微生物實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范

細(xì)菌實(shí)驗(yàn)操作局部=1\*GB4㈠培養(yǎng)基的配置操作步驟1.稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確稱量放入燒杯中〔用稱量勺，稱量紙和電子天平〕。2.在燒杯中先參加少量所需蒸餾水，用玻璃棒攪勻，然后再石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。待藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需總體積。如果配制固體培養(yǎng)基，將稱好的瓊脂放入已溶化的藥品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底。3.調(diào)pH：在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基pH值，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中參加1mol/LNaOH,邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測，反之用1mol/LHCL。4.分裝：〔1〕液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜?！?〕固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面，分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜?！?〕半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。5.加塞：培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞或硅膠塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。6.包扎：加賽后，將全部試管用皮筋捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙〔報(bào)紙即可〕，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤濕。用記號筆注明日期名稱。7.滅菌：將上述培養(yǎng)基放入121攝氏度，20分鐘高壓蒸汽滅菌。8.擱置斜面：將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50°C左右，將試管塞端擱在玻璃幫上，擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。9.無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24至48幾種常用培養(yǎng)基成分1．LBMedium(LB培養(yǎng)基)Yeastextact(酵母膏)5gPeptone(蛋白胨)10gNaCl10gAgar(瓊脂)1-2%Distilledwater(蒸餾水)1000mlpH7.0適用范圍：大腸埃希氏菌〔大腸桿菌〕2.TryptonSoyAgar胰蛋白胨17.0g大豆胨3.0g葡萄糖2.5g瓊脂20.0gNaCl5.0gK2HPO42.5g蒸餾水1000ml3.NutrientAgar(營養(yǎng)肉汁瓊脂)Pepton(蛋白胨)5gBeefextract(牛肉膏)30gNaCl5gAgar(瓊脂)15gDistilledwater(蒸餾水)Adjust(調(diào))pHto7.0-7.24.RSL-鹽酸鳥氨酸6.5g氯化鈉5.0gL-鹽酸賴氨酸5.0g脫氧膽酸鈉1.0gL-鹽酸半胱氨酸0.3g酵母提取物3.0g麥芽糖3.5g溴麝香草酚藍(lán)0.03g硫代硫酸鈉6.8g新生毒素0.005g枸櫞酸鐵銨0.8g瓊脂12.5g蒸餾水1000mL5.麥康凱蛋白胨20.0g乳糖10.0g牛膽鹽5.0g氯化鈉5.0g中性紅0.03g瓊脂14.0g=2\*GB4㈡幾種試劑的制備波恩試劑：75%飽和苦味酸25%福爾馬林5%冰乙酸=3\*GB4㈢細(xì)菌的別離1．待檢材料的處理無菌采集的病料不經(jīng)處理可直接用于別離；污染較嚴(yán)重的病料，接種前必須處理前方可進(jìn)行別離培養(yǎng)。〔1〕加熱處理法當(dāng)疑心病原菌為芽胞菌時(shí)，可參加5-10倍滅菌生理鹽水研磨(液體病料除外)，75℃水浴30min(或80℃15-20min)，可殺死細(xì)菌繁殖體(包括雜菌及病原菌〔2〕接種易感動物把病料接種易感動物，待其發(fā)病死亡后，取其血液或組織器官，接種到培養(yǎng)基上。利用此方法不但可以從污染的材料中別離出病原菌，而且還可以確定病原菌的毒力。〔3〕化學(xué)藥品處理有些化學(xué)藥品對某些細(xì)菌有極強(qiáng)的抑制力，而對另一些細(xì)菌那么沒有抑制作用或很小。因此可將適宜的化學(xué)藥品參加培養(yǎng)基中。如龍膽紫那么可抑制許多G＋菌的繁殖，有利于G－菌的別離培養(yǎng)；2．平板劃線別離培養(yǎng)法〔1〕培養(yǎng)基平板的準(zhǔn)備取普通瓊脂培養(yǎng)基或含有特殊成分的瓊脂培養(yǎng)基，融化并讓其冷卻至50℃左右，傾入滅菌平皿中，每個(gè)平皿約15mL〔2〕各種物品的準(zhǔn)備取出待檢病料，置于工作臺上；接種前準(zhǔn)備好酒精燈、接種環(huán)、火柴、酒精棉球、試管架等。如有超凈工作臺，應(yīng)先翻開通風(fēng)機(jī)，過濾除塵，如有紫外線燈應(yīng)同時(shí)翻開，10-15min后可開始工作。不管在桌面上還是在超凈工作臺上接種，都要事先作好準(zhǔn)備工作，把所用的物品器械擺好?！?〕平板劃線以左手持平板，中指、無名指和小指托著平板底,拇指和食指翻開上蓋，使蓋與底成30o角，以便劃線。右手握接種環(huán)，先滅菌鉑絲局部，待絲燒紅后，再于火焰上滅菌金屬棒局部。把接種環(huán)上的病料涂在培養(yǎng)基一側(cè)，一般作5-8次劃線。將環(huán)上的多余細(xì)菌材料燒掉后，從第1次劃線引出第2次劃線；再從第2次劃線引出第3次劃線，如此反復(fù)3-4次劃線后，即可把整個(gè)平板外表劃滿，注意每一次劃線只能與上一次劃線重疊，這樣就可在最后的1-2次劃線上出現(xiàn)多量的單個(gè)菌落，以便進(jìn)行純培養(yǎng)。〔4〕培養(yǎng)物的觀察病料在接種培養(yǎng)基后，經(jīng)過一段時(shí)間，應(yīng)取出來檢查其生長狀況。首先用肉眼檢查有無細(xì)菌生長；假設(shè)有，那么需進(jìn)一步檢查菌落是否純一。當(dāng)從臨床病料中別離細(xì)菌時(shí)：多數(shù)情況下，沿劃線生長較多的菌落，是待檢病原菌的可能性較大；少數(shù)零散分布或不在劃線上生長的菌落，多為雜菌。為慎重起見，可挑選假設(shè)干個(gè)可疑菌落分別進(jìn)行鑒定。3．厭氧菌的別離培養(yǎng)法通常使用物理去氧、化學(xué)去氧和生物去氧，實(shí)驗(yàn)室常用：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧肉湯4．細(xì)菌的純培養(yǎng)與移植接種別離培養(yǎng)的目的就是要獲得純培養(yǎng)。細(xì)菌的純培養(yǎng)就是只含一種細(xì)菌的培養(yǎng)物，最理想的純培養(yǎng)是一個(gè)細(xì)菌的后代。細(xì)菌的移植接種就是把某種細(xì)菌材料移種到一個(gè)新的培養(yǎng)基上，使它在其上生長。=4\*GB4㈣接種接種標(biāo)本是細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)根本操作技能，目的是使細(xì)菌能得到充分的生長和能別離出單個(gè)菌落獲得純培養(yǎng)而供分析鑒定只用，所以此項(xiàng)技術(shù)的操作應(yīng)按以下方式進(jìn)行：左手的操作要點(diǎn)：左手負(fù)責(zé)持平板、試管、燒瓶等物品，操作中，左手應(yīng)盡量減少擺動，否那么，不利于保持物品的無菌狀態(tài)。1.1左手持物品時(shí)，最好固定在一個(gè)空間方位上，以防止因移動使空氣中的細(xì)菌進(jìn)入器皿，造成隨機(jī)性污染。1.2所持器皿其開口盡量防止向上，持平皿時(shí)，可以讓平板的外表與桌面盡量垂直，試管與燒瓶也可傾斜。當(dāng)從標(biāo)本器皿或平板上挑去接種物或菌落后應(yīng)立即塞上試管塞或扣上平皿，隨即接種標(biāo)本。2.右手的操作要點(diǎn)：握有接種工具的右手，將接種環(huán)沿伸到標(biāo)本之前應(yīng)作好接種環(huán)用酒精燈消毒的工作，待冷卻后到容器中挑取接種物，在挑去標(biāo)本后，其接種工具應(yīng)盡量防止接觸試管及試管口等。隨后將接種物在培養(yǎng)基上別離劃線。3.接種的根本步驟：3.1右手持接種工具，在火焰上灼燒3次滅菌3.2左手持原代培養(yǎng)物的平皿或試管3.3用接種環(huán)挑去適量標(biāo)本或細(xì)菌，純化細(xì)菌應(yīng)從原代培養(yǎng)物上挑取單個(gè)菌落。從液體培養(yǎng)基中取菌，只需將接種環(huán)在培養(yǎng)液中蘸取一環(huán)即可。3.4平板劃線：接種環(huán)，先滅菌鉑絲局部，待絲燒紅后，再于火焰上滅菌金屬棒局部。把接種環(huán)上的病料涂在培養(yǎng)基一側(cè)，一般作5-8次劃線。將環(huán)上的多余細(xì)菌材料燒掉后，從第1次劃線引出第2次劃線；再從第2次劃線引出第3次劃線，如此反復(fù)3-4次劃線后，即可把整個(gè)平板外表劃滿，注意每一次劃線只能與上一次劃線重疊，這樣就可在最后的1-2次劃線上出現(xiàn)多量的單個(gè)菌落，以便進(jìn)行純培養(yǎng)。3.5接種后，應(yīng)在火焰上反復(fù)灼燒接種工具并作一定的編號記錄。=5\*GB4㈤細(xì)菌的生化試驗(yàn)氧化型與發(fā)酵型〔O/F〕的測定試驗(yàn)方法：將菌液分別注射到兩個(gè)O/F生化反響管中加lmL滅菌的液狀石蠟油到一個(gè)O/F管作發(fā)酵試驗(yàn)37℃下孵育結(jié)果判定：①只在沒有覆蓋石蠟油的一管發(fā)酵糖產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣者屬氧化型〔或呼吸型〕②兩管均發(fā)酵糖產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣者為發(fā)酵型2.糖、醇類生化管試驗(yàn)方法：將菌液分別注射到糖發(fā)酵生化反響管中37℃下孵育結(jié)果判定：變黃色陽性變紫色陰性=6\*GB4㈥滅菌①干熱滅菌法干熱滅菌是在電熱枯燥箱內(nèi)利用高溫枯燥空氣〔160℃~170細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，那么蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高〔160℃~170℃〕，時(shí)間長〔1~2h〕。但干熱滅菌溫度不能超過干熱滅菌使用的是電熱枯燥箱〔枯燥箱〕。具體操作步驟如下：裝入待滅菌物品：將包好的待滅菌物品放入電熱枯燥箱內(nèi)，關(guān)好箱門。堆積時(shí)要留有空隙，物品不要擺放得太擠，以免阻礙空氣流通，滅菌物品不要接觸電熱枯燥箱內(nèi)壁的鐵板、溫度探頭，以防包裝紙烤焦起火。升溫：接通電源，翻開開關(guān)，適當(dāng)翻開電熱枯燥箱頂部的排氣孔，旋動恒溫調(diào)節(jié)器，使溫度逐步上升。當(dāng)溫度升至100℃時(shí)，關(guān)閉排氣孔。在升溫過程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示電熱枯燥箱內(nèi)停止加溫，此時(shí)如果還未到達(dá)所需的160℃~恒溫：當(dāng)溫度升到160℃~170℃時(shí)，借助恒溫調(diào)節(jié)器的自動控制，保持此溫度降溫：切斷電源，自然降溫。開箱取物：待電熱枯燥箱內(nèi)溫度降到60℃以下后，才能翻開箱門，取出滅菌物品。同時(shí)，應(yīng)將溫度調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)到零點(diǎn)，并翻開排氣孔。電熱枯燥箱內(nèi)溫度未降到60②高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌是將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，在一定的壓力下保持15~30分鐘進(jìn)行滅菌。此法適用于培養(yǎng)基、無菌水、工作服等物品的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋夾套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中排盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，獲得高于100℃在相同的溫度下，濕熱滅菌的效果好于干熱滅菌。有三點(diǎn)原因：在濕熱滅菌中菌體吸收水分，蛋白質(zhì)容易凝固變性，蛋白質(zhì)隨著含水量的增加，所需凝固溫度降低；濕熱滅菌中蒸汽的穿透力比枯燥空氣大；蒸汽在被滅菌物體外表凝結(jié)，釋放出大量的汽化潛熱，能迅速提高滅菌物體外表的溫度，從而增加滅菌效力。實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌鍋有非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋和自控式滅菌鍋，其結(jié)構(gòu)和工作原理是相同的。本實(shí)驗(yàn)介紹的是非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋，自控式滅菌鍋的使用可參考廠家說明書。具體操作步驟如下：加水：首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)參加適量的水，使水面沒過加熱蛇管，與三角擱架相平為宜。切勿忘記檢查水位，加水量過少，滅菌鍋會發(fā)生燒干引起炸裂事故。裝料：放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌的物品。注意不要裝得太擠，以免阻礙蒸汽流通而影響滅菌效果。裝有培養(yǎng)基的容器放置時(shí)要防止液體溢出，三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包扎的紙而透入棉塞。加蓋：將蓋上與排氣孔相連的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)，擺正鍋蓋，對齊螺口，然后以對稱方式同時(shí)旋緊相對的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣，并翻開排氣閥。排氣：翻開電源加熱滅菌鍋，將水煮沸，使鍋內(nèi)的冷空氣和水蒸汽一起從排氣孔中排出。一般認(rèn)為當(dāng)排出的氣流很強(qiáng)并有噓聲時(shí)，說明鍋內(nèi)的空氣已排盡，沸騰后約需5分鐘。升壓：冷空氣完全排盡后，關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，鍋內(nèi)壓力開始上升。保壓：當(dāng)壓力表指針到達(dá)所需壓力時(shí)，控制電源，開始計(jì)時(shí)并維持壓力至所需的時(shí)間。如本實(shí)驗(yàn)中采用0.1Mpa，121.5℃，20滅菌的主要因素是溫度而不是壓力，因此鍋內(nèi)的冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)閉排氣閥，維持所需壓力。降壓：到達(dá)滅菌所需的時(shí)間后，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0〞后，方可翻開排氣閥，排盡余下的蒸汽，旋松螺栓，翻開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。壓力一定要降到“0〞后，才能翻開排氣閥，開蓋取物。否那么就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基或試劑由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼傷操作者。無菌檢查：將已滅菌的培養(yǎng)基放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h=7\*GB4㈦革蘭氏染色革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，具體操作方法是：１〕涂片固定。在無菌操作條件下，用接種環(huán)挑取少量細(xì)菌于干凈的載玻片上涂布均勻，固定。２〕草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。３〕自來水沖洗，去掉浮色。４)用碘-碘化鉀溶液媒染1分鐘，傾去多余溶液。５〕用中性脫色劑如乙醇〔95%〕或丙酮酸脫色30秒，革蘭氏陽性菌不被褪色而呈紫色，革蘭氏陰性菌被褪色而呈無色。６〕用蕃紅染液復(fù)染30秒，革蘭氏陽性菌仍呈紫色，革蘭氏陰性菌那么呈現(xiàn)紅色。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌即被區(qū)別開。=8\*GB4㈧菌種的保存在含甘油和蒸餾水以1:1的比例混合的凍存管里至于零下80攝氏度中。凍存管規(guī)格為2mL，甘油和蒸餾水各0.5mL，菌液為1mL。操作時(shí)考前須知：在吸取菌液時(shí)，移液槍、凍存管管口和試管管口需在火焰周圍防止雜菌混入，但不能離火焰太近防止菌種高溫失活。含甘油的凍存管需滅菌才能保存菌種。=9\*GB4㈨藥敏實(shí)驗(yàn)制備培養(yǎng)基，一般以MH培養(yǎng)基為根底，依不同致病微生物，添加適宜成分。菌液制備：挑選鑒定后的致病菌微生物純菌落，接種于MH液體培養(yǎng)基或營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，28.5攝氏度培養(yǎng)16-18平板上細(xì)菌的接種與貼藥片：用滅菌的棉簽蘸取菌液少許，均勻涂于平板上，待干后〔5分鐘〕左右，用滅菌的鑷子分別取藥敏片貼于培養(yǎng)基外表〔每個(gè)平板上貼六個(gè)，外面貼成一個(gè)五角狀，中間貼一個(gè)，距離平均〕，并用鑷子輕按紙片中心，使其附著嚴(yán)密。每次貼完一片，鑷子要用酒精燈滅菌，然后用酒精棉擦拭涼卻。每個(gè)藥敏片的簡稱要記錄。將貼好藥敏片的培養(yǎng)皿倒置放入28.5攝氏度用直尺量取抑菌圈的大小，取抑菌環(huán)最大直徑〔mm〕，每個(gè)藥敏片直徑為7mm。根據(jù)紙片法藥敏試驗(yàn)抑菌環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)，得出結(jié)果。=10\*GB4㈩酒精棉的制備用滅菌過的棉花浸泡在75％的酒精中，棉花大小在手掌握拳形成的縫隙大小。分子實(shí)驗(yàn)操作局部一、DNA的提取1、酚仿抽提法a、15ml的離心管參加600μl胞核裂解液，冰上冷卻。b、冷凍胞核裂解液中參加10-20mg新鮮或者解凍組織，小型勻漿機(jī)勻漿10秒。將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml微量離心管中。﹙也可選擇，使用研缽或研杵研磨預(yù)先冷凍在液氮中的組織。研磨后，液氮揮發(fā)，轉(zhuǎn)移大約10-20mg根本組織到含有600μl胞核裂解液的1.5ml微量離心管中。﹚c、65℃d、胞核裂解產(chǎn)物中參加3μl核糖核酸酶溶液顛倒離心管2-5次混合?；旌衔?7℃e、冷卻至室溫的樣本，參加200μl蛋白沉淀液，高速強(qiáng)力渦旋振蕩20秒。冰上冷卻樣本5分鐘。f、13000-16000xg離心4分鐘。沉淀的蛋白可形成一種致密的白色顆粒。g、小心將含有DNA的上清轉(zhuǎn)移至含有600μl室溫異丙醇的1.5ml干凈微量離心管。﹙留下蛋白顆粒﹚注意：一些含有蛋白顆粒的上清可能仍留在原管中。將這些殘留液體留在原管中以免沉淀的蛋白污染DNA溶液。h、輕柔顛倒混合溶液直到白色線狀的DNA條帶形成一種可見物。i、13000-16000xg室溫離心1分鐘。DNA可形成一種肉眼可見的白色小顆粒。小心傾析出上清。j、參加600μl室溫70%的乙醇，輕柔顛倒離心管數(shù)次以洗脫DNA。13000-16000xg室溫離心1分鐘。k、用巴斯德吸管或測序移液管頭小心抽吸乙醇。此時(shí)DNA顆粒非常松散，注意防止把顆粒抽吸到吸管中。l、將離心管倒轉(zhuǎn)在干凈的吸水紙上，風(fēng)干顆粒10-15分鐘。m、加100μlDNA再水化液65℃孵育1小時(shí)再水化DNA。周期性輕拍離心管混合溶液。也可選擇，室溫或4μ℃n、DNA保存在4℃2、水煮法提DNAa、取1ml菌液至離心管，12000rpm離心1min，倒掉上清液，重復(fù)一次b、在離心所得的細(xì)菌中參加10μL蒸餾水，100℃c、取出立即放入-80℃d、拿出后放4℃3、試劑盒提DNA二、PCR操作：〔操作臺照紫外燈20分鐘后操作或在酒精燈旁操作〕1、反響體系：模板2μL、dNTP2μL、10×bufferμL、氯化鎂μL、上游引物FμL、下游引物RμL、雙蒸水15μL，TaqDNA酶0.2-0.5μL。2、體系優(yōu)化：單因素梯度改變，其他因素不變。例：模板2μL、dNTP2μLμLμLμL、雙蒸水15μLμL，10×buffer從1.6上升到2.4μL，每次增加0.4μL。其他以此類推。3、優(yōu)化后體系：〔20μL〕模板2μL、dNTP0.5μL、10×buffer2μL、氯化鎂1.6μL、上游引物F0.5μL、下游引物R0.5μL、雙蒸水15μL，TaqDNA酶0.3μL。4、操作過程：將模板2μL、dNTP0.5μL、10×buffer2μL、氯化鎂1.6μL、上游引物F0.5μL、下游引物R0.5μL、雙蒸水15μL，TaqDNA酶0.3μL逐一加到PCR反響管中，離心，使得試劑不粘附于管壁?！伯?dāng)樣多時(shí)，可將dNTP、10×buffer、氯化鎂、F、R、雙蒸水、TaqDNA酶先加在一起，混勻，再依次加到PCR薄壁管中，18μL/管，先加對照組〕5、PCR反響過程：模板DNA的預(yù)變性95℃，5min；模板DNA的變性95℃，1min；模板DNA和引物的退火54℃±3℃〔根據(jù)DNA鏈的長短決定〕，1min；引物的延伸72℃，1.5min；6、PCR結(jié)果出現(xiàn)非特異性條帶原因：a、引物聚合形成的二聚體或多聚體b、Mg2+濃度過高c、退火溫度過低d、PCR循環(huán)次數(shù)過多e、酶的量過多三、膠板的制備、電泳點(diǎn)樣1、Tris-乙酸〔TAE〕使用液1×：0.04mol/LTris-乙酸0.001mol/LEDTA儲存液50×：242gTris堿，57.1ml冰乙酸，100ml0.5mol/LEDTA〔pH8.0〕注意：電泳緩沖液屢次使用后，離子強(qiáng)度降低，PH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)那么的DNA帶遷移的現(xiàn)象。2、膠板的制備瓊脂糖凝膠液：瓊脂糖/1×TAE為0.012g/ml，然后放入微波爐加熱，沸騰3—4次，至全部溶解，并且沒有氣泡；大膠板40ml，小膠板20ml。瓊脂糖凝膠液冷卻至50—60℃，參加goldview〔1μL/ml〕，搖勻，不可產(chǎn)生氣泡；制膠槽固定位置插上梳子，將混勻后的凝膠液小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上,使膠液緩慢展開,直到整個(gè)玻璃板外表形成均勻膠層.室溫下靜置直至凝膠完全凝固,垂直輕拔梳子,取下膠帶,將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中.添加1×TAE電泳緩沖液至沒過膠板1-2mm3、電泳點(diǎn)樣〔發(fā)表文章使用點(diǎn)樣5μL；切膠回收點(diǎn)樣4μL；判斷下RCR有無產(chǎn)物點(diǎn)樣2μL〕取出PCR產(chǎn)物，每5μLPCR產(chǎn)物參加緩沖液loadingbufferμL，充分混勻，用10μL微量移液器分別將樣品參加膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面(注意:加樣前要先記下加樣的順序)。最后參加DNAMarker〔點(diǎn)樣的時(shí)候靠邊的點(diǎn)樣孔最好不要點(diǎn)樣〕。電壓100V，進(jìn)行電泳40min。四、拍照、圖片處理1、瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，將膠板從電泳槽中取出，放入凝膠成像系統(tǒng)，拍照2、利用photoshop軟件進(jìn)行圖片處理。五、切膠純化、測序1、切膠純化a、在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，計(jì)算凝膠重量。〔100mg凝膠，計(jì)100ul體積