實(shí)驗(yàn)三-對(duì)流免疫電泳課件

實(shí)驗(yàn)三

對(duì)流免疫電泳1可編輯課件PPT

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

掌握對(duì)流免疫電泳的原理、操作方法、結(jié)果判定及了解其用途。2可編輯課件PPT【實(shí)驗(yàn)原理】帶電膠體顆粒可在電場(chǎng)中定向移動(dòng)，移動(dòng)速度及方向與顆粒所帶電荷及分子量大小有關(guān)。蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，每種蛋白質(zhì)都有自己的等電點(diǎn)，在pH值大于其等電點(diǎn)的溶液中，羧基解離多，蛋白質(zhì)帶負(fù)電，向正極泳動(dòng)；在pH值小于其等電點(diǎn)的溶液中，氨基解離多，蛋白質(zhì)帶正電，向負(fù)極泳動(dòng)。pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，所帶電荷越多，泳動(dòng)速度也越快。因此，可通過控制溶液的pH值的方法，使抗原抗體在通電的瓊脂板上泳動(dòng)，進(jìn)行抗原抗體成分的分析，或進(jìn)行抗原抗體的檢測(cè)。3可編輯課件PPT

電泳緩沖液pH為8.6，在這種溶液中：抗原分子羧基解離帶負(fù)電荷，且分子量小，泳動(dòng)速度快，能克服瓊脂中的電滲阻力，故在電泳時(shí)從負(fù)極向正極移動(dòng)?？贵w屬球蛋白，所暴露的極性基團(tuán)較少，在堿性緩沖液電離也少，只帶微弱的負(fù)電荷，且相對(duì)分子質(zhì)量較大，電泳力較小，泳動(dòng)速度慢，克服不了電滲阻力，在瓊脂電滲力作用下反而由正極向負(fù)極移動(dòng)。將抗體置正極端，抗原置負(fù)極端，則電泳時(shí)抗原抗體相向泳動(dòng)，在兩孔之間相遇，在比例最合適處就會(huì)形成白色沉淀線。4可編輯課件PPT免疫電泳的特點(diǎn)：免疫電泳是由瓊脂擴(kuò)散與電泳結(jié)合而成的一種檢測(cè)技術(shù)。抗原抗體在凝膠中擴(kuò)散的同時(shí)，加入電場(chǎng)力的作用，使抗體或抗原在凝膠中的擴(kuò)散移動(dòng)速度加快，縮短了試驗(yàn)時(shí)間；同時(shí)限制了擴(kuò)散移動(dòng)的方向，使集中朝電泳的方向擴(kuò)散移動(dòng)，增加了試驗(yàn)的敏感性，所以該方法比一般的凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)更快速和靈敏。5可編輯課件PPT【實(shí)驗(yàn)材料】

1、電泳緩沖液0.05M∕LpH8.6巴比妥緩沖液。

2、抗體羊抗人的IgG血清。

3、抗原人的IgG。

4、1％瓊脂用pH8.6巴比妥緩沖液配置，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

5、儀器電泳儀、電泳槽6、器械載玻片、打孔器、10ml吸管、移液器、移液頭。6可編輯課件PPT7可編輯課件PPT8可編輯課件PPT【實(shí)驗(yàn)方法】1、1.0％瓊脂板制備①取pH8.6巴比妥緩沖液100ml置于搪瓷缸中，加入1g瓊脂粉，加熱至完全溶解，冰箱保存?zhèn)溆?。②加熱熔?.0％瓊脂，待冷卻至50～60℃時(shí)，用10mL吸管吸取6mL加于載玻片上。2、打孔在凝固后的瓊脂板上，用打孔器打兩排孔，孔間距為4mm。AbAgAbAg標(biāo)記孔沉淀線9可編輯課件PPT3、加樣將抗原加入瓊脂板上有標(biāo)記孔側(cè)的小孔中，抗體加入另一側(cè)小孔中，以加滿為度，不可溢出孔外。4、電泳將加好樣品的瓊脂板置電泳槽上，抗原側(cè)置負(fù)極端，抗體孔側(cè)置正極端。搭好橋后，接通電源，控制電壓6～10V/cm板長(zhǎng)，電泳約30～60min。5、關(guān)閉電源，取出瓊脂板，觀察結(jié)果。

10可編輯課件PPT【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】將玻片對(duì)著光源，觀察抗原孔與抗體孔之間是否也有沉淀線出現(xiàn)，如有沉淀線，則表示陽性，否則為陰性。11可編輯課件PPT12可編輯課件PPT【注意事項(xiàng)】電泳時(shí)電流不宜過大，以免蛋白變性?？乖涂贵w的電極方向不能搞錯(cuò)。抗原和抗體的濃度要適當(dāng)，抗原太濃或太稀都不易出現(xiàn)沉淀線。電泳所需時(shí)間與孔間距離有關(guān)，距離越大，電泳時(shí)間越長(zhǎng)。瓊脂的質(zhì)量要好（選用進(jìn)口或者進(jìn)口分裝），否則不易出現(xiàn)結(jié)果，也可選用瓊脂糖。瓊脂的濃度不宜太高（1％～2％），應(yīng)以容易挑出孔內(nèi)瓊脂為宜。13可編輯課件PPT【思考題】1、對(duì)流免疫電泳有何特點(diǎn)？2、對(duì)流免疫電泳中，抗原