系根本組成成分編輯ppt利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得目的基因片段,或與逆轉(zhuǎn)錄反響相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段；利用簡(jiǎn)并引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得序列相似的基因片段；利用隨機(jī)引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中克隆基因。二、PCR技術(shù)的主要用途〔一〕目的基因的克隆編輯ppt利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。PCR技術(shù)高度敏感，對(duì)模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。〔三〕DNA和RNA的微量分析〔二〕基因突變編輯ppt將PCR技術(shù)引入DNA序列測(cè)定，使測(cè)序工作大為簡(jiǎn)化，也提高了測(cè)序的速度；待測(cè)DNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測(cè)定，也可直接測(cè)定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性?！菜摹矰NA序列測(cè)定〔五〕基因突變分析編輯ppt逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反響和PCR反響聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對(duì)序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法?！惨弧衬孓D(zhuǎn)錄PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)編輯ppt原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反響，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測(cè)DNA或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。原位PCR方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的缺乏，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最正確方法?！捕吃籔CR技術(shù)編輯ppt〔三〕實(shí)時(shí)PCR技術(shù)實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)技術(shù)通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反響過(guò)程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。編輯ppt實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標(biāo)記引物RQ3'3'5'5'編輯ppt實(shí)時(shí)PCR分類：實(shí)時(shí)PRC非探針類探針類1.TaqMan探針?lè)?.分子信標(biāo)探針?lè)?.FRET探針?lè)ň庉媝pt圖20-3TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)PCR原理示意圖編輯ppt第三節(jié)基因文庫(kù)GeneLibrary編輯ppt基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)基因文庫(kù)(genelibrary)是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。編輯ppt一、基因組DNA文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)是指生物的基因組DNA的信息〔包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)〕以DNA片段形式貯存的克隆群體。用于構(gòu)建基因組文庫(kù)的載體有

噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。編輯ppt基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選編輯ppt第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫(kù)篩選結(jié)果舉例編輯pptcDNA文庫(kù)是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。二、cDNA文庫(kù)編輯ppt第四節(jié)生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnique編輯ppt是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測(cè)的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)的熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)編輯ppt基因芯片工作流程示意圖編輯ppt是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反響時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反響蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理編輯ppt第五節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy編輯ppt一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交各種親和分析〔標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等〕熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)編輯ppt標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法?！惨弧硺?biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。編輯ppt標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程示意圖編輯ppt〔二〕酵母雙雜交技術(shù)的根本原理和用途編輯ppt酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用證明兩種基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測(cè)。分析存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌〞表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的“獵物〞基因表達(dá)文庫(kù)，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。編輯ppt電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或稱凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)(gelshiftassay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)〔一〕電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定編輯ppt放射自顯影未