滇金絲猴檢疫技術(shù) 第3部分：隱孢子蟲實驗室檢測技術(shù)規(guī)范

1DB53/TXXXX—2021滇金絲猴檢疫技術(shù)第3部分：隱孢子蟲實驗室檢測技術(shù)規(guī)范重要提示：本文件涉及人獸共患病原體的操作，應在符合國家相關(guān)生物安全規(guī)定（GB19489和NY/T541）的條件下進行。本文件規(guī)定了滇金絲猴（Rhinopithecusbieti）檢疫技術(shù)中隱孢子蟲實驗室檢測技術(shù)的試驗原理、試驗條件、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理。本文件適用于滇金絲猴檢疫技術(shù)中隱孢子蟲實驗室檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1隱孢子蟲Cryptosporidium頂復門孢子蟲綱真球蟲目隱孢子蟲科隱孢子蟲屬。主要寄生于動物的腸上皮細胞，可引起隱孢子蟲病。隱孢子蟲卵囊是其感染階段，卵囊圓形或橢圓形，直徑4μm～6μm，囊壁光滑、無色，一個卵囊中含有4個子孢子。目前共鑒定出9個隱孢子蟲種可以感染非人靈長類動物。其中，微小隱孢子蟲（C.p和安氏隱孢子蟲（C.andersoni）感染較普遍。3.2巢式PCRNestedpolymerasechainreaction利用2套引物，對靶細胞基因2次識別并進行2輪擴增的方法。它可從極少量的模板中獲得較高濃度和純度的靶片段，第1次擴增反應的產(chǎn)物被用作第2次PCR的模板，而第2次反應的寡核苷酸引物對位于第1對引物內(nèi)側(cè)。2DB53/TXXXX—20214縮略語下列縮略語適用于本文件。bp：堿基對BasepairdNTPs：脫氧核苷三磷酸混合液DeoxyribonucleosidetriphosphatesmixtureDNA：脫氧核糖核酸DeoxyribonucleicacidPCR：聚合酶鏈式反應PolymerasechainreactionTAE：Tris-乙酸電泳緩沖液Trisacetate-EDTAbufferBLAST：基于局部序列比對算法的搜索工具Basiclocalalignmentsearchtool5試驗原理隱孢子蟲卵囊沒有孢子囊，有4個子孢子，該形態(tài)特征與其他孢子蟲的卵囊明顯不同。依據(jù)該特征可進行隱孢子蟲的形態(tài)分類學鑒定。對于形態(tài)學鑒定存疑的物種，采用分子生物學方法進一步確定。6試驗條件6.1實驗室通用要求實驗室應滿足GB19489中生物安全實驗室的要求。6.2采樣人員要求采樣人員應為與動物保護相關(guān)的專業(yè)技術(shù)人員。采樣過程中的生物安全要求應符合GB/T27401的要7儀器設(shè)備和試劑7.1儀器設(shè)備7.1.1微量移液器：10μL、50μL、200μL、1000μL，微量移液器槍頭若干。7.1.2振蕩器。7.1.3正置光學顯微鏡。7.1.4載玻片及蓋玻片若干。7.1.5落地式低速離心機：3000r/min。7.1.6玻璃棒、接種環(huán)、燒杯（或塑料杯）、金屬篩（40目）、離心管。7.1.7電子天平：感量為0.001g。7.1.8高速臺式離心機：12000r/min。7.1.10PCR擴增儀。7.1.11電泳系統(tǒng)。7.1.12微波爐。7.1.13凝膠成像系統(tǒng)。7.2試劑3DB53/TXXXX—20217.2.1商品化DNA提取試劑盒。7.2.2商品化PCR分子擴增使用試劑，包含有dNTP、10×buffer(mg2+free)、Mg2+、rTaq酶。7.2.3DL2000DNAMarker。7.2.4瓊脂糖粉。7.2.5電泳緩沖液。7.2.6商品化核酸染料。7.2.76倍上樣緩沖液（6×LoadingBuffer）。7.2.8引物：基于隱孢子蟲核糖體小亞基RNA基因（SSUrRNA）設(shè)計引物。7.2.9飽和蔗糖水溶液：蔗糖1280g，蒸餾水1000mL，5%石碳酸21mL。7.2.10抗酸染色液：石炭酸復紅染色液（第一液堿性復紅4g，95％酒精20mL，5％石炭酸8mL，蒸餾水100mL；10％硫酸溶液（第二液純硫酸10mL，蒸餾水90mL（邊攪拌邊將硫酸徐徐傾入水中20g/L孔雀綠液（第三液20g/L孔雀綠原液1mL，蒸餾水10mL。7.2.112.5%重鉻酸鉀溶液：重鉻酸鉀2.5g，加蒸餾水定容至100mL。8樣品8.1采樣要求8.1.1采樣前，準備好采樣用具，如記錄表格、一次性PE手套、封口袋、樣品管、鑷子、酒精噴壺、記號筆、鉛筆、標簽紙等。8.1.2采樣人員應規(guī)范穿戴全套個人衛(wèi)生安全防護裝備做好自我防護。與樣品直接接觸的器具均應提前做滅菌處理以防樣品被污染。應準備垃圾袋帶回采樣過程中產(chǎn)生的所有廢棄物品。8.1.3采樣完成后，所使用的器械、容器、個人防護用品以及廢棄物等做無害化處理，防止環(huán)境污染和造成疫病傳播。8.2糞樣的選取原則8.2.1應采集滇金絲猴新鮮糞樣，采集同一堆糞作為同一份樣品，分裝兩管。以滇金絲猴糞樣表面的完整程度、濕度顏色以及氣味等條件判斷滇金絲猴糞樣的新鮮程度。8.2.2如遇到滇金絲猴母幼糞樣，應分開采集；依據(jù)母猴和幼猴的糞便大小有明顯差異作出判斷，并在備注欄記錄。8.3采樣程序8.3.1采集糞樣時，應佩戴一次性PE手套。每次采樣后更換新的PE手套，以避免樣品間的交叉污染。8.3.2采集時，直接分離新鮮糞樣的表層部分和內(nèi)部部分，分別裝入樣品管，貼上樣品標簽紙，寫上樣品編號，并做好樣品標記和采樣記錄。將樣品管放入自封袋，密封保存。8.3.3同一堆糞便應盡量多取樣品。8.3.4填寫《滇金絲猴糞樣采集記錄表》，見附錄A中表A.1，記錄好采樣信息。8.4樣品的保存與運輸樣品分兩份保存，一份冷藏或冷凍保存，一份置于裝有2.5%重鉻酸鉀的樣品管中保存，48h內(nèi)低溫運輸送到相關(guān)實驗室4℃保存，進行試驗。9試驗步驟4DB53/TXXXX—20219.1形態(tài)學檢測9.1.1飽和蔗糖溶液漂浮法取備檢糞樣5g～10g，放在燒杯（或塑料杯）內(nèi),加入自來水30mL，使用玻璃棒攪拌均勻，將糞水混合物緩慢倒入40目金屬篩中過濾入另一個燒杯（或塑料杯）內(nèi)，取濾液10mL置于15mL的干燥離心管內(nèi)，3000r/min離心3min，緩慢傾去上清液，保留沉淀物，向沉渣中加入10mL飽和蔗糖溶液，攪拌混勻，3000r/min離心5min，使用接種環(huán)蘸取表面液膜，點樣于載玻片上，加蓋玻片，鏡檢。9.1.2改良抗酸染色法取經(jīng)上述方法獲得的上清液，3000r/min離心3min后取沉淀10μL滴于載玻片上，涂片面積適當且均勻，將糞膜置于空氣中干燥；滴加3～4滴甲醇于糞膜上，自然干燥后準備進行染色。滴加3～4滴抗酸染色液第1液在糞膜上，靜止5min，用蒸餾水緩慢沖洗；逐滴滴加抗酸染色液第2液，脫色5min～載玻片上樣品呈粉色，用蒸餾水緩慢沖洗；滴加抗酸染色液第3液，復染1min后再沖洗，待自然干燥后滴加適量石蠟油；置油鏡下觀察。9.2巢式PCR檢測9.2.1樣品的制備及DNA提取將之前收集好的糞樣取出，用商品化的糞樣DNA提取試劑盒進行DNA提取。樣品的DNA提取具體步驟按照檢測時所用的商品化DNA提取試劑盒說明書進行。9.2.2DNA的保存1周內(nèi)使用的DNA，可將裝有DNA的離心管保存于4℃冰箱中。長期保存的DNA應保存于-20℃冰箱中。9.2.3巢式PCR擴增9.2.3.1巢式PCR擴增引物基于隱孢子蟲核糖體小亞基RNA基因設(shè)計2對引物，引物序列見附錄B中表B.1。9.2.3.2巢式PCR擴增體系巢式PCR擴增體系見附錄B中表B.2。9.2.3.3巢式PCR反應程序樣品DNA在PCR儀上進行巢式PCR擴增的反應程序分為兩步進行，同時設(shè)置陽性對照和陰性對照：——第1步反應程序如下：94℃預變性5min，94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循環(huán)35次，然后72℃作用10min，4℃存放；——第2步反應程序如下：94℃預變性5min，94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，循環(huán)35次，然后72℃作用10min，4℃存放。9.2.3.4巢式PCR產(chǎn)物檢測巢式PCR擴增完成后，取5μL第2輪PCR產(chǎn)物與1μL6×LoadingBuffer混合均勻，加入1%瓊脂糖凝膠孔中，以DL2000Marker作為參照，110V電壓電泳30min。將凝膠取出放入紫外凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察并拍照。5DB53/TXXXX—20219.2.3.5PCR產(chǎn)物測序及分析經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后陽性對照、陰性對照結(jié)果成立，第2輪PCR產(chǎn)物出現(xiàn)大小為830bp左右的目的條帶，見附錄B中圖B.1，將PCR產(chǎn)物送專業(yè)機構(gòu)測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST在線比對分析。10試驗數(shù)據(jù)處理10.1形態(tài)學檢測結(jié)果隱孢子蟲無孢子囊，一個卵囊有4個子孢子，其卵囊透明無色，呈圓形或橢圓形，直徑4μm~6μm，囊壁光滑無色，可見內(nèi)有一小暗點或呈淡黃色的子孢子。經(jīng)染色后，油鏡下觀察隱孢子蟲卵囊為玫瑰紅色，子孢子呈月牙形，有4個。10.2巢式PCR檢測結(jié)果待測序列與GenBank中已有的不同種屬隱孢子蟲蟲種進行比較，根據(jù)比對結(jié)果可直接得出是微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲或其他種屬感染，最終鑒定蟲種。6DB53/TXXXX—2021（規(guī)范性）糞樣的采集信息表滇金絲猴糞樣采集記錄表見表A.1。表A.1滇金絲猴糞樣采集記錄表B7DB53/TXXXX—2021（規(guī)范性）巢式PCR反應B.1總則可使用多種酶進行巢式PCR擴增，本文件使用的是rTaq酶，根據(jù)此酶制定反應體系、反應時間以及最適退火溫度。B.2巢式PCR反應引物兩步法巢式PCR，引物序列見表B.1。