DB22-T 3601-2023 人參銹腐病菌分子檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

65.020.20CCS

B

1622 DB22/T

3601—2023人參銹腐病菌分子檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量

PCR法Detection

Ilyonectria

robusta

rusty

root

rot

quantitative

real-time

PCR2023-12-28

發(fā)布 2024-02-01

實(shí)施吉林省市場(chǎng)監(jiān)督管理廳發(fā)

布DB22/T

3601—2023 本文件按照

GB/T

—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第

1

部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由吉林省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)、吉林參王植?？萍加邢薰?。本文件主要起草人：陳長(zhǎng)卿、姜云、高潔、徐懷友、盧寶慧、楊麗娜、姜伊琳。DB22/T

3601—2023

1范圍本文件確立了人參銹腐病菌實(shí)時(shí)熒光定量

分子檢測(cè)方法，給出了實(shí)時(shí)熒光定量

PCR

措施。本文件適用于人參根和土壤中銹腐病菌的實(shí)時(shí)熒光定量

分子檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件文件。GB/T

6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T

28067 甘蔗黃葉病毒實(shí)時(shí)熒光

RT-PCR

檢測(cè)方法3 術(shù)語(yǔ)和定義GB/T

28067

界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。人參銹腐病

root

一種主要由強(qiáng)壯土赤殼菌（Ilyonectria

robusta）侵染人參根部導(dǎo)致的土傳病害。實(shí)時(shí)熒光定量

法

quantitative

real-time

一種在

DNA

擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)定每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。Ct

值 cycle

threshold每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。[來(lái)源：GB/T

28067—2011，2.3]4 原理根據(jù)人參銹腐病強(qiáng)壯土赤殼菌

I.

robusta

組蛋白

Histone

基因的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物進(jìn)行

PCR

擴(kuò)增反應(yīng)。利用熒光信號(hào)伴隨目的

PCR

產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)的原理，收集

PCR

光信號(hào)值。隨著

擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，Ct

值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，根據(jù)

Ct

供試樣品是否含有人參銹腐病強(qiáng)壯土赤殼菌。5 試劑和材料DB22/T

3601—2023通用要求除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。試劑5.2.1

水，GB/T

6682，一級(jí)。5.2.2

植物基因組

DNA

提取試劑盒。5.2.3

土壤總

DNA

提取試劑盒。5.2.4

實(shí)時(shí)熒光定量

試劑盒。引物5.3.1 引物序列5 5上游引物：′-CCGCCGACCTGACCTGACCGTCCGCC-35 55.3.2引物配制引物用水稀釋成

10

μ，

℃

保存?zhèn)溆谩?儀器設(shè)備天平：感量

0.001

g。實(shí)時(shí)熒光定量

/檢測(cè)波長(zhǎng)范圍

nm～750

nmSYBR

Green

升降溫速度≥

℃/s；均一性≤±0.5

℃；準(zhǔn)確性≤±0.3

℃；溫度范圍

4

℃～100

℃。高壓滅菌鍋：

。離心機(jī)：離心轉(zhuǎn)速

rpm

以上。冰箱：4

℃。微量移液器：

μL～

μL，2

μL～20

μL，

μL～200

μL，

μL～1000

μL。核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。恒溫水浴鍋。渦旋振蕩器。粉碎機(jī)。7 樣品對(duì)照樣品7.1.1 陽(yáng)性樣品人參銹腐病強(qiáng)壯土赤殼菌菌絲體

DNA。7.1.2 陰性樣品7.1.2.1 經(jīng)分子檢測(cè)

3

次未檢出強(qiáng)壯土赤殼菌的健康人參根基因組

DNA。7.1.2.2 經(jīng)分子檢測(cè)

3

次未檢出強(qiáng)壯土赤殼菌的土壤總

DNA。7.1.3 空白樣品體積（μ2×SYBR

10.010

0.210

0.2DNA

1.0

DMSO1.07.620.0每

m

人參田塊采用梅花形采樣法，不少于

5

每

m

人參田塊采用梅花形采樣法，不少于

5

點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)取人參根際土壤樣品

50

g，裝入密無(wú)菌一級(jí)水。樣品采集與制備7.2.1 人參采集新鮮人參根，裝入密封袋，置于冰盒中，在實(shí)驗(yàn)室用研磨機(jī)將參根打碎，充分混合，4

℃

保存不超過(guò)

h，也可

℃

長(zhǎng)期保存。7.2.2 土壤2封袋，充分混合，置于冰盒中，4

℃

保存不超過(guò)

h，也可

-80

℃

長(zhǎng)期保存。8 分析步驟基因組

DNA

準(zhǔn)備人參根樣品和土壤樣品，參照基因組

DNA

提取試劑盒說(shuō)明要求提取基因組

DNA。采用核酸蛋白分析儀測(cè)定

DNA

濃度為

ng/μL

～200

ng/μL，A260/A280

比值為

1.8～2.0

之間時(shí)，DNA

模板適宜熒光定量

PCR

擴(kuò)增。用無(wú)菌一級(jí)水將模板

濃度稀釋成

50

μL

用于熒光定量

PCR

擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量

反應(yīng)8.2.1 反應(yīng)體系反應(yīng)體系見(jiàn)表

1。表1 實(shí)時(shí)熒光定量

反應(yīng)體系8.2.2反應(yīng)程序按照商品化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量

反應(yīng)，每個(gè)樣品重復(fù)

3

8.2.3 質(zhì)量控制對(duì)照熒光值的

%，表明反應(yīng)體系工作正常。否則，表明

PCR

反應(yīng)體系不正常，應(yīng)重新進(jìn)行檢測(cè)。DB22/T

3601—20239結(jié)果判定與表述結(jié)果判定在

PCR

反應(yīng)體系正常工作的前提下，Ct