布魯克液質(zhì)聯(lián)用操作規(guī)程

布魯克液質(zhì)聯(lián)用儀操作規(guī)程1操作前檢查1.1檢查液氮罐和高純氮的出口壓力，保證在正常范圍1.2檢查洗針溶液和流動(dòng)相1.3流動(dòng)相須現(xiàn)配并超聲，緩沖鹽溶液過0.22μm微孔濾膜〔或者使用色譜純的鹽溶液和酸溶液〕1.4如使用溶融石英進(jìn)樣管，操作前應(yīng)檢查石英管是否拉長，確保其未超出ESI探針尖端。1.5檢查系統(tǒng)真空度，電離真空計(jì)讀數(shù)〔分析儀區(qū)域〕應(yīng)小于5×10-6Torr。1.6檢查廢液液位，及時(shí)清空廢液。1.7檢查液氮罐和氦氣鋼瓶是否有一定壓力，以便為測(cè)試樣品提供符合流速和壓力要求的氮?dú)狻矅婌F氣體和枯燥氣體〕和氦氣〔碰撞氣體〕。2操作步驟及考前須知1．檢查并翻開枯燥氣(Drygas)和霧化氣(NebulizerGas)所需的氮?dú)庠矗?)如配備液氮罐，那么需翻開增壓閥及供氣閥閥門，使罐體壓力保持在100psi以上，并調(diào)節(jié)減壓閥出氣口壓力至0.6Mpa；2)如配備氮?dú)獍l(fā)生器，那么提前半小時(shí)翻開氮?dú)獍l(fā)生器電源，以便使氮?dú)饽軌虻竭_(dá)99.99%以上的純度，再調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁恐?0L/min；2．檢查并翻開碰撞氣(CollisionGas)高純氮?dú)釴2或高純氬氣Ar鋼瓶〔純度要求99.999%〕，并調(diào)節(jié)減壓閥出氣口壓力至0.4Mpa；3．檢查機(jī)械泵泵油的水平線，需在小窗口的1/2～2/3之間；4．翻開計(jì)算機(jī)，顯示器電源；5．翻開質(zhì)譜儀主機(jī)電源〔儀器左側(cè)最下方〕；6．啟動(dòng)micrOTOFcontrol控制軟件，務(wù)必保持儀器一直處在shutdown狀態(tài)，待真空度到達(dá)≤1×10e-6mbar后，才可切換至standby狀態(tài)待機(jī)；為了保證良好穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，待真空度下降至10e-7mbar以下后，再operate儀器開始測(cè)試。2.2新建液相方法翻開hystar軟件，選擇method，然后輸入新建方法的名字，點(diǎn)擊open，開始方法的新建。在彈出的對(duì)話框中選擇edit，然后點(diǎn)擊“wizard〞進(jìn)行設(shè)置。液相方法包括梯度、流速、柱溫、樣品盤溫度、時(shí)間、進(jìn)樣針吸樣速度等，可依次設(shè)置即可，全部設(shè)置好之后，將。2.3新建質(zhì)譜方法方法一：在otofcontrol中，翻開method，按照自己待檢測(cè)物的分子量范圍及正負(fù)偏向性選擇適宜的質(zhì)譜方法，小分子有對(duì)應(yīng)的smallmolecular方法，蛋白質(zhì)組有專門的proteomics方法。方法二〔非專業(yè)人員不推薦〕：在otofcontrol中，翻開method，選擇new，即可新建質(zhì)譜方法。可以修改的參數(shù)包括以下幾個(gè)方面：〔1〕mode中的Focus為active，linespectracalculation為usesumintensity，ionpolarity為pos或neg，massrange調(diào)到待檢測(cè)物適宜的分子量范圍。〔2〕source中capillarypos：4500V，neg：3500。Divertvalve：source1-2進(jìn)質(zhì)譜；source1-6為discardtofluid〔3〕Tune中collisionRF小分子調(diào)到1000-1500，大分子調(diào)到2000-2500；lowmass視目標(biāo)物分子量大小截留〔例如目標(biāo)分子為500，可調(diào)為300，去掉小分子區(qū)域的雜峰〕?！?〕MS/MS中如果想檢測(cè)二級(jí)，可以勾選autoMS/MS；precursorions中cycletime正常下為3s〔5〕chromatogram中選擇BPC根據(jù)待檢測(cè)物的分子量大小和正負(fù)偏向性，先在軟件自帶的質(zhì)譜方法中選擇相應(yīng)的方法，再在此方法的根底上進(jìn)行優(yōu)化及分段〔如含鹽的樣品截掉前2-5分鐘，1-6waste〕。儀器在操作狀態(tài)下<Operation>穩(wěn)定20-30分鐘后即可開始儀器質(zhì)量準(zhǔn)確度校正。2.4儀器質(zhì)量準(zhǔn)確度校正2.2.1.藥物和酶解多肽樣品，選用甲酸鈉溶液作為校正標(biāo)準(zhǔn)液。覆蓋質(zhì)量范圍m/z90-1200；校正模式選用<EnhancedQuadratic>。2.2.2.蛋白質(zhì)類樣品選用三氟乙酸鈉溶液作為校正標(biāo)準(zhǔn)液。覆蓋質(zhì)量范圍m/z200-2000；校正模式選用<Quadratic>。2.2.3.校正液配制甲酸鈉校正液：溶劑：異丙醇:水溶液=1:1并含有0.2%甲酸10mM甲酸鈉校正液：1ml1MNaOH+99ml溶劑三氟乙酸鈉校正液：溶劑：50%乙氰含有0.1%三氟乙酸鈉(TFA)2.2.3.<Calibration>校正界面3.測(cè)樣方式3.1直接進(jìn)樣測(cè)定對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品或相對(duì)較純或混合組分較少并且不含鹽的藥物樣品，如果僅需要進(jìn)行鑒定，可以采用直接進(jìn)樣方法測(cè)定。3.1.1樣品用標(biāo)準(zhǔn)溶劑〔50%H2O，50%乙腈或甲醇，0.1%甲酸〕溶解或稀釋3.1.2將配好的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品吸入進(jìn)樣器〔針〕，將進(jìn)樣器〔針〕放置于進(jìn)樣泵中。注意：進(jìn)樣器〔針〕內(nèi)不能有氣泡3.1.3將進(jìn)樣器〔針〕直接與離子源連接〔如圖〕注意毛細(xì)管與注射器之間需緊密連接。進(jìn)樣器內(nèi)不能有氣泡3.1.4設(shè)置進(jìn)樣泵的流速為120～180微升/小時(shí)。3.2液質(zhì)聯(lián)用〔LC/MS〕測(cè)定樣品采用常規(guī)液相色譜系統(tǒng)〔色譜柱2.1x150mm；流速200-300uL/min〕。啟動(dòng)Hystar軟件，翻開hystar軟件，在sampletable中選擇相應(yīng)的文件并翻開，然后復(fù)制一個(gè)之前做過的樣品，對(duì)復(fù)制后的新的一行進(jìn)行文件名，存儲(chǔ)路徑和液相質(zhì)譜方法的修改〔改完之后再檢查一遍〕。注：如果是新建sampletable，可以翻開一個(gè)新的復(fù)制一行粘貼到新建里，因?yàn)樾陆ǖ淖詣?dòng)進(jìn)樣的不對(duì)。4.輸入以下參考參數(shù)4.1.直接進(jìn)樣：〔低流速〕大約在120－180微升/小時(shí)離子源：Nebulizer0.4barDryGas4.0L/minDryTemp180℃4.2.藥物小分子樣品液質(zhì)聯(lián)用：平均流速大約在200-300uL/min離子源：Nebulizer0.8barDryGas6-8L/minDryTemp180℃4.3.酶解多肽樣品液質(zhì)聯(lián)用：平均流速大約在200-300nL/min離子源：DryGas3.0L/minDryTemp160℃5.手動(dòng)獲得一個(gè)MS/MS圖譜翻開MS/MS界面，選擇MRM->輸入<ParentCondition>列表，激活ScanMode。6.后期處理6.1翻開分析文件6.1.1.在任務(wù)欄中或者在工具欄中選擇按鈕均可切換到數(shù)據(jù)分析程序(DataAnalysis)，讀取所獲得的數(shù)據(jù)文件6.1.2.讀取數(shù)據(jù)文件被可選擇File菜單下的open對(duì)話框，所需要的顯示窗口將被程序自動(dòng)翻開。6.1.3.在文件對(duì)話框中選擇目錄d:\data\start用鼠標(biāo)鍵雙擊test0000.d，test0001.d，test0002.d來翻開數(shù)據(jù)文件；按住shift鍵來標(biāo)記所有文件并點(diǎn)擊回車鍵來一次全部翻開所選文件。6.1.4.質(zhì)譜圖與色譜圖按文件名讀取并顯示在File菜單下。在分析清單窗口下選擇所需的文件，選擇后圖譜在各自的窗口下顯示。6.2質(zhì)譜圖6.2.1.在分析清單窗口下選擇的結(jié)果在質(zhì)譜圖窗口顯示。6.2.2.通過Masslist參數(shù)對(duì)話框改變離子檢測(cè)參數(shù)6.2.3.以下對(duì)話框被用來在圖譜中設(shè)置新的離子檢測(cè)參數(shù)6.2.4.對(duì)下一步的Method參數(shù)設(shè)置參見BrukeDaltonicsDataAnalysisReferenceManual6.3色譜數(shù)據(jù)6.3.1.完整色譜圖1.讀取數(shù)據(jù)文件〔e.g.test0001.d〕，顯示TIC〔TotalIonChromatogram〕2.讀取某一個(gè)離子的色譜數(shù)據(jù)可以翻開EditChromatogramTraces對(duì)話框3.通過Edit菜單下選擇Chromatogram選項(xiàng)來翻開Traces對(duì)話框如以下圖所示，選擇質(zhì)荷比為622的離子。6.3.2.獲得各組分的質(zhì)譜圖〔Compoundspectra〕使用Find–>Compound功能鍵，快速有效的產(chǎn)生各組分的質(zhì)譜圖；1〕功能鍵<Compounds-Chromatogram>產(chǎn)生色譜別離過程中所有組分的質(zhì)譜圖。翻開CompoundSpectra窗口時(shí)，可以看到各組分的質(zhì)譜圖。2〕功能鍵<Compounds-MS(n)>產(chǎn)生所有采用MS(n)步驟采集的圖譜。3〕<Compounds-AutoMS(n)>產(chǎn)生MS-和MS/MS圖7.報(bào)告有幾種可用的報(bào)告形式來輸出數(shù)據(jù)，一種報(bào)告僅有質(zhì)譜圖，另一種報(bào)告那么只有色譜圖，還有一種兩種圖譜都保存。7.1.直接打?。捍蛴℃I；或者翻開File菜單，選擇Print；或者通過打印預(yù)覽打印，選擇打印預(yù)覽鍵或在File菜單項(xiàng)選擇擇PrintPreview，然后在打印預(yù)覽窗口下選擇打印鍵7.1.1報(bào)告內(nèi)容下拉菜單包含了所有可選的報(bào)告內(nèi)容7.1.2.獲得參數(shù)報(bào)告選擇此內(nèi)容的報(bào)告中包含了獲得所選分析結(jié)果的參數(shù)7.1.3.顯示報(bào)告選擇此內(nèi)容將完全按照顯示窗口打印〔包括色譜窗口、質(zhì)譜顯示窗口、混合物質(zhì)譜窗口、質(zhì)譜窗口〕7.2質(zhì)譜圖報(bào)告內(nèi)容中幾種可選的質(zhì)譜圖形式7.2.1.質(zhì)譜清單報(bào)告報(bào)告中含所選的質(zhì)譜圖的peak清單7.2.2.質(zhì)譜圖報(bào)告報(bào)告中含所選的質(zhì)譜圖報(bào)告7.3色譜圖報(bào)告內(nèi)容中幾種可選的色譜圖形式7.3.1色譜清單報(bào)告報(bào)告中含所選的色譜圖的色譜峰清單7.3.2色譜圖報(bào)告報(bào)告中含所選質(zhì)