第五章 動(dòng)物細(xì)胞染色體工程

下篇：動(dòng)物細(xì)胞工程實(shí)踐之Ⅱ第五章動(dòng)物細(xì)胞染色體工程本章主要內(nèi)容5.1自然界的多倍表達(dá)象多倍體、體細(xì)胞多倍體及由配子形成的多倍體、多倍體分類5.2人工誘導(dǎo)多倍體動(dòng)物***人工誘導(dǎo)多倍體的機(jī)制、誘導(dǎo)多倍體動(dòng)物的方法5.3單性生殖與人工誘導(dǎo)雌、雄核發(fā)育***高等動(dòng)物的單性生殖、卵母細(xì)胞孤雌激活的機(jī)理、Hertwig效應(yīng)5.4動(dòng)物染色體結(jié)構(gòu)的改造5.5人工染色體酵母人工染色體、細(xì)菌人工染色體、哺乳類人工染色體理論根底：細(xì)胞遺傳學(xué)植物(Plant)物種染色體數(shù)目〔2n=〕人46小白鼠40非洲爪蟾36蛙26果蠅8線蟲2家蠶56豬38馬64牛60綿羊54雞78物種染色體數(shù)目〔2n=〕擬南芥10水稻24普通小麥42大麥14玉米20煙草48陸地棉52大豆40西瓜22動(dòng)植物染色體數(shù)動(dòng)物〔Animal〕2個(gè)5.1自然界的多倍表達(dá)象(1)多倍體〔Polyploid〕--指?jìng)€(gè)體每個(gè)細(xì)胞中含有3個(gè)或3個(gè)以上的染色體組〔genome〕染色體組：指配子中所包含的染色體或基因的總和。單倍體：體細(xì)胞中含有本物種配子的染色體數(shù)目的個(gè)體。根據(jù)細(xì)胞中染色體組數(shù)目的不同稱為三倍體(tripliod)、四倍體〔tetrapliod〕、五倍體〔pentapliod〕等。5.1.1概念為什么植物中多倍體較多、動(dòng)物中較少？--是進(jìn)化的結(jié)果，是生活方式的反響。---植物:固著為生，必須耐受極端環(huán)境的改變，染色體多能增加遺傳的表型易變性。---動(dòng)物:可動(dòng)，能避開惡劣環(huán)境生存。多倍體多見于高等植物,如小麥、棉花、煙草、蘋果、梨等，動(dòng)物少見。(2)動(dòng)物中的天然多倍體早先以為幾乎所有動(dòng)物都是二倍體。在20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)一種美洲角蛙是四倍體。之后,在低等脊椎動(dòng)物包括魚類、兩棲類和爬行類中也有發(fā)現(xiàn)；魚類多倍體相對(duì)較多，虹鱒、鯉魚、泥鰍和鯽魚(Carassiusauratus)等就是天然多倍體。在人類也發(fā)現(xiàn)有三倍體。人類三倍體問題

有人曾報(bào)道了230例三倍體流產(chǎn)胎兒和33例產(chǎn)后幸存的三倍體嬰兒臨床資料。發(fā)現(xiàn)，三倍體胎兒都是二倍體和三倍體的“嵌合體〞。一例三倍體嬰兒，小頭、并指、遲鈍，血細(xì)胞培養(yǎng)幾乎完全是二倍體，但原皮培養(yǎng)中約92%的細(xì)胞是三倍體，其余8%是二倍體。產(chǎn)生原因：三種情況：2個(gè)精子入卵〔占66.4%〕；二倍體精子與單倍體的卵受精〔減數(shù)分裂過程中染色體未別離〔占23.6%〕；二倍體的卵與單倍體的精子受精〔10%〕。(3)體細(xì)胞多倍體、配子多倍體①體細(xì)胞形成多倍體原因:其一,成體體細(xì)胞在有絲分裂的過程中，染色體完成了復(fù)制，著絲點(diǎn)已分裂，但細(xì)胞受到外界環(huán)境條件(如溫度驟變)或生物體內(nèi)部因素的干擾，紡錘體形成受到破壞，以致染色體未被拉向兩極，形成的染色體數(shù)目增加。如果這樣的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行正常的有絲分裂，就發(fā)育成染色體數(shù)目加倍的組織。第二,受精卵在分裂時(shí)，遇到特殊環(huán)境，會(huì)使整套染色體數(shù)目加倍。前者可造成軀體某局部的染色體數(shù)目加倍；后者可使發(fā)育的個(gè)體所有細(xì)胞中的染色體數(shù)目加倍。②由配子形成的多倍體。在配子形成減數(shù)分裂過程中，染色體沒有減半，就會(huì)產(chǎn)生染色體數(shù)目加倍的配子。染色體數(shù)目加倍的配子在受精以后會(huì)發(fā)育成多倍體。因此，多倍體可以發(fā)生在個(gè)體發(fā)育的不同階段：或配子期、或卵裂期、或體細(xì)胞分裂期。①同源多倍體:--系指來源于同一個(gè)物種的二倍體以上的個(gè)體。成因：第一，有絲分裂異常。體細(xì)胞：在有絲分裂過程中染色體分裂而細(xì)胞不分裂，使“2n〞變成“4n〞。第二，減數(shù)分裂異常。配子：性細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中染色體未發(fā)生別離，形成的配子仍是二倍體。如果2nX2n→4n；如果2nX1n→3n。②異源多倍體：---系指來源于不同的種間或?qū)匍g物種雜交產(chǎn)生的染色體數(shù)大于二倍體的個(gè)體。--成因：先通過種間或遠(yuǎn)緣雜交，再經(jīng)染色體加倍而產(chǎn)生異源多倍體。(4)多倍體分類③異倍體/非整倍體--指某一個(gè)體在完整的正常染色體中缺失或額外增加個(gè)別染色體。如果配子第一次減數(shù)分裂不正常，第二次減數(shù)分裂正常，那么某對(duì)同源染色體就會(huì)不別離而同時(shí)進(jìn)入一極。導(dǎo)致另一極中一個(gè)配子缺少一條同源染色體，從而形成n+1和n-1兩種配子。如果第一次減數(shù)分裂正常，而在第二次減數(shù)分裂異常時(shí)，就會(huì)形成n+1、n-1和n三種配子。相互受精結(jié)果：♂〔n-1〕X♀〔n〕→個(gè)體〔2n-1〕；♂〔n+1〕X♀〔n〕→個(gè)體〔2n+1〕；♂〔n+1〕X♀〔n+1〕→個(gè)體〔2n+2〕。5.2人工誘導(dǎo)多倍體動(dòng)物5.2.1人工誘導(dǎo)多倍體的機(jī)制(2)抑制第一極體的排放5.2.2誘導(dǎo)多倍體動(dòng)物的方法(1)生物學(xué)方法：主要采用雜交方法，尤其通過種間雜交獲得異源多倍體。劉思陽(yáng)〔1987〕：用草魚〔2n=48〕♀×♂三角魴〔2n=48〕F1〔草魴雜種三倍體3n=72〕[可見，雌性草魚卵子第二極體的排放受到抑制。種間雜交抑制第二極體放出的機(jī)制尚不清楚，而種內(nèi)雜交時(shí)，極少有不排出第二極體的現(xiàn)象發(fā)生]有三種：生物學(xué)方法、物理學(xué)方法、化學(xué)方法(2)物理學(xué)方法①溫度休克法：冷休克法（0～5℃）熱休克法（約30℃）－用略高于或略低于致死溫度的冷或熱休克法誘導(dǎo)形成3n〔抑制第二極體排放〕或抑制第一次卵裂形成4n。優(yōu)點(diǎn)：廉價(jià)、易操作；常用。成功的關(guān)鍵：能否阻止第二極體的排出。需考慮三個(gè)因素：溫度處理的開始時(shí)間〔TA，從受精開始算起〕、第二，處理持續(xù)時(shí)間〔D〕和處理時(shí)的水溫〔T〕。影響因素很多，需要通過生物統(tǒng)計(jì)方法--正交試驗(yàn)、方差分析，以獲得三因素組合的最正確值。②水靜壓法采用較高的水靜壓〔65kg/cm2〕抑制第二極體的排放或抑制受精卵第一次卵裂，產(chǎn)生多倍體。優(yōu)點(diǎn)：誘導(dǎo)率高〔在90%～100%〕，處理時(shí)間短，對(duì)受精卵損傷小，成活率高。缺點(diǎn)：需專用設(shè)備如水壓機(jī)，本錢較高，且處理卵的數(shù)量有限，不適于大規(guī)模生產(chǎn)。③高鹽/高堿法

用高出常量濃度的鹽或堿抑制第二極體的放出或受精卵第一次卵裂，產(chǎn)生三倍體或四倍體。(3)化學(xué)方法5.2.3多倍體倍性鑒定〔直接法、間接法〕(1)測(cè)量核體積。多倍體細(xì)胞及細(xì)胞核比二倍體稍大。魚類，測(cè)量紅血球的核體積之比值方法。2n:3n=1:1.5;2n:4n=1:1.74；(2)蛋白質(zhì)電泳：血清蛋白，只對(duì)特定物種可用。(3)生化成分分析：三倍體具有較二倍體的紅血球數(shù)量少，丙酮激酶活顯著高于二倍體等。(4)染色體計(jì)數(shù)：準(zhǔn)確，但費(fèi)時(shí)。(5)DNA含量測(cè)定：流式細(xì)胞儀〔Flowcytometry〕簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確測(cè)定出單細(xì)胞的DNA含量。5.3單性生殖與人工誘導(dǎo)的雌、雄核發(fā)育在生物的體細(xì)胞中，染色體的數(shù)目不僅可以成倍地增加，還可以成倍地減少。例如，蜜蜂的蜂王和工蜂的體細(xì)胞中有32條染色體〔受精的卵〕；而雄蜂的體細(xì)胞中只有16條染色體〔未受精的卵〕。單倍體：體細(xì)胞中含有本物種配子染色體數(shù)目的個(gè)體叫做單倍體。工蜂蜂王孤雌生殖蜜蜂飛行中婚配最強(qiáng)壯的雄峰與蜂王交尾后死去蜂王獲得終生享用的精子產(chǎn)卵受精卵雄峰（n=16）吃2-3天蜂王漿，經(jīng)21天發(fā)育吃5天蜂王漿經(jīng)16天發(fā)育幼蜂（2n=32）未受精卵圖5-1蜜蜂的生活周期雌蜂〔n=32〕5.3.1人工誘導(dǎo)雌、雄核發(fā)育雌、雄核發(fā)育即單性發(fā)育。是通過人工控制產(chǎn)生的單性種群。意義；純系建立、性別控制、遺傳機(jī)制研究。①“赫特威氏效應(yīng)〞--Hertwig效應(yīng)Hertwig效應(yīng)實(shí)驗(yàn)：②紫外線照射使染色體失活的機(jī)理-Hertwig效應(yīng)原理紫外線與DNA作用時(shí),在同一條多核苷酸鏈內(nèi)相鄰的胸腺嘧啶之間相互聯(lián)結(jié),形成了胸腺嘧啶二聚體(ThymineDimers)，此種二聚體阻止了DNA的復(fù)制,從而導(dǎo)致了精子遺傳物質(zhì)失活。紫外線照射可誘發(fā)突變和切斷染色體,當(dāng)照射量到達(dá)一定值以上,染色體斷片脫落,精核萎縮,授精后雖然雄性原核化,但不能與雌核融合,不能正常發(fā)育。但可以激活雌核發(fā)育〔單倍體〕；如果雌核染色體加倍，就可形成正常二倍體動(dòng)物。〔2〕雄核發(fā)育〔androgenesis)--將經(jīng)紫外線、X射線或γ射線等處理卵子后，與正常精子受精，再在適當(dāng)時(shí)間施以冷、熱、高壓等物理方法處理，使精子染色體加倍與卵子結(jié)合，發(fā)育成完全為父本性狀的二倍體。人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育研究較少。價(jià)值不大。5.3.3哺乳動(dòng)物雌核發(fā)育--卵子的孤雌生殖(1)卵母細(xì)胞孤雌激活類型ABCC2C3圖5-3卵母細(xì)胞的孤雌激活類型AuraniandKaufman19775.4動(dòng)物染色體結(jié)構(gòu)的改造通過染色體片段的刪除和重排，產(chǎn)生攜帶特定染色體區(qū)片段缺失突變的動(dòng)物，有助于在特定的染色體區(qū)實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的基因定位和功能分析。5.4.1染色體片段的刪除和重排〔1〕放射線誘導(dǎo)發(fā)生染色體缺失突變〔2〕Cre2loxP介導(dǎo)染色體重組Cre重組酶是在噬菌體P1中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)38kDa的蛋白質(zhì)，其名稱來源于causerecombination，它能識(shí)別34bp的特異序列〔loxP〕，介導(dǎo)兩個(gè)loxP之間的序列發(fā)生重組，從而將兩個(gè)loxP之間的序列刪除，此過程不需要任何其他輔助因子的幫助。loxP的位置和方向不同，由Cre重組酶介導(dǎo)重組形成的產(chǎn)物亦不相同，導(dǎo)致染色體發(fā)生倒位、刪除和易位等，從而實(shí)現(xiàn)染色體的定點(diǎn)操作?？朔擞梅派渚€誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變不能定位的缺點(diǎn)，已被應(yīng)用于果蠅、哺乳動(dòng)物和植物染色體重組研究。通過小鼠染色體大片段的刪除和重排可以產(chǎn)生一些人為可見的表型。－－主要建立疾病動(dòng)物模型來模擬人類的某些疾病，為研究腫瘤抑制基因的識(shí)別和疾病的治療診斷找到了捷徑。染色體大片段的刪除和重排的意義5.4.2染色體的易位〔translocation〕工程家蠶的性別控制與識(shí)別在實(shí)踐和理論上的都有重要意義。通過建立性別標(biāo)記的限性系統(tǒng)，可提高生產(chǎn)收益。性別標(biāo)記的限性系統(tǒng)是指某一標(biāo)記性狀在雌、雄個(gè)體不同的遺傳系統(tǒng)。雄蠶繭比雌蠶繭出絲率高20%以上，體質(zhì)比雌蠶要強(qiáng)壯。養(yǎng)蠶生產(chǎn)上所用一代雜交種〔大體上是雌、雄各一半〕，如果全是雄蠶，那么既不用增加本錢，又不多費(fèi)勞力就可以增加10%~15%的蠶絲。桑蠶中的W染色體具有決定雌性的絕對(duì)功能。在W染色體上，除有決定雌性的基因外，還沒有發(fā)現(xiàn)能表現(xiàn)其它性狀的基因，但人們可以利用χ、γ等物理射線的照射處理，能使帶有標(biāo)志基因的某個(gè)染色體片段易位到W染色體上，從而獲得好幾種限性遺傳的類型.近些年來，運(yùn)用輻射誘變和染色體工程手段先后培育出有性別標(biāo)記的限性蠶品種。目前生產(chǎn)上可利用的有卵色限性系，斑紋限性系和繭色限性系，卵色限性系已建立了一個(gè)較為完整的系統(tǒng)。圖２ＣＴＰＹИИИＫＯＢ的卵色限性系統(tǒng)

說明：ω２、ｗ3分別為第二白卵基因、第三白卵基因，+ω２、+ω3．分別為ω２、ω3的等位基因〔顯性〕，＋ω２、＋ω3，同時(shí)存在表現(xiàn)黑卵。載有ω２、ｗ3、+ω２、+ω3的是第10染色體。上世紀(jì)70年代ＣＴＰＹИИИＫＯＢ用輻射誘發(fā)了兩個(gè)第10染色體向ω染色體易位的品系，其中一個(gè)在易位的第10染色體片段中含有白卵基因ω3,另一個(gè)含有白卵基因ω２。由于+ω２與+ω3有互補(bǔ)作用，只有同時(shí)存在才表現(xiàn)黑卵，隱性ω２或ω3只要任何一個(gè)成純合型時(shí)，便表現(xiàn)白卵。這種易位雌體各同持有ω２／ω２或ω3／ω3的雄交配，分別得到黑色雌卵與白色雄卵，表現(xiàn)卵色限性遺傳。當(dāng)這兩個(gè)品系互交時(shí)，就得到黑色雄卵和白色雌卵。采用這樣的品種進(jìn)行原種繁育時(shí)，可由光電選卵機(jī)多項(xiàng)選擇黑卵雌蠶飼養(yǎng)，能提高制種能力、降低生產(chǎn)本錢。農(nóng)村養(yǎng)蠶用兩系的正反雜交F可選黑卵雄蠶飼養(yǎng)，以提高出絲率。蠶卵色限性系統(tǒng)5.5人工染色體染色體要確保在細(xì)胞分裂中保持穩(wěn)定，必須要能夠自我復(fù)制和向子細(xì)胞中平均分配，它需要3個(gè)關(guān)鍵序列：其一，自主復(fù)制DNA序列〔autonomouslyreplicatingsequenceARS〕：是DNA復(fù)制的起點(diǎn)，確保染色體能夠開始自我復(fù)制。其二，著絲粒DNA序列〔centromereDNAsequenceCEN〕：確保染色體在細(xì)胞分裂時(shí)能平均分配到子細(xì)胞中。其三，端粒DNA序列〔telomereDNAsequenceTEL〕：使DNA能結(jié)束復(fù)制，確保染色體的獨(dú)立性和穩(wěn)定性。將自主復(fù)制DNA序列、著絲粒DNA序列和端粒DNA序列這3個(gè)關(guān)鍵序列組裝拼接后就得到人造微小染色體〔artificialminichromosome〕。應(yīng)用：在大片段DNA分子的克隆、基因組分析、基因功能鑒定等研究中得到了廣泛的應(yīng)用，具有極為重要的價(jià)值。人造微小染色體的制備與應(yīng)用目前正在研究或應(yīng)用的人工染色體①酵母人工染色體〔yeastartificialchromosomeYAC〕、②細(xì)菌人工染色體〔bacterialartificialchromosomeBAC〕③哺乳動(dòng)物人工染色體〔mammalianartificialchromosomeMAC〕。Fig.5-5人造基因5.5.1酵母人工染色體〔YAC〕1983年，Murray等人首次成功構(gòu)建了包括著絲粒、端粒、復(fù)制子和外源DNA總長(zhǎng)度為55kb的酵母人工染色體。1987年，Burke等人構(gòu)建了能克隆大片段人體DNA分子的載體YAC。證明YAC可用來構(gòu)建高等生物的完整基因組文庫(kù)，克隆容量達(dá)100～1000Kb。圖5-3YAC的構(gòu)建自主復(fù)制序列色氨酸合成基因pYAC〔YAC質(zhì)?！抽L(zhǎng)約8kb，帶有人工染色體所需的一切元件。當(dāng)要用它進(jìn)行克隆時(shí)，先用BamHI和SmaI對(duì)它進(jìn)行雙酶解，回收兩個(gè)臂，然后平末端的外源大片段DNA就可以兩個(gè)臂連接，形成真正意義上的人工染色體。色氨酸合成基因酵母菌著絲粒序列端粒復(fù)制原點(diǎn)酵母人工染色體的構(gòu)建與其他克隆載體的構(gòu)建程序相似：第一，包括大片段DNA的獲??；第二，YAC重組體的構(gòu)建；第三，YAC重組體對(duì)酵母的轉(zhuǎn)化；第四，YAC基因庫(kù)的鑒定；第五，目的基因YAC克隆的篩選；第六，目的基因YAC克隆的鑒定。YAC存在一些缺點(diǎn)：YAC是目前容量最大的載體，但存在一些缺點(diǎn)：--①插入片段大，穩(wěn)定性較差；--②插入的大片段易發(fā)生缺失，使文庫(kù)不完整；--③插入片段易發(fā)生重排，造成序列錯(cuò)誤；--④DNA片段來自兩個(gè)或兩個(gè)以上的染色體，使文庫(kù)中的嵌合現(xiàn)象