限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用

限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用病毒免疫室編輯ppt限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)30多年前，當(dāng)人們在對噬菌體的宿主特異性的限制-修飾現(xiàn)象進(jìn)行研究時，首次發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶。細(xì)菌可以抵御新病毒的入侵，而這種“限制〞病毒生存的方法那么可歸功于細(xì)胞內(nèi)部可摧毀外源DNA的限制性內(nèi)切酶。這些酶可在特定位點切開DNA，產(chǎn)生可體外連接的基因片段。研究者很快發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶是研究基因組成、功能及表達(dá)非常有用的工具。當(dāng)限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用在上世紀(jì)七十年代流傳開來的時候，以NEB為代表的許多公司尋找更多的限制性內(nèi)切酶編輯ppt限制性內(nèi)切酶的特點限制性內(nèi)切酶的形式多樣，從大小上來說，它們可以小到如PvuII〔157個氨基酸〕，也可以比1250個氨基酸的CjeI更大除了某些病毒以外，限制性內(nèi)切酶只在原核生物中被發(fā)現(xiàn)在已純化分類的3000種限制性內(nèi)切酶中，已發(fā)現(xiàn)了超過250種的特異識別序列。編輯ppt限制性內(nèi)切酶的主要功能

保護(hù)細(xì)菌不受噬菌體的感染，這一觀點已被人們廣泛接受。它們作為微生物免疫機(jī)制的一局部行使其功能。當(dāng)一個沒有限制性內(nèi)切酶的細(xì)菌被病毒感染時，大局部病毒顆粒都能成功地進(jìn)行感染。然而一個有限制性內(nèi)切酶的同種細(xì)菌被成功感染的比率顯著下降。出現(xiàn)更多的限制性內(nèi)切酶將會起到多重保護(hù)作用；而一個擁有4到5種各自獨立的限制性內(nèi)切酶將會使細(xì)胞堅不可摧。

編輯ppt限制性內(nèi)切酶常常伴隨一到兩種修飾酶〔甲基化酶〕出現(xiàn)。后者的作用是保護(hù)細(xì)胞自身的DNA不被限制性內(nèi)切酶破壞限制性內(nèi)切酶和它的"伙伴"--甲基化酶一起就構(gòu)成了限制-修飾〔R-M〕系統(tǒng)。在一些R-M系統(tǒng)中，限制性內(nèi)切酶和修飾酶是兩種不同的蛋白，它們各自獨立行使自己的功能；而在另一些系統(tǒng)中，兩種功能由同一種限制-修飾酶的不同亞基，或是同一亞基的不同結(jié)構(gòu)域來執(zhí)行編輯ppt限制性內(nèi)切酶的命名限制性內(nèi)切酶命名的次序如下：A〕用3個字母代表來源的生物〔如Bam代表Bacillusamyloliquefaciens〕B〕1個字母或阿拉伯?dāng)?shù)字代表菌株〔BamH〕C〕1個羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序〔BamHI〕編輯ppt限制性內(nèi)切酶的分類按照亞基組成、酶切位置、識別位點、輔助因子等因素劃分為三大類

I型限制性內(nèi)切酶是一類兼有限制性內(nèi)切酶和修飾酶活性的多個亞基的蛋白復(fù)合體。它們在識別位點很遠(yuǎn)的地方任意切割DNA鏈。盡管I型酶在生化研究中很有意義，但由于不產(chǎn)生確定的限制片段和明確的電泳條帶，因而不具備實用性。編輯ppt限制性內(nèi)切酶的分類II型酶在其識別位點之中或臨近確實定位點特異地切開DNA鏈。它們產(chǎn)生確定的限制片段和跑膠條帶，因此是三類限制性內(nèi)切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一類。II型限制性內(nèi)切酶由一群性狀和來源都不盡相同的蛋白組成，因而任意一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列可能與另一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列截然不同。實際上，從的情況上看，這些酶很可能是在進(jìn)化過程中各自獨立產(chǎn)生的，而非來源于同一個祖先。編輯ppt限制性內(nèi)切酶的分類

III型限制性內(nèi)切酶也是兼有限制-修飾兩種功能的酶。它們在識別位點之外切開DNA鏈，并且要求識別位點是反向重復(fù)序列；它們很少能產(chǎn)生確定的切割片段，因而不具備實用價值，也沒有人將其商業(yè)化。編輯pptII型限制性內(nèi)切酶的分類〔一〕內(nèi)切酶中最普遍的是象HhaI、HindIII和NotI這樣在識別序列中進(jìn)行切割的酶。這一類酶是構(gòu)成商業(yè)化酶的主要局部。大局部這類酶都以同二聚體的形式結(jié)合到DNA上，因而識別的是對稱序列；但有極少的酶作為單聚體結(jié)合到DNA上，識別非對稱序列。一些酶識別連續(xù)的序列〔如EcoRI識別GAATTC〕；而另一些識別不連續(xù)的序列〔如BglI識別GCCNNNNNGGC〕。限制性內(nèi)切酶的切割后產(chǎn)生一個3‘羥基端和一個5’磷酸基團(tuán)。它們的活性要求鎂離子的存在，而相應(yīng)的修飾酶那么需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。這些酶一般都比較小，亞基一般都在200-300個氨基酸左右。編輯pptII型限制性內(nèi)切酶的分類〔二〕IIS型酶，比方FokI和AlwI，它們在識別位點之外切開DNA。這些酶的大小居中，約為400-650個氨基酸左右；它們識別連續(xù)的非對稱序列，有一個結(jié)合識別位點的域和一個專門切割DNA的功能域。一般認(rèn)為這些酶主要以單體的形式結(jié)合到DNA上，但與臨近的酶結(jié)合成二聚體，協(xié)同切開DNA鏈。因此一些IIS型的酶在切割有多個識別位點的DNA分子時，活性可能更高。編輯pptII型限制性內(nèi)切酶的分類〔三〕第三種II型限制性內(nèi)切酶〔有時也被稱為IV型限制性內(nèi)切酶〕是一類較大的、集限制和修飾功能于一體的酶，通常由850-1250個堿基組成，在同一條多肽鏈上同時具有限制和修飾酶活性。有些酶識別連續(xù)序列，并在識別位點的一端切開DNA鏈；而另一些酶識別不連續(xù)的序列〔如BcgI：CGANNNNNNTGC〕，并在識別位點的兩端切開DNA鏈，產(chǎn)生一小段含識別序列的片段。這些酶的氨基酸序列各不相同，但其結(jié)構(gòu)組成是一致的。他們在N端有一個負(fù)責(zé)切開DNA的功能域，這個域又與DNA修飾域連接；此外還有一到兩個識別特異DNA序列的功能域構(gòu)成C端，或以獨立的亞基形式存在。當(dāng)這些酶與底物結(jié)合時，它們或行使限制性內(nèi)切酶的功能切開底物，或作為修飾酶將其甲基化。編輯ppt一些概念粘末端和平末端同尾酶同裂酶同識異切酶消化星號活力編輯ppt同裂酶：有時兩種限制性內(nèi)切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，其差異只在于當(dāng)識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種那么不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的識別順序都是5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，那么只有HpaⅡ能夠切割。這些有相同切點的酶稱為同裂酶〔同切酶或異源同工酶〕。

同裂酶和同尾酶：編輯ppt有時兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶，可以通過DNA連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點將被破壞，有時可能會產(chǎn)生一個新的酶切位點。如XbaⅠ(T`CTAGA)、NheⅠ(G`CTAGC〕、SpeⅠ(A`CTAGT)切割的DNA序列不同，但均給出相同的“CTAG〞粘性末端。這些粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個新的4核苷酸的酶切位點，即BfaⅠ〔C`TAG)的酶切位點。同尾酶：編輯ppt限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用克隆〔有時與甲基化酶聯(lián)用〕鑒定〔基因片斷大小、正反向〕檢測突變〔識別位點，限制酶切圖譜的多態(tài)性〕制作Marker編輯ppt編輯ppt單酶切與雙酶切的選擇策略運(yùn)用載體的限制載體的自身環(huán)化〔挑選陽性克隆的工作量〕克隆的方向〔鑒定〕編輯pptInsertEcoR1Xho11.9kb質(zhì)粒編輯ppt該實驗用質(zhì)粒pCMV-Myc-T10經(jīng)EcoRⅠ單酶切后應(yīng)為5.7kb；用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后應(yīng)產(chǎn)生兩條DNA片段，一條是3.8kb，另一條是1.9kb〔如以以下圖〕。3.06.0EcoRIEcoRI&XhoIDNAMarker2.03.81.95.7編輯ppt

限制性片段長度多態(tài)性RFLPs(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)1987年，第一張較完整的人基因連鎖圖，500多個RELP位點，定位了Huntington病，CF〔囊性纖維化〕和癌相關(guān)基因〔APC，DCC等〕編輯pptRFLP在遺傳病檢測中的應(yīng)用鐮狀細(xì)胞貧血癥〔globin，6〕，其GAGGTG的突變，可用RFLP〔MstII，CCTNAGG〕或PCR-SSCP檢出。甲型血友病〔FVIII－，XR〕可用PCR-RFLP檢出。142bp99bp編輯ppt引起鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥的原因就是基因的點突變，即編碼血紅蛋白β肽鏈上一個決定谷氨酸的密碼子GAA變成了GUA，使得β肽鏈上的谷氨酸變成了纈氨酸，引起血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了根本的改變。β肽鏈基因上單個核苷酸的替換A→U恰好使該根本片段喪失了可被MstII或CvnⅠ切開的一個限制性內(nèi)切酶位點。由于基因突變改變了限制性酶切的結(jié)果，用Southernblot分析方法和限制性片段長度多態(tài)性〔簡稱RFLP〕分析方法即可對鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥胎兒做產(chǎn)前診斷，或?qū)Πl(fā)病家族成員的基因組型進(jìn)行分析。編輯ppt編輯ppt0.5μg的1kbDNALadder0.8%TAE瓊脂糖凝膠，EB染色

編輯ppt數(shù)據(jù)庫限制性內(nèi)切酶的數(shù)據(jù)庫rebase.neb/rebase其中含有的所有限制性內(nèi)切酶的完整表，包括識別的序列，甲基化的敏感性，商業(yè)信息和參考文獻(xiàn)。編輯ppt應(yīng)用中的注意點1、建立一個標(biāo)準(zhǔn)的酶切反響目前大多數(shù)研究者遵循一條規(guī)那么，即10個單位的內(nèi)切酶可以切割1μg不同來源和純度的DNA。通常，一個50μl的反響體系中，1μl的酶在1XBuffer終濃度及相應(yīng)溫度條件下反響1小時即可降解1μg已純化好的DNA。如果參加更多的酶，那么可相應(yīng)縮短反響時間；如果減少酶的用量，對許多酶來說，相應(yīng)延長反響時間〔不超過16小時〕也可完全反響。一般說來，線性DNA比超螺旋DNA更易消化。比方，酶切1uglambdaDNA，需要1-2單位的酶，而酶切1ug質(zhì)粒DNA，需要3-5單位的酶。編輯ppt2、選擇正確的酶不言而喻，選擇的酶在底物DNA上必須至少有一個相應(yīng)的識別位點。識別堿基數(shù)目少的酶比堿基數(shù)目多的酶更頻繁地切割底物。假設(shè)一個GC含量50%的DNA鏈，一個識別4個堿基的酶將平均在每44〔256〕個堿基中切割一次；而一個識別6個堿基的酶將平均在每46〔4096〕堿基切割一次。內(nèi)切酶的產(chǎn)物可以是粘端的〔3'或5'突出端〕，也可以是平端的片段。粘端產(chǎn)物可以與相容的其它內(nèi)切酶產(chǎn)物連接，而所有的平端產(chǎn)物都可以互相連接編輯ppt3、加酶內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應(yīng)當(dāng)立即置于冰上。酶應(yīng)當(dāng)是最后一個被參加到反響體系中〔在參加酶之前所有的其它反響物都應(yīng)當(dāng)已經(jīng)加好并已預(yù)混合〕。酶的用量視在底物上的切割頻率而定。編輯ppt4、DNA待切割的DNA應(yīng)當(dāng)已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污劑或過多鹽離子的污染，以免干擾酶的活性。DNA的甲基化也應(yīng)該是酶切要考慮到的因素編輯ppt5、緩沖液對于每一種酶都提供相應(yīng)的最正確緩沖液，可保證酶活性。使用時的緩沖液濃度應(yīng)為1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以實現(xiàn)最正確活性。不需要BSA的酶如果加了BSA也不會受太大影響編輯ppt6、反響體積內(nèi)切酶活力單位的定義是：1小時內(nèi)，50μl反響體積中，降解1μg的底物DNA所需的酶為一個活力單位。因此酶：DNA的反響比例可以由此確定。較小的反響體積更容易受到移液器誤差的影響。為了將甘油的濃度控制在5%以下，要注意酶的體積不要超過總體積的10%〔一般酶都貯存于50%的甘油中〕編輯ppt7、混合這是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反響完全，必須使反響液充分混合。我們推薦用槍反復(fù)吸取混合，或是用手指輕彈管壁混合，然后再快速離心一下即可。注意：不可振蕩！編輯ppt8、反響溫度大局部酶的反響溫度為37℃；從嗜熱菌中別離出來的內(nèi)切酶那么要求更高的溫度。一般為50-65℃不等編輯ppt9、反響時間1酶活單位的定義時間為1小時。如果參加的酶較多，可以相應(yīng)地縮短反響時間；反之，如果參加的酶量較少，也可以延長時間以使反響到達(dá)完全編輯ppt10、終止反響如果不進(jìn)行下一步酶切反響，可用終止液來終止反響。在NEB我們使用如下反響終止液：50%的甘油，50mMEDTA〔pH8.0〕，和0.05%溴酚藍(lán)〔10μl/50μl反響液〕。如果要進(jìn)行下一步酶切反響，可用熱失活法終止反響〔65℃或85℃，20分鐘〕。熱失活并不能適用于所有的酶。此外，酚/氯仿抽提也可以用于終止反響。編輯ppt11、貯存大局部酶應(yīng)貯存于-20℃。少局部酶那么須在-70℃長期保存。10XBUFFER和100XBSA于-20℃保存。BSA不能與NEBuffer混合后保存，否那么將會出現(xiàn)BSA沉淀編輯ppt12、穩(wěn)定性每隔1-2個月都會對所有的酶有一個活性檢測；最近的一次檢測結(jié)果將被貼在售出的每一管酶上。大局部酶在推薦的保存緩沖液里在-20℃條件下十分穩(wěn)定。高于-20℃條件下穩(wěn)定性將有所降低編輯ppt13、對照反響如果發(fā)現(xiàn)DNA底物不能被成功切開，可以進(jìn)行對照實驗以查明原因。具體方法如下：將不加內(nèi)切酶的底物DNA〔待切底物〕與參加了內(nèi)切酶的對照DNA〔有多個酶切位點〕同時進(jìn)行反響。假設(shè)實驗結(jié)果說明底物DNA降解，那么說明DNA在純化過程中或反響液里引入了核酸酶污染；假設(shè)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物DNA保持完整，而對照DNA被成功切開，那么可以排除酶質(zhì)量的原因，此時可以將對照DNA和待切底物DNA混合起來再次進(jìn)行反響，以確定樣品中是否有抑制劑。如果有抑制劑存在〔