玉米品種DNA指紋鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR標(biāo)記法

1玉米品種DNA指紋鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法本文件確立了玉米品種DNA指紋鑒定技術(shù)，規(guī)定了儀器設(shè)備及試劑、溶液配制、引物信息、參照品種、操作步驟、等階段的操作指示，以及上述階段之間的轉(zhuǎn)換條件，描述了SSR標(biāo)記法數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì)、判定規(guī)則等追溯方法。本文件適用于玉米自交系和單交種的SSR指紋數(shù)據(jù)采集及品種鑒定，其他雜交種類(lèi)型及群體和開(kāi)放授粉品種可參照?qǐng)?zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1核心引物coreprimer品種DNA指紋鑒定中優(yōu)先選用的一套SSR引物，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好等綜合特性。[來(lái)源：DB45/T1311－2016，3.1]4原理由于不同玉米品種遺傳組成不同，基因組DNA中簡(jiǎn)單重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)存在差異，這種差異可通過(guò)PCR擴(kuò)增及電泳方法進(jìn)行檢測(cè)，從而能夠區(qū)分不同玉米品種。5儀器設(shè)備及試劑見(jiàn)附錄A。6溶液配制見(jiàn)附錄B。27引物信息核心引物名單及序列見(jiàn)附錄C。8操作步驟8.1樣品制備隨機(jī)抽取種子、幼苗、葉片等至少20個(gè)個(gè)體組成的混合樣品進(jìn)行分析或直接對(duì)至少5個(gè)個(gè)體單獨(dú)進(jìn)行分析。8.2DNA提取8.2.1CTAB提取法取幼芽或葉片200mg～300mg充分研磨，或取種子充分磨碎，移入2.0mL離心管；每管加入600μL65℃預(yù)熱的CTAB提取液，混合均勻，65℃保溫30min，期間顛倒混勻；每管加入等體積的三氯甲烷/異戊醇混合液，充分混合后，靜置10min；12000g離心5min后，吸取上清液至一新1.5mL離心管，再加入等體積預(yù)冷的異丙醇或乙醇，顛倒離心管混勻，在室溫放置20min；之后4℃,12000g離心5min，棄上清液；加入70％乙醇或異丙醇，旋轉(zhuǎn)離心管混勻，棄去乙醇；將離心管倒立于墊有濾紙的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，室溫干燥沉淀4h以上；加入100μL超純水或TE緩沖液，充分溶解后備用。8.2.2SDS提取法剝?nèi)「煞N子的胚，加入100μL三氯甲烷后研磨，移入1.5mL離心管中，加入300μLSDS提取液，混勻后于12000g離心2min，吸上清液加入預(yù)先裝有300μL異丙醇和300μL氯化鈉溶液的1.5mL離心管中，待DNA成團(tuán)后挑出，經(jīng)70％乙醇洗滌后加人200μLTE緩沖液，待充分溶解后備用。8.2.3試劑盒提取法使用經(jīng)驗(yàn)證適合SSR指紋技術(shù)的商業(yè)試劑盒，按照試劑盒的使用說(shuō)明操作。8.3PCR擴(kuò)增首先選擇附錄C中前20對(duì)引物進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)樣品間檢測(cè)出的差異位點(diǎn)數(shù)小于2時(shí)，再選用附錄C中后20對(duì)引物進(jìn)行檢測(cè)；必要時(shí)，進(jìn)一步選擇特定標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。8.3.2反應(yīng)體系各組分的終濃度如下：每種dNTP0.10mmol/L，正向、反向引物各0.15μmol/L，TaqDNA聚合酶0.04U/μL，1×PCR緩沖液（含Mg2+2.5mmol/L)，DNA溶液1.5ng/μL，其余以超純水補(bǔ)足至10μL。8.3.3反應(yīng)程序95℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性30s，55℃~60℃退火30s，72℃延伸45s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，10℃保存。38.4PCR產(chǎn)物檢測(cè)8.4.1非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測(cè)8.4.1.1凝膠制備在一對(duì)玻璃板間插入1.0mm寬的間隔片，將玻璃板對(duì)齊夾緊，在封口處注入瓊脂糖溶液，讓其在10min～15min凝固密封。然后在燒杯中依次加入5mL5×TBE緩沖液，3.75mL40％PAGE膠，攪拌并用雙蒸水定容至25mL；加入200μL過(guò)硫酸銨和12μLTEMED，混勻后倒入凝膠板之間，隨即插好樣品梳，使其在50min～60min內(nèi)聚合凝固，凝膠高度應(yīng)不小于10cm。8.4.1.2電泳去掉封口的瓊脂糖膠，將玻璃板固定于重直電泳槽上，向電泳槽中加入1×TBE緩沖液，小心抽出樣品梳。在PCR樣品中加入2μL6×溴酚藍(lán)-二甲苯青電泳指示劑，混勻，然后向加樣孔中點(diǎn)入2μL樣品；同時(shí)，在一側(cè)樣品孔中加入分子量標(biāo)記。開(kāi)始電泳，選用的電壓梯度為1V/cm～5V/cm，一般電泳300VH~600VH，當(dāng)指示帶（二甲苯青）到達(dá)膠板的中部時(shí)結(jié)束電泳。8.4.1.3銀染顯色電泳完畢后關(guān)閉電源，取下玻璃板。小心分開(kāi)兩塊玻璃板，取下聚丙烯酰胺凝膠，雙蒸水沖洗30s~60s，放入染色液中，輕搖5min～10min進(jìn)行染色；然后從染色液中取出，用水快速漂洗兩次，放入顯影液中，輕搖至顯色出清晰帶紋，取出用雙蒸水沖洗2遍，瀝干。拍攝或掃描成像。8.4.2普通變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)8.4.2.1清洗玻璃板將玻璃板反復(fù)擦洗干凈，雙蒸水擦洗2遍，95％乙醇擦洗2遍，干燥。在長(zhǎng)板上涂0.5mL親和硅烷工作液，帶凹槽的短板上涂0.5mL剝離硅烷工作液。操作過(guò)程中防止兩塊玻璃板互相污染。8.4.2.2組裝電泳版待玻璃板徹底干燥后組裝電泳板，并用水平儀調(diào)平。8.4.2.3灌膠在100mL7％PAGE膠中加入TEMED和25％過(guò)硫酸銨各100μL，迅速混勻后灌膠。待膠流動(dòng)到凹槽的短板上部，在上部輕輕的插入梳子，使其聚合至少1h以上，待膠凝結(jié)。灌膠時(shí)應(yīng)勻速。8.4.2.4預(yù)電泳在正極槽（下槽）加入1×TBE緩沖液600mL，在負(fù)極槽（上槽）加入預(yù)熱至65℃的1×TBE緩沖液600mL，拔出梳子。在90W恒功率下，預(yù)電泳10min～15min。8.4.2.5變性在10μLPCR產(chǎn)物中加入2μL6×加樣緩沖液，混勻后，在PCR儀上運(yùn)行變性程序：95℃變性5min,48.4.2.6電泳用注射器吹吸加樣槽，清除氣泡和雜質(zhì)。每個(gè)加樣孔點(diǎn)入3μL樣品。100W恒功率電泳約40min，指示帶（二甲苯青）到達(dá)膠板的中部，電泳結(jié)束后，小心分開(kāi)兩塊玻璃板，凝膠會(huì)緊貼在長(zhǎng)板上。注：預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在150bp以下時(shí)電泳時(shí)間適當(dāng)縮短，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在300bp以上時(shí)電泳時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。8.4.2.7銀染顯色具體步驟如下：a)固定：固定液中輕輕晃動(dòng)3min；b)漂洗：雙蒸水快速漂洗1次，不超過(guò)10s；c)染色：染色液中染色10min；d)漂洗：雙蒸水快速漂洗2次，時(shí)間不超過(guò)10s；e)顯影：顯影液中輕輕晃動(dòng)至帶紋出現(xiàn)；f)定影：固定液中定影5min；g)漂洗：雙蒸水漂洗10s。9數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì)9.1數(shù)據(jù)記錄各標(biāo)記的等位基因依據(jù)分子量從大到小按1，2，3，4，5……進(jìn)行編號(hào)，對(duì)于檢測(cè)過(guò)程中新發(fā)現(xiàn)的等位基因，按上述規(guī)則插入或追加并編號(hào)，原有等位基因編號(hào)可能依次變化，以1和0分別代表檢測(cè)到和未檢測(cè)到相應(yīng)等位基因的方式記錄待檢品種等位基因的帶型。在記錄過(guò)程中，參照標(biāo)準(zhǔn)帶型參照品種和1000bpDNA分子量Marker的擴(kuò)增帶，記錄主要帶型，忽略弱雜帶型，同時(shí)考慮待檢品種間帶型的比對(duì)。9.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)當(dāng)對(duì)送驗(yàn)樣品混合DNA進(jìn)行分析時(shí)，可直接進(jìn)行品種間成對(duì)比較，成對(duì)比較的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)記錄表見(jiàn)附錄D，如果樣品某個(gè)引物位點(diǎn)出現(xiàn)可見(jiàn)的異質(zhì)性且影響到差異位點(diǎn)判定時(shí)，可重新提取至少20個(gè)個(gè)體的DNA，并用該引物重新擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)在該引物位點(diǎn)上不同個(gè)體的基因型（或等位變異）及所占比例。當(dāng)對(duì)送檢樣品多個(gè)個(gè)體DNA進(jìn)行分析時(shí)，應(yīng)統(tǒng)計(jì)其在各引物位點(diǎn)的各種基因型（或等位變異）及所占比例。對(duì)單交種，應(yīng)比較兩個(gè)樣品在各引物位點(diǎn)的基因型；對(duì)自交系，應(yīng)比較兩個(gè)樣品在各引物位點(diǎn)的等位變異。10判定規(guī)則10.1結(jié)果判定10.1.1當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)≥2，判定為“不同”；當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)=l，判定為“近似”；當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)=O，判定為“極近似或相同”。10.1.2對(duì)利用附錄C中40對(duì)引物仍未檢測(cè)到≥2個(gè)差異位點(diǎn)數(shù)的樣品，如果相關(guān)品種存在特定標(biāo)記，必要時(shí)增加其特定標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。510.2結(jié)果表述比較位點(diǎn)數(shù)比較位點(diǎn)為差異位點(diǎn)數(shù)差異位點(diǎn)為判定為：。6（規(guī)范性）主要儀器設(shè)備及試劑A.1主要儀器設(shè)備A.1.1PCR擴(kuò)增儀。A.1.2高壓電泳儀：規(guī)格為3000V、400mA、400W，具有恒電壓、恒電流和恒功率功能。A.1.3垂直電泳槽及配套的制膠附件。A.1.4普通電泳儀。A.1.5水平電泳槽及配套的制膠附件。A.1.6高速冷凍離心機(jī)：最大離心力不小于15000g。A.1.7水平搖床。A.1.8膠片觀(guān)察燈。A.1.9電子天平：感應(yīng)為0.01g，0.001g。A.1.10微量移液器：規(guī)格分別為10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL，連續(xù)可調(diào)。A.1.11磁力攪拌器。A.1.12紫外分光光度計(jì)：波長(zhǎng)260nm、280nm。A.1.13微波爐。A.1.14高壓滅菌鍋。A.1.15酸度計(jì)。A.1.16水浴鍋或金屬?。嚎販鼐取?℃。A.1.17冰箱：最低溫度-20℃。A.1.18制冰機(jī)。A.1.19研磨儀。A.1.20粉碎機(jī)。A.1.21凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀。A.2主要試劑A.2.1除另有說(shuō)明外，所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的要求。A.2.2十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）。A.2.3三氯甲烷。A.2.4異丙醇。A.2.5異戊醇。A.2.6乙二胺四乙酸二鈉。A.2.7三羥甲基氨基甲烷。A.2.8鹽酸3638。A.2.9氫氧化鈉。A.2.10氯化鈉。A.2.1110×Buffer緩沖液：含Mg2+25mmol/L。A.2.124種脫氧核苷三磷酸：dATP、dTTP、dGTP、dCTP(l0mmol/LeachdNTP）。A.2.13TaqDNA聚合酶。A.2.14礦物油。A.2.15瓊脂糖。A.2.16A.2.17核酸染色劑。A.2.18去離子甲酰胺。A.2.19溴酚藍(lán)。A.2.20二甲苯青。A.2.21甲叉雙丙烯酰胺。A.2.22丙烯酰胺。A.2.23硼酸。A.2.24尿素。A.2.25親和硅烷。A.2.26剝離硅烷。A.2.27無(wú)水乙醇。A.2.28四甲基乙二胺。A.2.29過(guò)硫酸銨。A.2.30冰醋酸。A.2.31乙酸銀。A.2.32硝酸銀。A.2.338（規(guī)范性）溶液配制B.1DNA提取溶液的配制B.1.10.5mol/LEDTA溶液186.1gNa2EDTA?2H20溶于800mL水中，用固體氫氧化鈉調(diào)pH至8.0，定容至1000mL，高壓滅菌。B.1.21mol/LTris-HCl溶液60.55gTris堿溶于適量水中，加HCl調(diào)pH至8.0，定容至500mL，高壓滅菌。B.1.30.5mol/LHCl溶液25mL濃鹽酸加水定容至500mL。B.1.4CTAB提取液81.7g氧化鈉和20gCTAB溶于適量水中，然后加人1mol/LTris-HCl100mL,0.5mol/LEDTA40mL，定容至1000mL,4℃貯存。B.1.5SDS提取液1mol/LTris-HCl50mL，0.5mol/LEDTA50mL，5mol/LNaCl50mL，SDS7.5g，定容至500mL。B.1.6TE緩沖液1mol/LTris-HCl5mL，0.5mol/LEDTA1mL，加0.5mol/LHCl調(diào)pH至8.0，定容至500mL。B.1.7氯仿-異戊醇（24:1）三氯甲烷與異戊醇按24:1（V:V）的比例配制混合液。B.1.85mol/L氯化鈉溶液146g固體氯化鈉溶于水中，加水定容至500mL。B.2PCR擴(kuò)增溶液的配制B.2.1dNTP用超純水分別配制dATP、dGTP、dCTP、dTTP4種脫氧核糖核苷酸終濃度100mmol/L的儲(chǔ)存液。各取20μL混合，用超純水720μL定容至終濃度2.5mmol/Leach的工作液。B.2.2SSR引物引物干粉快速離心，用TE緩沖液或超純水分別配制前引物和后引物終濃度均40μmol/L的儲(chǔ)存液,等體積混合成20μmol/L的工作液。B.2.36×加樣緩沖液甲酰胺49mL，0.5mol/L的EDTA溶液（pH=8.0）1mL，溴酚藍(lán)0.125g，二甲苯青0.125g。9B.3變性聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的配制B.3.140％PAGE膠丙烯酰胺190g和甲叉雙丙烯酰胺10g，定容至500mL。B.3.27％PAGE膠尿素450g，10×TBE緩沖液100mL，40％PAGE膠175mL，定容至1000mL。B.3.3Bind緩沖液49.75mL無(wú)水乙醇和250μL冰醋酸，加水定容至50mL。B.3.4親和硅烷工作液在1mLBind緩沖液中加入5μLBind原液，混勻。B.3.5剝離硅烷工作液2％二甲基二氯硅烷。B.3.625％過(guò)硫酸銨溶液0.25g過(guò)硫酸銨溶于lmL超純水中。B.3.710×TBE緩沖液三羥甲基氨基甲烷（Tris堿）108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA溶液37mL，定容至1000mL。B.3.81×TBE緩沖液取10×TBE緩沖液500mL，加水定容至5000mL。B.4銀染溶液的配制B.4.1固定液100mL冰醋酸，加水定容至1000mL。B.4.2染色液稱(chēng)取2g硝酸銀，加水定容至1000mL。B.4.3顯影液量取1000mL蒸溜水，加入30g氫氧化鈉和5mL甲醛，混勻。銀染溶液的配制可使用符合GB/T6682規(guī)定的三級(jí)水。（規(guī)范性）核心引物名單及序列核心引物名單及序列見(jiàn)表C.1。表C.1核心引物名單及序列正向：AGTTGACATCGCCATCTTGGTGAC反向：GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTC正向：CCTCGTTACGGTTACGCTGCTG反向：GATGACCCCGCTTACTTCGTTTATGP03正向：TTACACAACGCAACACGAGGC反向：GCTATAGGCCGTAGCTTGGTAGACACbnlg1940k7正向：CGTTTAAGAACGGTTGATTGCATTCC反向：GCCTTTATTTCTCCCTTGCTTGCC正向：GAAGGGCAATGAATAGAGCCATGAG反向：ATGGACTCTGTGCGACTTGTACCG正向：CCCTGCCTCTCAGATTCAGAGATTG反向：TAGGCTGGCTGGAAGTTTGTTGC正向：GCTCGTCTCCTCCAGGTCAGG反向：CGTTGCCCATACATCATGCCTCP08bnlg2291k4正向：GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG反向：CATAACCTTGCCTCCCAAACCCumc1705w1正向：GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG反向：CACGTACGGCAATGCAGACAAG正向：CCCCTCTTCCTCAGCACCTTG反向：CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTGP11bnlg161k8正向：TCTCAGCTCCTGCTTATTGCTTTCG反向：GATGGATGGAGCATGAGCTTGCbnlg1702k1正向：GATCCGCATTGTCAAATGACCAC反向：AGGACACGCCATCGTCATCAP13正向：AATGCCGTTATCATGCGATGC反向：GCTTGCTGCTTCTTGAATTGCGT正向：GGATGATGGCGAGGATGATGTC反向：CCACCAACCCATACCCATACCAGbnlg240kl正向：GCAGGTGTCGGGGATTTTCTC反向：GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATAC正向：TGAACCACCCGATGCAACTTG反向：TTGATGGGCACGATCTCGTAGTC正向：CGCCTTCAAGAATATCCTTGTGCC反向：GGACCCAGACCAGGTTCCACCP18正向：GCGGAAGAGTAGTCGTAGGGCTAGTGTAG反向：AACCAAGTTCTTCAGACGCTTCAGGPl9正向：GAGAAATCAAGAGGTGCGAGCATC反向：GGCCATGATACAGCAAGAAATGATAAGC表C.1核心引物名單及序列（續(xù)）編號(hào)umc1506k1210.05正向：GAGGAATGATGTCCGCGAAGAAG反向：TTCAGTCGAGCGCCCAACACP21umc1147y41.07正向：AAGAACAGGACTACATGAGGTGCGATAC反向：GTTTCCTATGGTACAGTTCTCCCTCGC1.10正向：CCCGACACCTGAGTTGACCTG反向：CTGGAGGGTGAAACAAGAGCAATGP23phi96100y1正向：TTTTGCACGAGCCATCGTATAACG反向：CCATCTGCTGATCCGAATACCCP24umc1536k92.07正向：TGATAGGTAGTTAGCATATCCCTGGTATCG反向：GAGCATAGAAAAAGTTGAGGTTAATATGGAGCP25bnlg1520K12.09正向：CACTCTCCCTCTAAAATATCAGACAACACC反向：GCTTCTGCTGCTGTTTTGTTCTTGumc1489y33.07正向：GCTACCCGCAACCAAGAACTCTTC反向：GCCTACTCTTGCCGTTTTACTCCTGTbnlg490y44.04正向：GGTGTTGGAGTCGCTGGGAAAG反向：TTCTCAGCCAGTGCCAGCTCTTATTAP28umc1999y34.09正向：GGCCACGTTATTGCTCATTTGC反向：GCAACAACAAATGGGATCTCCGP29umc2115k35.02正向：GCACTGGCAACTGTACCCATCG反向：GGGTTTCACCAACGGGGATAGGP30umc1429y75.03正向：CTTCTCCTCGGCATCATCCAAAC反向：GGTGGCCCTGTTAATCCTCATCTGP31bnlg249k26.01正向：GGCAACGGCAATAATCCACAAG反向：CATCGGCGTTGATTTCGTCAGP32phi299852y26.07正向：AGCAAGCAGTAGGTGGAGGAAGG反向：AGCTGTTGTGGCTCTTTGCCTGTP33umc2160k3正向：TCATTCCCAGAGTGCCTTAACACTG反向：CTGTGCTCGTGCTTCTCTCTGAGTATTP34umc1936k47.03正向：GCTTGAGGCGGTTGAGGTATGAG反向：TGCACAGAATAAACATAGGTAGGTCAGGTCP35bnlg2235y58.02正向：CGCACGGCACGATAGAGGTG反向：AACTGCTTGCCACTGGTACGGTCTP36phi233376y18.09正向：CCGGCAGTCGATTACTCCACG反向：CAGTAGCCCCTCAAGCAAAACATTCP37umc2084w29.01正向：ACTGATCGCGACGAGTTAATTCAAAC反向：TACCGAAGAACAACGTCATTTCAGCP38umc1231k