non-coding-RNA-現(xiàn)代分子生物學(xué)課程

NoncodingRNA海南大學(xué)園藝園林學(xué)院1精選課件1

12精選課件RNA的研究進(jìn)展RNA組學(xué)：通過對RNA的研究所取得的巨大成果而形成了RNA組。RNA研究已有百余年的歷史，其間有兩個(gè)階段時(shí)期。第一個(gè)階段：20世紀(jì)的50～60年代，各種RNA開始被發(fā)現(xiàn)，但對RNA的認(rèn)識還不深入。第二個(gè)階段：20世紀(jì)的80年代，RNA的功能逐漸被發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究表明RNA在遺傳方面的重要作用。3精選課件Non-codingRNA（非編碼RNA）非編碼RNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA。其中包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA和microRNA等多種已知功能的RNA，還包括未知功能的RNA。這些RNA的共同特點(diǎn)是都能從基因組上轉(zhuǎn)錄而來，但是不翻譯成蛋白，在RNA水平上就能行使各自的生物學(xué)功能了。4精選課件分類非編碼RNA從長度上來劃分可以分為3類：小于50nt，包括microRNA，siRNA，piRNA；50nt到500nt，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA等等；大于500nt，包括長的mRNA-like的非編碼RNA，長的不帶polyA尾巴的非編碼RNA等等。5精選課件根據(jù)亞細(xì)胞定位可將非編碼RNA分為：細(xì)胞核非編碼RNA與細(xì)胞質(zhì)非編碼RNA。根據(jù)是否具有polyA尾結(jié)構(gòu)可將非編碼RNA分為具有polyA尾的非編碼RNA(polyA-plusncRNAs)和不具有polyA尾的非編碼RNA(polyA-minusncRNAs。根據(jù)轉(zhuǎn)錄本的長度可將非編碼RNA分為小非編碼RNA和長鏈非編碼RNA。6精選課件分類根據(jù)生物學(xué)功能可將非編碼RNA分為：持家非編碼RNA和調(diào)控性非編碼RNA。持家非編碼RNA主要包括核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、引導(dǎo)RNA(gRNA)和端粒酶RNA;調(diào)控性非編碼RNA主要包括小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、與Piwi蛋白相互作用的piRNA和長鏈非編碼RNA(lncRNAs)。7精選課件分類調(diào)控非編碼RNA：長鏈非編碼RNA（lncRNA）短鏈非編碼RNA（siRNA、miRNA、piRNA）

非編碼RNA看家非編碼RNA8精選課件調(diào)控非編碼RNA長鏈非編碼RNA（lncRNA）長鏈非編碼RNA通常是指長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本。該概念是在2002年由日本科學(xué)家首次提出,他們在小鼠全長cDNA文庫的大規(guī)模測序中,鑒定了大量較長的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本。短鏈非編碼RNA（siRNA、miRNA、piRNA）它們的轉(zhuǎn)錄本序列都比較短，不超過40nt短鏈非編碼RNA分子雖小，卻參與了包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞代謝以及機(jī)體免疫在內(nèi)的幾乎所有生命活動的調(diào)節(jié)和控制，在生命體內(nèi)扮演著至關(guān)重要的角色。9精選課件長鏈非編碼RNA（lncRNA）lncRNA不參與或很少參與蛋白編碼功能,位于細(xì)胞核內(nèi)或胞漿內(nèi)。近年來的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、染色體修飾和基因組修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗^程，其調(diào)控作用正在被越來越多的人研究。10精選課件1.編碼蛋白的基因上游啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因的表達(dá)；2.抑制RNA聚合酶II或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因的表達(dá)；3.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，干擾mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，在Dicer酶的作用下產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA；5.與特定蛋白質(zhì)結(jié)合，lncRNA轉(zhuǎn)錄本可調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；6.作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；7.結(jié)合到特定蛋白質(zhì)上，改變該蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位；8.作為小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前體分子。11精選課件RNA

(small

noncoding

RNA)miRNA(microRNA)siRNA

(small

interfering

RNA)piRNA(piwi-interacting

RNA)esiRNA

(endogenous

siRNA)12精選課件siRNAsiRNA:是一類外源性的雙鏈小分子RNA，它的長度一般為21~25nt。它在RNA干擾途徑中通過引導(dǎo)目的基因mRNA的降解，以抑制mRNA的表達(dá)。siRNA也可經(jīng)由多種不同轉(zhuǎn)染（transfection）技術(shù)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并對特定基因產(chǎn)生具專一性的基因敲除（knockdown）效果，這使siRNA成為研究基因功能與藥物目標(biāo)的一項(xiàng)重要工具。也參與一些與RNAi相關(guān)的反應(yīng)途徑，例如抗病毒機(jī)制或是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。13精選課件miRNA概念：miRNA是長約21～25nt的單鏈RNA,其中50%定位于易發(fā)生結(jié)構(gòu)改變的染色體區(qū)域。特點(diǎn)：miRNA是內(nèi)源性的,是生物體基因的表達(dá)產(chǎn)物;miRNA是由不完整的發(fā)卡狀雙鏈RNA,經(jīng)Drosha和Dicer酶加工而成。14精選課件piRNApiRNA是近年來在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的長度約為24～31nt的RNA分子,因在生理狀態(tài)下能與piwi蛋白偶聯(lián),故命名piRNA。由于Piwi為一表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子,能與PcG蛋白共同結(jié)合于基因組PcG應(yīng)答元件上,協(xié)助PcG沉默同源異型基因,因此推測與Piwi相關(guān)的piRNA也應(yīng)具有表觀遺傳學(xué)的調(diào)控作用15精選課件

piRNA的形成及擴(kuò)增piRNA前體與piwi蛋白結(jié)合后，能在u位點(diǎn)進(jìn)行切割形成piRNA反義鏈，piRNA反義鏈能與轉(zhuǎn)座子識別，并使切割后的轉(zhuǎn)座子與AGO3蛋白結(jié)合，從而進(jìn)一步對轉(zhuǎn)座子進(jìn)行修飾切割，切割后的轉(zhuǎn)座子可以與piRNA前體結(jié)合，并且在U位點(diǎn)切割前體，從而使切割后的前體與piwi蛋白結(jié)合，進(jìn)過剪切修飾形成PiRNA和PiRNA與Piwi蛋白結(jié)合的復(fù)合體，從而使PiRNA數(shù)量增多。16精選課件非編碼RNA的比較17精選課件非編碼RNA的作用

1.影響染色體的結(jié)構(gòu)

2.調(diào)控轉(zhuǎn)錄

3.參與RNA的加工、修飾

4.參與mRNA的穩(wěn)定和翻譯調(diào)控過程

5.影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運(yùn)

6.在植物適應(yīng)環(huán)境脅迫中的調(diào)控作用

7.在細(xì)胞發(fā)育和分化中的調(diào)控作用18精選課件非編碼RNA的檢測技術(shù)cDNA克隆策略實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR技術(shù)）SAGE技術(shù)微陣列芯片檢測技術(shù)Solexa測序法表面增強(qiáng)拉曼光譜法19精選課件cDNA克隆策略長度在20～500bp的RNA大多為非編碼RNA。非編碼RNA可將由變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離到的非編碼RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后加上接頭，并克隆到標(biāo)準(zhǔn)載體中構(gòu)建cDNA文庫。為防止5'端丟失常在3′端加上C-尾巴，在T4RNA連接酶的作用下連上寡聚核苷酸接頭，最后對連接產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。cDNA克隆策略可鑒別已知的高豐度非編碼RNA，如tRNAs或小核糖體RNA。20精選課件實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR技術(shù)）實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一種高通量、靈敏的基因表達(dá)檢測技術(shù)，常用于蛋白編碼基因表達(dá)檢測，也被廣泛地應(yīng)用于microRNA或其他非編碼RNA的表達(dá)檢測。通過該技術(shù)，可定量監(jiān)測目的基因的表達(dá)情況，篩選生物學(xué)功能相關(guān)的非編碼RNA。21精選課件SAGE技術(shù)SAGE是一種高通量的研究技術(shù)，通過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,從而獲得SAGE雙標(biāo)簽,然后,通過連接、擴(kuò)增雙標(biāo)簽片段并進(jìn)行克隆、測序，以同一標(biāo)簽在某組織中出現(xiàn)的頻率，反映該標(biāo)簽所代表的基因在該組織中的表達(dá)豐度。與微陣列芯片技術(shù)相比，SAGE可在未知任何基因或EST序列的情況下，對靶細(xì)胞進(jìn)行研究，具有顯著的優(yōu)越性。22精選課件微陣列芯片檢測技術(shù)微陣列芯片以高密度陣列為特征，在微陣列上固定大量探針分子，并將標(biāo)記樣本與微陣列探針進(jìn)行雜交。通過檢測雜交信號的強(qiáng)度，研究不同樣本中特異基因的表達(dá)豐度，從而較為全面地比較不同樣本中基因表達(dá)水平的差異。被廣泛用于mRNA的研究，也被用于非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)與表達(dá)分析。23精選課件Solexa測序法Solexa測序法是新發(fā)明并迅速得到廣泛應(yīng)用的一種高通量基因表達(dá)檢測技術(shù)，該方法是利用單分子陣列來測定基因的表達(dá)情況。首先，將核酸從細(xì)胞中提取，將其片段化為100～200堿基大小，分別連上接頭，經(jīng)接頭引物的PCR擴(kuò)增后制成文庫；然后，將已加入接頭的核酸片段固定在含有接頭的芯片上，經(jīng)反應(yīng)后，將不同片段擴(kuò)增。在每個(gè)循環(huán)中，利用邊合成邊測序的原理，在單分子陣列中加入4種熒光標(biāo)記染料的核苷和聚合酶，在酶的作用下，每個(gè)單鏈DNA分子通過互補(bǔ)堿基的配對被延伸，通過CCD采集熒光信號，快速掃描整個(gè)陣列，檢測特定的結(jié)合在每個(gè)片段上的堿基，從而進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄本的測序。24精選課件盡管Solexa測序技術(shù)以高效率、高精確鑒定miRNA著稱，但相對于傳統(tǒng)、普遍使用的miRNA定量方法還存在一定的不足，這可能是由于測序深度不足，或一些microRNA存在特殊修飾而帶來的問題。25精選課件表面增強(qiáng)拉曼光譜法（SERS）利用水的拉曼散射很微弱這一特點(diǎn)，高靈敏度和特異性的SERS檢測技術(shù)逐漸成為研究水相中的生物和化學(xué)樣品的理想工具，應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、蛋白和核酸等生物樣品的檢測。26精選課件克隆非編碼RNA的方法基因克隆法蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物分離法27精選課件基因克隆法小鼠腦→組織勻漿→提取總RNA→8%PAGE回收50-110nt（fractionalⅠ）和110-500nt（fractional）→Poly(A)聚合酶加尾→cDNApSPORTI→PCR→高密度陳列→雜交除去高豐度已知的小RNA→未雜交的cDNA測序。28精選課件蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物分離法分離蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物，除去蛋白質(zhì)，純化RNA分子，反轉(zhuǎn)錄cDNA，克隆、測序、結(jié)果分析。所得RNA的cDNA分子必須進(jìn)行Northern雜交，除去斷裂的小RNA。29精選課件microRNA30精選課件31精選課件32精選課件33精選課件2001年命名為microRNA2002年入選為science年度十大發(fā)現(xiàn)之首34精選課件35精選課件36精選課件37精選課件38精選課件39精選課件40精選課件41精選課件42精選課件MicroRNAmicroRNA（簡稱miRNA）是一種非編碼小RNA分子（約含22個(gè)核苷酸，19~25）存在于植物，動物和一些病毒中，其功能在RNA沉默和基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。43精選課件miRNA的特點(diǎn)單鏈RNA19~25nt，非編碼RNA單一的目標(biāo)miRNA可能靶向數(shù)百個(gè)基因抑制翻譯（動物）或降解靶RNA（植物）對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、癌變及病毒感染起調(diào)控作用保守性進(jìn)化44精選課件3.miRNA的鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn)2.miRNA的作用機(jī)理1.miRNA的產(chǎn)生和特點(diǎn)3.miRNA的鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn)2.miRNA的作用機(jī)理1.miRNA的產(chǎn)生和特點(diǎn)第一節(jié)miRNA的產(chǎn)生和特點(diǎn)

miRNA的產(chǎn)生：植物miRNA的形成包括miRNA基因轉(zhuǎn)錄、加工成熟和功能復(fù)合體組配三個(gè)過程。miRNA基因轉(zhuǎn)錄：通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核中形成初級轉(zhuǎn)錄本，稱為primarymiRNAs（pri-miRNAs）。植物的pri-miRNA通常由腺苷酸開頭，具有5'帽子和3'-polyA尾，位于一個(gè)保守的TATA-box序列的下游40個(gè)核苷酸序列處。第一節(jié)miRNA的產(chǎn)生和特點(diǎn)

加工成熟：植物miRNA的加工成熟過程是由存在細(xì)胞核內(nèi)的Dicer酶類似物，在HYL1蛋白的協(xié)助下，以一種ATP依賴的方式，通過兩次剪切步驟生成。第一次剪切pri-miRNA后，產(chǎn)生具有莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)的pre-miRNA，接著在兩個(gè)蛋白酶HYL1和SERRATE的協(xié)助下再次切割pre-miRNA，將miRNA/miRNA*二聚體從pre-miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的“莖”上剪切下來。miRNA基因在細(xì)胞核中經(jīng)由RNA聚合酶II進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、DCL1剪切后和HEN1介導(dǎo)的甲基化后，由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HASTY（HST）從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。第一節(jié)miRNA的產(chǎn)生和特點(diǎn)功能復(fù)合體組配：miRNA/miRNA*二聚體中miRNA鏈在SDN的誘導(dǎo)下裝載進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），成熟miRNA與ARGONAUTE1（AGO1）蛋白結(jié)合，形成非對稱的RISC，而miRNA*則被降解。miRNA引導(dǎo)RISC切割目標(biāo)靶基因mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮生物學(xué)功能。micorRNA的產(chǎn)生50精選課件micorRNA的產(chǎn)生51精選課件micorRNA的產(chǎn)生52精選課件

micorRNA的產(chǎn)生53精選課件RISC：RNA-InducedSilencingComplex一種多結(jié)構(gòu)域的雙鏈RNA專一性RNaseⅢ54精選課件miRNA如何行使功能？與mRNA的3‘端非編碼區(qū)特定位點(diǎn)(其第2~8個(gè)核苷酸)綁定：>與mRNA完美互補(bǔ)時(shí)——會引發(fā)mRNA降解；>不完美的與mRNA配對時(shí)，會引發(fā)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默（抑制靶基因的表達(dá)）從而抑制或阻止相應(yīng)的mRNA翻譯過程。舉例分析：在DNA修復(fù)通路中行使上述過程1）抑制或阻止正常細(xì)胞DNA修復(fù)產(chǎn)生致癌作用2）抑制或阻止癌細(xì)胞DNA修復(fù)達(dá)到治療效果55精選課件植物miRNA的特點(diǎn)植物miRNA與動物miRNA的相類似特點(diǎn)(1)miRNA廣泛存在于真核生物中。(2)miRNA的長度約為20～24nt。(3)miRNA沒有開放閱讀框(ORF)及蛋白質(zhì)編碼基因特點(diǎn)。(4)miRNA的基因成簇性。(5)miRNA的保守性。56精選課件植物miRNA的特點(diǎn)植物miRNA與動物miRNA的相類似特點(diǎn)(6)miRNA表達(dá)的時(shí)空特異性。(7)幾乎所有的miRNA從前體的1條臂中加工而來。(8)miRNA的5端多以U開頭。57精選課件植物miRNA的特點(diǎn)植物miRNA與動物miRNA的不同特點(diǎn)(1)植物miRNA前體的大小變化較大，一般為64～303nt，而動物miRNA前體的變化較小，一般為60～75nt。(2)植物中的miRNA較動物中的更為保守，它們與互補(bǔ)序列的錯配數(shù)也少于動物。58精選課件植物miRNA的形成miRNA成熟所需的酶類一種多結(jié)構(gòu)域的雙鏈RNA專一性RNase1II(Dicer酶、類Dicer酶)和Argonaute蛋白。Dicer酶包含4種結(jié)構(gòu)域：RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域、PAZ(Piwi—ArgonauteZwille)結(jié)構(gòu)域、2個(gè)RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域和dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRBD)Argonaute蛋白具有PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域。59精選課件植物miRNA的作用機(jī)制miRNA的作用方式可根據(jù)其與靶基因的互補(bǔ)程度不同而分為兩種：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物裂解和翻譯抑制。a.當(dāng)miRNA與靶mRNA完全互補(bǔ)或接近完全互補(bǔ)時(shí)，則會切割mRNA；b.當(dāng)植物miRNA與靶mRNA不完全互補(bǔ)時(shí)，則抑制其翻譯。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA也可以通過目標(biāo)染色體位點(diǎn)的甲基化，或通過調(diào)控靶mRNA的定位或穩(wěn)定性在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮作用。60精選課件植物miRNA的功能1抗生物脅迫植物中存在一類miRNA與多種植物病毒基因完全或不完全互補(bǔ)，推測這類miRNA可通過切割病毒基因抑制病毒侵染。2抗非生物脅迫2．1抗?fàn)I養(yǎng)脅迫(1)調(diào)節(jié)植物磷代謝平衡Chiou發(fā)現(xiàn)，在磷脅迫下，擬南芥中miR399大量表達(dá)；而在高磷條件下，未檢測到miR399的表達(dá)。(2)調(diào)節(jié)植物硫代謝平衡miR395在高硫條件下不表達(dá)，在硫缺失脅迫下表達(dá)。61精選課件62精選課件植物miRNA的功能2抗非生物脅迫2．2抗環(huán)境脅迫miRNA可以使植物抵抗寒冷、高濃度ABA、干旱、高鹽等極端自然環(huán)境及抵抗環(huán)境引起的自身氧化脅迫。63精選課件64精選課件miRNA的檢測miRNA的獲取miRNA的確認(rèn)miRNA的檢測方法65精選課件miRNA的獲取miRNA分子的序列短小1）在基因組中存在較多的互補(bǔ)序列2）在不同生物體內(nèi)與靶基因結(jié)合的方式也不盡相同3）通常與多種蛋白相互作用這使得建立一個(gè)有效而且普遍適用的研究方法異常困難。#到目前為止,miRBase上公布的miRNA總數(shù)將近3000種。#現(xiàn)在已知靶基因的miRNA多是通過基因克隆和生物信息學(xué)篩選的方法發(fā)現(xiàn)的。66精選課件miRNA的獲取——基因克隆1.1基因克隆直接克隆的方法通常是從總RNA中提取大約22nt的小RNA分子,制備一個(gè)小RNA的cDNA(complementaryDNA)文庫。將文庫中的小RNA序列與基因組數(shù)據(jù)庫中BLAST序列類似性比對,排除非miRNA序列后,通過Northern印跡方法(Northernblotting)得到最終確認(rèn)。目前大量的已知miRNA都是通過這種方法獲得的?；蚩寺》椒ǖ膬?yōu)點(diǎn)是對于高豐度或常表達(dá)的基因來說,可以獲得完整的miRNA序列。然而對于另一些miRNA,它們在生物體內(nèi)濃度很低(表達(dá)量低或表達(dá)產(chǎn)物極不穩(wěn)定,或前體到成熟的加工效率低等原因引起),或者某些只在生物體的特定時(shí)期或特定組織器官中表達(dá),直接克隆法則無法獲取。注：Northern印跡雜交（Northernblot）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。67精選課件miRNA的獲取——生物信息學(xué)篩選1.2生物信息學(xué)篩選隨著生物全基因組測序的完成,利用計(jì)算機(jī)對基因組序列進(jìn)行搜索可以大大提高miRNA的鑒定效率。所以,人們根據(jù)目前已知的miRNA基因序列總結(jié)它們的特征和規(guī)律,編寫了一些計(jì)算機(jī)程序,通過對生物基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索,可以找到那些可能為miRNA的基因序列,然后通過Northernblotting來篩選真正的miRNA基因。

生物信息學(xué)方法是依據(jù)在不同的物種中，其成熟的miRNA具有較大的序列同源性以及前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)大的保守性這一特征在基因組數(shù)據(jù)庫中搜索新的miRNA基因。該方法根據(jù)比較基因組學(xué)原理并結(jié)合生物信息軟件在已測序基因組中進(jìn)行搜索比對，根據(jù)同源性的高低再進(jìn)行RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，將符合條件的候選miRNA與已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)鑒定的miRNA分子進(jìn)行比較分析，最終確定該物種miRNA的分布及數(shù)量。近年來隨著miRNA預(yù)測方法的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)的miRNA數(shù)量呈幾何級數(shù)增長。這些預(yù)測方法從簡單的序列比對搜索發(fā)展到現(xiàn)在的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，程序設(shè)計(jì)越來越智能化，復(fù)雜化。68精選課件miRNA的獲取——生物信息學(xué)篩選隨著人miRNA基因轉(zhuǎn)錄出的pri-miRNA迅速加工成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA，隨后被切割成miRNA：miRNA*雙體，并被選擇性地組合進(jìn)核糖核酸沉默誘導(dǎo)復(fù)合體（RISC）并進(jìn)行靶基因識別。在相似的物種中，miRNA是很保守的；但在相距較遠(yuǎn)的物種間，miRNA又有一定的分歧，尤其體現(xiàn)在pre-miRNA上。這些miRNA功能作用機(jī)制的闡明為預(yù)測軟件的研發(fā)提供了理論依據(jù)，但仍需要不斷修補(bǔ)和完善。近年來，幾個(gè)基于這些規(guī)則的miRNA預(yù)測程序先后被開發(fā)（下表），并被廣泛使用。生物信息學(xué)手段可以說是一種更高通量的方法。通常有以下幾種方法:①M(fèi)irscan是一種基于二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測程序,通過掃描兩種系之間是否存在同源的莖環(huán)結(jié)構(gòu),應(yīng)用于檢測脊椎動物和線蟲的候選基因。69精選課件miRNA的獲取——生物信息學(xué)篩選②Mirseeker是一種檢查RNA序列莖環(huán)結(jié)構(gòu)的預(yù)測程序,應(yīng)用于篩選昆蟲的候選基因。它是根據(jù)3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來預(yù)測的:一是具有長度為70～100nt莖環(huán)結(jié)構(gòu)的Pre-miRNA;二是不同種系生物中Pre-miRNA的保守性;三是miRNA的核苷酸差異性。③ERPIN是一種類似于BLAST的校對程序,用于搜尋動物基因組中與miRNA序列類似的序列。④MiPred可以通過randomforest預(yù)測模型和miRNA特征的結(jié)合,區(qū)分miRNA的真正前體和假冒前體。70精選課件71精選課件72精選課件miRBase序列數(shù)據(jù)庫miRBase序列數(shù)據(jù)庫是一個(gè)提供包括miRNA序列數(shù)據(jù)、注釋、預(yù)測基因靶標(biāo)等信息的全方位數(shù)據(jù)庫，是存儲miRNA信息最主要的公共數(shù)據(jù)庫之一。miRBase提供便捷的網(wǎng)上查詢服務(wù)，允許用戶使用關(guān)鍵詞或序列在線搜索已知的miRNA和靶標(biāo)信息，詳情請（/）。2012年8月1日正式發(fā)布。相比于以往版本的數(shù)據(jù)庫（SangermicroRNA序列數(shù)據(jù)庫），19.0版數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了巨大的數(shù)據(jù)更新：miRNA發(fā)夾前體序列已升至21264條，新增3171條；成熟miRNA升至25141條，新增3625條；已發(fā)布的miRNA序列共涵蓋193個(gè)物種，相比于18.0版新增25個(gè)物種。新版數(shù)據(jù)庫對miRNA序列注釋和命名進(jìn)行了系統(tǒng)的修正，miR*命名已經(jīng)終止使用，取而代之的是-5p和-3p的命名法。73精選課件miRNA的確認(rèn)判斷標(biāo)準(zhǔn):①能夠通過與特定大小的總RNA樣品雜交得到22個(gè)堿基對(～22nt)的產(chǎn)物(即需要Northern雜交或引物延伸反應(yīng)驗(yàn)證表達(dá))。②所得的序列是從特定大小的(～22nt)的小分子RNA庫中克隆到的,并且必需與克隆的來源物種的基因組序列完全匹配。③經(jīng)過前體的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,有發(fā)夾狀的二級結(jié)構(gòu),并且成熟的miRNA序列在發(fā)夾的一條臂上。④成熟的miRNA序列與預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)在不同物種間有保守性。⑤在Dicer突變的系統(tǒng)中,前體的積累增多。要確認(rèn)基因克隆獲得的或生物信息學(xué)分析預(yù)測的基因是否為真正的miRNA,就應(yīng)該采用上面5個(gè)原則來檢驗(yàn)。74精選課件miRNA的檢測方法要了解miRNA在基因調(diào)控中扮演的角色,很關(guān)鍵的一個(gè)方法就是迅速、準(zhǔn)確地定量檢測miRNA基因的表達(dá)。檢測miRNA的方法主要有以下幾種:①Northernblotting是現(xiàn)在檢測miRNA表達(dá)最主要的手段,所有克隆和生物信息學(xué)分析得來的miRNA都需要經(jīng)過Northernblotting來驗(yàn)證和確認(rèn)。這種方法的缺點(diǎn)在于靈敏度較低且不能進(jìn)行高通量的檢測。75精選課件miRNA的檢測方法②RT-PCR（reversetranscriptionPCR，反轉(zhuǎn)錄PCR）也被用來檢測miRNA前體的表達(dá)水平,但miRNA前體的表達(dá)水平并不一定和成熟miRNA的表達(dá)水平一致。因此,在RT-PCR的基礎(chǔ)上,人們改進(jìn)了一些技術(shù),從而使得能夠檢測低表達(dá)量的miRNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timePCR)可以很精確的定量分析miRNA的表達(dá),也經(jīng)常用于驗(yàn)證預(yù)測的miRNA。引物延伸法,就是在引物的5′末端加一個(gè)特異標(biāo)記,可以定量測定低豐度的RNA含量。原位雜交技術(shù),可以方便的檢測miRNA的時(shí)空表達(dá)的差異。原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。另有熒光原位雜交。76精選課件miRNA的檢測方法③芯片技術(shù)(mi-croarray)是一種更快、更廣泛、更有前途的研究miRNA表達(dá)的方法。Liu等最先發(fā)表了關(guān)于微點(diǎn)陣能夠獲得高通量的結(jié)果。這些結(jié)果顯示了組織特異性miRNA的表達(dá)標(biāo)記,而且通過Northernblot和real-timePCR進(jìn)行了驗(yàn)證。芯片技術(shù)固然以其高通量和并行處理的特點(diǎn)在基因信息分析中占據(jù)重要地位,但信息量大并不等于質(zhì)量高。實(shí)際上,基因芯片的一個(gè)突出弱點(diǎn)就是其信息質(zhì)量的穩(wěn)定性和可重復(fù)性比較差,且無法實(shí)現(xiàn)定量檢測,因此后來又出現(xiàn)了多種改進(jìn)的芯片技術(shù),其中現(xiàn)在流行的就是液相芯片技術(shù)。液相芯片(liquichip)是美國納斯達(dá)克上市的Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術(shù),它既能為后基因組時(shí)代科學(xué)研究提供強(qiáng)大的技術(shù)支持,又能提供高通量的新一代分子診斷技術(shù)平臺。77精選課件miRNA的識別多個(gè)研究小組采用生物化學(xué)結(jié)合是生物信息學(xué)的方法開展對miRNAs的研究工作。由于據(jù)推測都是由Dicer酶降解RNA得到的，21—23個(gè)堿基大小、有5’端磷酸基和3’羥基的RNA片斷，有的實(shí)驗(yàn)室采用改良的定向克隆方法來篩選具有相同特征的小分子——1.篩選一定大小的RNA分子，連接到3’和5’的適配子(adapters)2.逆轉(zhuǎn)錄3.通過PCR擴(kuò)增4.亞克隆5.測序。在分子克隆中指從大片段的克隆中選取特定小片段再克隆/subclone78精選課件miRNA前體在基因組上的定位和聚類是通過向基因組數(shù)據(jù)庫查詢進(jìn)行。這個(gè)方法有助于判斷miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解產(chǎn)物。生物信息學(xué)的方法被鑒別出來，已經(jīng)鑒別出來的miRNAs只不過是滄海一粟，由于很多已經(jīng)鑒別出來的miRNAs是從單個(gè)克隆中鑒別出來的，所以可以假設(shè)還有很多miRNAs在分離和鑒定過程中被“漏掉”了，測序工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。79精選課件miRNA的靶基因miRNA的靶基因預(yù)測miRNA的靶基因檢測miRNA的生物學(xué)功能80精選課件

miRNA的靶基因預(yù)測

以前,研究miRNA的靶基因依賴于正向遺傳學(xué)方法,包括突變體的產(chǎn)物、變形篩選、定位克隆和miRNA及其靶基因的確認(rèn),如lin24和let27及它們的靶基因的發(fā)現(xiàn)。在果蠅中,miRNAbantam及其靶基因hid的發(fā)現(xiàn)就是正向遺傳學(xué)研究miRNA的經(jīng)典過程。

反向遺傳學(xué)聯(lián)合生物信息學(xué)的方法比正向遺傳學(xué)更優(yōu)越。它主要是由軟件來預(yù)測miRNA的靶基因并為分子實(shí)驗(yàn)提供指標(biāo)，其基本原理是基于miRNA與其靶基因的自然配對。已知miRNA及其靶基因之間的對比和相關(guān)性,lin24、let27和bantam基因的確認(rèn)等都為計(jì)算機(jī)程序發(fā)展提供了更多的信息。計(jì)算機(jī)程序預(yù)測方法在植物種屬中運(yùn)用的很成功,而在動物中則不是很成功,這可能是因?yàn)橹参镏械膍iRNA與其靶基因幾乎完全配對結(jié)合。而在動物中,miRNA與靶基因mRNA通常以不精確的堿基互補(bǔ)配對結(jié)合。81精選課件

miRNA的靶基因預(yù)測

——miRNA的研究意義之重大是毋庸置疑的。然而，與新的miRNA的頻頻發(fā)現(xiàn)相比，miRNA的功能研究相對緩慢。——到目前為止，在發(fā)現(xiàn)的4449多個(gè)miRNA中，確定功能的miRNA僅有幾十個(gè)?！獙?dǎo)致miRNA功能研究進(jìn)展緩慢的非常重要的原因是miRNA的作用靶標(biāo)難以確定?！ㄟ^實(shí)驗(yàn)方法確定miRNA的作用靶標(biāo)非常耗時(shí)，目前尚無高通量的靶標(biāo)鑒定方法。因此，通過理論方法預(yù)測miRNA的作用靶標(biāo)成為當(dāng)前識別miRNA作用靶標(biāo)的較為理想的途徑。以下重點(diǎn)介紹幾種經(jīng)典預(yù)測軟件的算法分析，其他軟件（見下表）：82精選課件miRNA幾種常見的預(yù)測方法下面概括介紹幾種常見的預(yù)測方法：(ⅰ)miRanda.miRanda是最早的一個(gè)利用生物信息學(xué)對miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測的軟件,由Enright等人于2003年設(shè)計(jì)開發(fā).其對3′UTR的篩選依據(jù)主要是從序列匹配、miRNA與mRNA雙鏈的熱穩(wěn)定性以及靶位點(diǎn)的保守性三個(gè)方面進(jìn)行分析.miRanda軟件首先選取了黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中已知的73條miRNA作為探針,采用類似于Smith-Waterman的算法對9805個(gè)3′UTR進(jìn)行堿基互補(bǔ)分析.——首先,互補(bǔ)參數(shù)被設(shè)定為:G︰C,A︰U為+5,G︰U為+2,其他配對方式為?3,同時(shí)起始空位(gap-opening)罰分為?8,延伸空位(gap-extension)罰分為?2;*序列比對就是通過一定的算法對兩個(gè)或多個(gè)序列進(jìn)行比較,找出序列間最大的相似性匹配。*Smith&Waterman算法是一種經(jīng)典的序列比對算法,在雙序列比較的情況下具有比較好的速度和結(jié)果,但是在進(jìn)行序列數(shù)據(jù)庫搜索時(shí)則顯得處理速度不足。83精選課件miRanda——其次,為體現(xiàn)與靶基因作用過程中miRNA5′端和3′端的不對稱性,5′端的前11個(gè)堿基的互補(bǔ)分值(complementarityscores)將乘以一個(gè)scale參數(shù);——最后,miRNA與靶mRNA的互補(bǔ)還要遵循以下4個(gè)規(guī)則:miRNA第2~4位堿基和靶基因精確匹配;第3~12位堿基和靶基因錯配不得多于5個(gè);9~L-5(L為miRNA總長)位堿基最少一個(gè)錯配;最后5個(gè)堿基錯配不得多于2個(gè).84精選課件miRanda在熱穩(wěn)定性方面,miRanda采用Vienna軟件包計(jì)算miRNA與3′UTR作用的自由能(ΔG).在物種間保守性方面,要求靶位點(diǎn)在多物種3′UTR比對中相同位置處堿基相同.

綜合以上3條原則,miRanda選取每條miRNA相對的3′UTR中排名前10位的基因,作為miRNA的候選靶基因,對于多個(gè)miRNA對應(yīng)于同一靶位點(diǎn)的情況,miRanda則使用貪心算法(GreedyAlgorithm)選取其中得分最高且自由能最低的那一對.85精選課件TargetScan(ⅱ)TargetScan和TargetScanS.TargetScan是Lewis等人在2003年開發(fā)的一款用于預(yù)測哺乳動物miRNA靶基因的軟件,該軟件將RNA間相互作用的熱力學(xué)模型與序列比對分析相結(jié)合,預(yù)測不同物種間保守的miRNA結(jié)合位點(diǎn).與miRanda不同,在TargetScan的算法中,要求miRNA5′端第2~8位堿基與mRNA的3′UTR完全互補(bǔ),這7個(gè)核苷酸被稱作“miRNA種子區(qū)/關(guān)鍵區(qū)”（seedregion）.種子區(qū)向兩側(cè)延伸直到出現(xiàn)堿基錯配為止,這期間允許G︰U配對,同時(shí)利用RNAFold計(jì)算結(jié)合位點(diǎn)的自由能.TargetScan中引入了信號噪聲比來評估預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確度,所謂信號噪聲比即用已知(信號組)和隨機(jī)生成的miRNA(噪聲組)分別對mRNA的3′UTR進(jìn)行預(yù)測,所得靶基因數(shù)目的比值.86精選課件當(dāng)僅針對人(Homosapiens)和小鼠(Musmusculus)的3′UTR對miRNA靶位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測時(shí),信號噪聲比為2︰1針對人、小鼠、大鼠(Rattusnorvegicus)的3′UTR進(jìn)行預(yù)測時(shí)信號噪聲比為3.2︰1研究范圍擴(kuò)大到人、小鼠、大鼠和河豚(Takifugurubripes)時(shí),信號噪聲比為4.6︰1.

隨著物種數(shù)目的增多,預(yù)測得到的靶基因減少,但準(zhǔn)確性得到了相應(yīng)的提高.87精選課件TargetScanS后來,Lewis等人又對TargetScan進(jìn)行了優(yōu)化,即TargetScanS.TargetScanS在人、小鼠、大鼠的基礎(chǔ)上增加了狗(Canisfamiliaris)和雞(Gallusgallus)的基因組數(shù)據(jù),同時(shí)在算法上做了改動,將種子區(qū)由先前的7個(gè)核苷酸調(diào)整為5′端第2~7位堿基共6個(gè)核苷酸,要求在種子區(qū)完全互補(bǔ)的情況下,miRNA第8位堿基與靶基因互補(bǔ)或者miRNA第1位堿基是腺嘌呤.2007年,Andrew等人又將TargetScanS的算法中加入了新的條件1）即有效的miRNA結(jié)合位點(diǎn)多分布于3′UTR中AU富集的區(qū)域2）功能上具有協(xié)同作用的miRNA靶位點(diǎn)相近3）miRNA的第12~17個(gè)核苷酸與3′UTR互補(bǔ)促進(jìn)兩者的結(jié)合4）有效的miRNA結(jié)合位點(diǎn)優(yōu)先分布于3′UTR的兩側(cè),但距離終止密碼子至少15個(gè)核苷酸.88精選課件動物中靶基因預(yù)測方法89精選課件擴(kuò)展miRNA命名物種縮寫癌基因和相關(guān)miRNA的特征基因數(shù)據(jù)庫Blast簡介cancergeneticswebmiRanda應(yīng)用90精選課件miRNA命名(1)miRNA簡寫成miR-No.,它的基因簡寫成mir-No.如miR-21；(2)高度同源的miRNA在No.其后加英文字母(小寫,一般從a開始)如miR-199a和miR-199b；(3)由不同染色體上的DNA序列轉(zhuǎn)錄加工而成的具有相同成熟體序列的miRNA，則在后面加上阿拉伯?dāng)?shù)字以區(qū)分,如miR-199a-1和miR-199a-2；(4)如果一個(gè)前體的2個(gè)臂分別加產(chǎn)生miRNA，則根據(jù)克隆實(shí)驗(yàn)，在表達(dá)水平較低的miRNA后面加“*”，如miR-199amiR-199a*，或進(jìn)行如下命名，miR-142-5p(也可命名為miR-142-s，表示從5'端的臂加工而來)和miR-142-3p(也可命名為miR-142-as，表示從3'端的臂加工而來)；(5)將物種縮寫置于miRNA之前，如hsa-miR-195；(6)確定命名規(guī)則之前發(fā)現(xiàn)的miRNA，如let-7，則保留原來名字。91精選課件物種縮寫http//www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/guidelines.htmlhsa:Homosapiens,人mmu:Musmusculus,小家鼠rno：Rattusnorvegicus大鼠cfa：Canisfamiliaris狗gga：Gallusgallus雞dan、der、dgr、dme（黑腹果蠅）、dmo、dpe、dps、dse、dsi、dvi、dwi、dya：果蠅（不同種屬）92精選課件

癌基因和相關(guān)miRNA的特征大量關(guān)于癌癥的相關(guān)研究證實(shí)在癌癥患者體內(nèi)確實(shí)存在著某些異常表達(dá)的miRNA值得研究的是癌癥患者體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的異常表達(dá)的miRNA幾乎全部作用于癌癥患者的癌基因上從這個(gè)角度看，miRNA在癌癥的發(fā)生過程中，特別是對癌基因的基因調(diào)控，抑制蛋白質(zhì)表達(dá)方面應(yīng)該起著非常重要的作用因此，研究癌癥與miRNA的關(guān)系具有非常重要的生物學(xué)意義。93精選課件

癌基因和相關(guān)miRNA的特征癌癥患者體內(nèi)存在的某些與癌癥有密切關(guān)系的蛋白質(zhì)，其出現(xiàn)與癌基因的激活有密切關(guān)系，因此研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域與miRNA的關(guān)系也非常有意義。目前研究的RNAi技術(shù)可在體外培養(yǎng)細(xì)胞中沉默人類的內(nèi)源性基因，使得RNAi技術(shù)可能進(jìn)入腫瘤治療領(lǐng)域。利用RNAi技術(shù)封閉惡性細(xì)胞中的癌基因成為高特異性治療癌癥的新希望。94精選課件miRNA預(yù)測——主要遵循原則主要遵循以下幾個(gè)常用原則:(ⅰ)miRNA與其靶位點(diǎn)的互補(bǔ)性(ⅱ)miRNA靶位點(diǎn)在不同物種之間的保守性(ⅲ)miRNA-mRNA雙鏈之間的熱穩(wěn)定性(ⅳ)miRNA靶位點(diǎn)處不應(yīng)有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)(ⅴ)miRNA5′端與靶基因的結(jié)合能力強(qiáng)于3′端.區(qū)別：miRNA與mRNA的3’端結(jié)合95精選課件靶基因的檢測方法目前由于miRNA相關(guān)研究開展時(shí)間不長，可以輔助或?qū)崿F(xiàn)miRNA靶基因鑒定的生物實(shí)驗(yàn)方法種類不多，總結(jié)起來主要有：DNA微陣列實(shí)驗(yàn)（DNAmicroarray）、免疫印跡（Westernblot）、報(bào)告基因檢驗(yàn)（reportgeneassay）、靶位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)、免疫沉淀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)（immunoprecipitation，IP）、蛋白質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)（massspectrometry）。與miRNA靶基因的預(yù)測方法相比,對miRNA靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法并不多,目前還沒有一個(gè)快速、簡便、高通量的鑒定方法.96精選課件靶基因的檢測方法最直接的鑒定方法是,利用熒光定量PCR及Westernblot方法分別檢測轉(zhuǎn)染(水平