真核表達(dá)系統(tǒng)

真核表達(dá)系統(tǒng)酵母絲狀真菌昆蟲哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物植物反應(yīng)器1可編輯課件PPT酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)遺傳背景清楚（基因組是大腸桿菌的3.5倍）增殖快（90min/代），培養(yǎng)容易，產(chǎn)量較高易于研究突變與基因功能，如構(gòu)建酵母人工染色體等可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾加工提純工藝復(fù)雜，成本高，制品純度達(dá)不到要求，制品免疫原性差，接種劑量大2可編輯課件PPT酵母載體的基本結(jié)構(gòu)DNA復(fù)制起始區(qū)：2μ質(zhì)粒和自主復(fù)制序列選擇標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)缺陷型和顯性選擇（抗藥）整合介導(dǎo)區(qū)：同源重組，決定整合位置和拷貝數(shù)有絲分裂穩(wěn)定區(qū)：幫助載體平均分配表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子終止子分泌信號(hào)序列3可編輯課件PPT酵母表達(dá)系統(tǒng)中載體的種類按載體在酵母中的復(fù)制形式分為：YIp：酵母整合型載體YRp：酵母自主復(fù)制型載體YCp：酵母含著絲粒片段載體YEp：酵母附加體型載體YAC：酵母人工染色體4可編輯課件PPT昆蟲表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒基因組：閉環(huán)雙鏈DNA，88-166kb啟動(dòng)子：桿狀病毒科核多角體病毒的多角蛋白強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（BEVS）家蠶核型多角體病毒-家蠶表達(dá)系統(tǒng)宿主：鱗翅目、膜翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、脈翅目、毛翅目的600多種昆蟲克隆基因方法：轉(zhuǎn)移載體→共轉(zhuǎn)染→同源重組→空斑篩選→純化→重組病毒5可編輯課件PPT桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)容量大：能插入12kb的外源基因高表達(dá)：polh基因啟動(dòng)子是目前所知的最強(qiáng)的真核啟動(dòng)子；產(chǎn)物對(duì)宿主影響?。划a(chǎn)物可結(jié)晶高效：可同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因安全：桿狀病毒對(duì)脊椎動(dòng)物無(wú)病原性具加工修飾功能：昆蟲細(xì)胞較高等家蠶易飼養(yǎng)6可編輯課件PPT哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)表達(dá)系統(tǒng)常用宿主細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞常用載體真核細(xì)胞表達(dá)元件哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移的遺傳標(biāo)記基因表達(dá)的檢測(cè)方法7可編輯課件PPT哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)重組DNA易轉(zhuǎn)染，遺傳穩(wěn)定，可重復(fù)識(shí)別和去除內(nèi)含子進(jìn)行翻譯后修飾磷酸化、糖基化、二硫鍵、寡聚體等的形成、高級(jí)結(jié)構(gòu)的正確折疊產(chǎn)品的構(gòu)型正確率高，可被改造成類人體源性，免疫源性好可分泌至培養(yǎng)基，提純工藝簡(jiǎn)單，成本低可用于基因治療8可編輯課件PPT常用宿主細(xì)胞細(xì)胞名稱來(lái)源已投放產(chǎn)品BHK-21地鼠幼鼠腎凝血Ⅷ因子CHO-K1中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢tPA，Ⅷ因子，EPO，G-CSF等C127小鼠乳腺腫瘤GHMDCK長(zhǎng)耳狗腎臟獸用疫苗NamalwaBurkitt淋巴瘤病人的類淋巴母細(xì)胞EPO，LT，tPA，IFNVero成年非洲綠猴腎HBsAg，GH鼠骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤tPA，抗體COSSV40轉(zhuǎn)化的綠猴腎細(xì)胞CD34，CD69，TGF9可編輯課件PPT真核細(xì)胞表達(dá)元件原核DNA序列啟動(dòng)子增強(qiáng)子拼接信號(hào)終止子和多聚腺苷化信號(hào)篩選標(biāo)記動(dòng)物病毒基因序列10可編輯課件PPT原核DNA序列原核復(fù)制子抗生素抗性基因多克隆位點(diǎn)11可編輯課件PPT啟動(dòng)子真核啟動(dòng)子：RNA聚合酶（Ⅱ）結(jié)合并起動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA序列一般包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及其上游約100-200bp序列，包含有若干具有獨(dú)立功能的DNA序列元件，每個(gè)元件約長(zhǎng)7-30bp核心啟動(dòng)子元件：RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及其上游-25/-30bp處的TATA盒。單獨(dú)起作用時(shí)只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄上游啟動(dòng)子元件包括通常位于-70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)更遠(yuǎn)的上游元件。與相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合改變轉(zhuǎn)錄效率。不同基因具有不同的上游啟動(dòng)子元件組成，其位置也不相同，即不同的基因表達(dá)分別有不同的調(diào)控12可編輯課件PPT哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子

中常見(jiàn)的元件元件名稱共同序列結(jié)合的蛋白因子名稱

分子量

結(jié)合DNA長(zhǎng)度

TATAboxTATAAAATBP30,000~10bpGCboxGGGCGGSP-1105,000~20bpCAATboxGGCCAATCTCTF/NF160,000~22bpOctamerATTTGCATOct-176,000~20bp

Oct-253,000~23bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000~10bpATFGTGACGTAFT?20bp13可編輯課件PPT常用啟動(dòng)子Rous肉瘤啟動(dòng)子（RSV）巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子（CMV）SV40啟動(dòng)子14可編輯課件PPT增強(qiáng)子增強(qiáng)子：是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)約200bp的一段DNA，可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高100倍，其后在多種真核生物、甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)子增強(qiáng)子通常占100-200bp長(zhǎng)度，也和啟動(dòng)子一樣由若干組件構(gòu)成，其基本核心組件常為8-12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在15可編輯課件PPT增強(qiáng)子的作用特點(diǎn)提高同一鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率，可遠(yuǎn)距離起作用，通常距離1-4kb、但遠(yuǎn)至30kb仍能發(fā)揮作用，在基因的上游或下游都能起作用與其序列的正反方向無(wú)關(guān)要有啟動(dòng)子才能發(fā)揮作用。但增強(qiáng)子對(duì)啟動(dòng)子沒(méi)有嚴(yán)格的專一性，同一增強(qiáng)子可以影響不同類型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的作用機(jī)理雖然還不明確，但與其他順式調(diào)控元件一樣，必須與特定的蛋白質(zhì)因子結(jié)合后才能發(fā)揮增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用增強(qiáng)子一般具有組織或細(xì)胞特異性，許多增強(qiáng)子只在某些細(xì)胞或組織中表現(xiàn)活性，是由這些細(xì)胞或組織中具有特異性蛋白質(zhì)因子所決定的16可編輯課件PPT常用增強(qiáng)子LTR：Rous肉瘤病毒基因長(zhǎng)末端重復(fù)序列人類巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子SV40病毒增強(qiáng)子17可編輯課件PPT終止信號(hào)和polyA信號(hào)真核基因轉(zhuǎn)錄的終止信號(hào)與機(jī)制還不明確polyA增加mRNA的的穩(wěn)定性多聚腺苷化所需的兩種序列位于polyA下游GU豐富區(qū)或U豐富區(qū)位于polyA上游11-30bp處的5`-AAUAAASV40polyA信號(hào)18可編輯課件PPT遺傳性標(biāo)記胸苷激酶基因（tk）選擇系統(tǒng)二氫葉酸還原酶基因（dhfr）選擇系統(tǒng)新霉素抗性基因（neo）選擇系統(tǒng)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）選擇系統(tǒng)19可編輯課件PPT胸苷激酶（TK）基因選擇系統(tǒng)TK是核苷酸補(bǔ)救合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶內(nèi)源性缺陷tk的宿主細(xì)胞——小鼠LMTK—細(xì)胞HAT選擇法H：次黃嘌呤；補(bǔ)救合成三種核苷酸的原料A：氨基喋呤；抑制四氫葉酸合成T：胸苷；補(bǔ)救合成dTTP的原料tk—細(xì)胞的鑒別與獲得：5`-溴脫氧核糖尿苷（BUdR）篩選20可編輯課件PPT二氫葉酸還原酶（DHFR）基因選擇系統(tǒng)DHFR：真核細(xì)胞生物合成核苷酸的關(guān)鍵酶，功能是催化二氫葉酸還原成四氫葉酸篩選劑：葉酸類似物——氨基喋呤或氨甲喋呤dhfr—缺陷型細(xì)胞——CHO細(xì)胞正常細(xì)胞可通過(guò)提高氨甲喋呤濃度篩選突變型dhfr基因的導(dǎo)入擴(kuò)大篩選宿主細(xì)胞的范圍21可編輯課件PPT新霉素抗性基因選擇系統(tǒng)新霉素（neo）：即G418，一種氨基糖苷類抗生素，影響80S核糖體功能核蛋白質(zhì)的合成新霉素抗性基因編碼3`-磷酸轉(zhuǎn)移酶降解G418適用于所有的真核細(xì)胞22可編輯課件PPT氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因選擇系統(tǒng)CAT：大腸桿菌Tn9轉(zhuǎn)座子編碼的催化氯霉素乙酰化反應(yīng)的蛋白質(zhì)真核細(xì)胞缺乏CAT導(dǎo)入CAT可作為報(bào)告基因常用于瞬時(shí)表達(dá)研究23可編輯課件PPT表位標(biāo)記表位：抗原決定簇即抗原分子于一特定抗體結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)，一般由少至幾個(gè)氨基酸的多肽組成用于重組DNA技術(shù)的示蹤、分析、純化（親和）優(yōu)點(diǎn)用一種抗體可鑒別不同重組蛋白不影響蛋白功能有利于研究蛋白功能常用表位：6His；FLAG；LZ等24可編輯課件PPT構(gòu)建含表位的重組體使用常用密碼子注意克隆位點(diǎn)（限制性酶切位點(diǎn)）相符5`端加上起始密碼子ATG3`端加上終止密碼子可插入蛋白酶切位點(diǎn)基因，以利于產(chǎn)生天然蛋白其他常規(guī)構(gòu)建載體的注意點(diǎn)25可編輯課件PPT真核表達(dá)載體質(zhì)粒：真核表達(dá)元件、真核抗性病毒載體：改建后SV40病毒腺病毒反轉(zhuǎn)錄病毒痘苗病毒26可編輯課件PPT病毒基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)病毒基因組大小相差較大,與細(xì)菌或真核細(xì)胞相比，病毒的基因組很小病毒基因組可以由DNA組成，也可以由RNA組成多數(shù)RNA病毒的基因組是由連續(xù)的核糖核酸鏈組成基因重疊即同一段DNA片段能夠編碼兩種甚至三種蛋白質(zhì)分子病毒基因組的大部分是用來(lái)編碼蛋白質(zhì)的病毒基因組DNA序列中功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因或rRNA的基因往往叢集在基因組的一個(gè)或幾個(gè)特定的部位,形成一個(gè)功能單位或轉(zhuǎn)錄單元除了反轉(zhuǎn)錄病毒以外，一切病毒基因組都是單倍體，每個(gè)基因在病毒顆粒中只出現(xiàn)一次噬菌體（細(xì)胞病毒）的基因是連續(xù)的；而真核細(xì)胞病毒的基因是不連續(xù)的27可編輯課件PPT病毒載體優(yōu)點(diǎn)真核細(xì)胞可識(shí)別的啟動(dòng)子報(bào)告基因可持續(xù)復(fù)制（感染周期）部分載體可整合入基因組部分載體本身帶有完整的復(fù)制及表達(dá)元件部分載體具有宿主細(xì)胞特異性識(shí)別受體假病毒顆粒28可編輯課件PPT猿猴空泡病毒（SV40）種屬分類：乳多空病毒科多瘤病毒屬雙鏈共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），5243bp20面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑45nm以EcoRl內(nèi)切酶切點(diǎn)作為0點(diǎn)分成100等分，Ori點(diǎn)是DNA雙向復(fù)制的起紿點(diǎn)早期編碼進(jìn)程是逆時(shí)鐘方向，在病毒DNA自制前，編碼的蛋白質(zhì)(大T、小T抗原)與誘發(fā)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有關(guān)晚期編碼區(qū)進(jìn)程為順時(shí)鐘方向，是在病毒DNA復(fù)制開(kāi)始以后，編碼的蛋白質(zhì)為三種病毒殼體蛋白VP1、VP2和VP3，這些蛋白是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，不參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程29可編輯課件PPT30可編輯課件PPTSV40感染細(xì)胞模式感染形式：隨宿主的不同產(chǎn)生的效應(yīng)不同許可性細(xì)胞——裂解性感染（猿猴細(xì)胞）非許可性細(xì)胞——整合入染色體（嚙齒動(dòng)物細(xì)胞）半許可性細(xì)胞——既不整合也不裂解（人細(xì)胞）31可編輯課件PPTSV40載體類型取代型重組病毒去掉晚期區(qū)一段DNA，外源基因可插入需輔助病毒感染可形成病毒顆粒重組病毒-質(zhì)粒載體保留病毒復(fù)制相關(guān)序列插入細(xì)菌質(zhì)粒序列，可在大腸桿菌種復(fù)制增殖不形成病毒顆粒32可編輯課件PPTSV40及衍生載體的優(yōu)點(diǎn)可在多種細(xì)胞中表達(dá)基因組DNA、cDNA均可表達(dá)SV40的復(fù)制起始點(diǎn)廣泛宿主范圍的啟動(dòng)子多聚A信號(hào)DNA拼接供體和信號(hào)（剪接內(nèi)含子）部分載體含有報(bào)告基因33可編輯課件PPT感染宿主范圍有限復(fù)制只能在猿猴細(xì)胞中載體DNA分子量小，容量小在用輔助病毒混合感染時(shí)，有野生化危險(xiǎn)SV40及衍生載體的缺點(diǎn)34可編輯課件PPT35可編輯課件PPT痘苗病毒雙鏈DNA病毒180kb，編碼200種左右的蛋白可獨(dú)立的在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制轉(zhuǎn)錄36可編輯課件PPT痘苗病毒載體優(yōu)越性宿主范圍廣泛容量大——插入的外源基因可達(dá)25kb瞬時(shí)表達(dá)無(wú)致癌性——本身即需接種可作為重組活疫苗的載體37可編輯課件PPT痘苗病毒載體的缺點(diǎn)分子量大，操作較困難無(wú)剪接功能——不能插入含內(nèi)含子的基因外源基因必須插入非必需區(qū)38可編輯課件PPT構(gòu)建重組痘苗病毒流程tk基因插入質(zhì)粒tk基因內(nèi)插入痘病毒早期啟動(dòng)子接上多克隆位點(diǎn)接上外源基因野毒株感染細(xì)胞導(dǎo)入重組載體同源重組——含外源基因的tk基因取代篩選含外源基因的重組病毒感染敏感宿主細(xì)胞表達(dá)外源基因39可編輯課件PPT腺病毒Ad病毒顆粒的直徑為70-90nm，呈20面體立體對(duì)稱型，核心外層的殼體由252個(gè)殼粒亞單位組成雙股線型DNA，DNA約占病毒重量的11-14%不同亞型Ad病毒的DNA的G+C%含量不同，與其致瘤性能強(qiáng)弱有關(guān)Ad2基因組的早期轉(zhuǎn)錄區(qū)有6個(gè)獨(dú)立的區(qū)域:IA(EIA)、EIB、E2(E2A和E2B)、E3、E4Ad2基因組約長(zhǎng)36kb，EIA和EIB與Ad2的啟動(dòng)和轉(zhuǎn)化細(xì)胞密切有關(guān)腺病毒雖然分布廣泛，其中某些亞型對(duì)動(dòng)物具強(qiáng)致瘤性，但是從A組到E組，迄今尚未證明與人類腫瘤有病因?qū)W上的聯(lián)系40可編輯課件PPT腺病毒載體容量較大：可插入7kb易培養(yǎng)、純化復(fù)制與轉(zhuǎn)錄依賴與宿主聚合酶不整合釋放殼體蛋白，引起免疫反應(yīng)41可編輯課件PPT基因的導(dǎo)入方法光穿孔法：激光；懸浮細(xì)胞沖擊波：活體局部的基因轉(zhuǎn)移基因槍法：即微粒轟擊；動(dòng)物細(xì)胞，更適用于植物細(xì)胞穿孔法：脈沖電場(chǎng)；Cytomix緩沖液；70%細(xì)胞死亡時(shí)效率最高磷酸鈣共沉淀法脂質(zhì)體法：Lipofectin；陽(yáng)離子抗體轉(zhuǎn)染法：抗CD3，CD34或表面免疫求蛋白其他：超聲波法；微注射法原生質(zhì)體融合法；反轉(zhuǎn)錄病毒感染法42可編輯課件PPT表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)技術(shù)Western印跡法——免疫學(xué)方法——抗原-抗體反應(yīng)熒光顯微鏡法——表位標(biāo)記的抗體與直接抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記——免疫學(xué)方法43可編輯課件PPTWestern印跡法蛋白樣品制備→

SDS（按分子量大?。娹D(zhuǎn)移→一抗（特異性）→二抗→顯色敏感度：1-5ng44可編輯課件PPT樣品的制備裂解細(xì)胞電泳加樣緩沖液裂解細(xì)胞（煮沸5-10min）抽提細(xì)胞蛋白（超聲）45可編輯課件PPTSDS丙烯酰胺和N，N`-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)，形成一定孔徑的分離介質(zhì)，孔徑大小由濃度決定，具有分子篩效應(yīng)在不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，具有濃縮效應(yīng)蛋白質(zhì)本身的電荷效應(yīng)SDS：陰離子去污劑，與蛋白質(zhì)結(jié)合SDS濃度大于0.05%時(shí)，使樣品中的蛋白質(zhì)帶同樣密度的電荷電泳時(shí)使蛋白遷移只與分子量有關(guān)，且呈線性（對(duì)數(shù)分子量與遷移率），可測(cè)定分子量46可編輯課件