超微量分光光度計(jì)

分光光度法的定義與應(yīng)用

定義:分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來(lái)鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的分析檢測(cè)技術(shù)。

特點(diǎn):靈敏、精確、快速和簡(jiǎn)便，在復(fù)雜組分系統(tǒng)中，不需要分離，即能檢測(cè)出其中所含的極少量物質(zhì)。

應(yīng)用:生物化學(xué)研究中廣泛使用的方法之一，廣泛用于糖，蛋白質(zhì)，核酸，酶等的快速定量檢測(cè)。

分光光度計(jì)的分類(lèi)分光光度計(jì)的分類(lèi)紫外分光光度計(jì):可見(jiàn)分光光度計(jì):紅外分光光度計(jì):測(cè)定波長(zhǎng)范圍為200～380nm的紫外光區(qū)測(cè)定波長(zhǎng)范圍為380~780nm的可見(jiàn)光區(qū)測(cè)定波長(zhǎng)范圍為大于780nm的紅外光區(qū)

分光光度計(jì)的光譜范圍

包括波長(zhǎng)范圍為380~780nm的可見(jiàn)光區(qū)和波長(zhǎng)范圍為200～380nm的紫外光區(qū)。不同的光源都有其特有的發(fā)射光譜，因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源。

鎢燈的發(fā)射光譜：鎢燈光源所發(fā)出的380～820nm波長(zhǎng)的光譜，光通過(guò)三棱鏡折射后，可得到由紅、橙、黃、綠、藍(lán)、靛、紫組成的連續(xù)色譜；該色譜可作為可見(jiàn)光分光光度計(jì)的光源。

氘燈的發(fā)射光譜：氘燈能發(fā)出190～400nm波長(zhǎng)的光譜，可作為紫外光光度計(jì)的光源。

氙氣閃光燈的發(fā)射光譜：氙燈能發(fā)出200～850nm波長(zhǎng)的光譜，可作為紫外-可見(jiàn)光光度計(jì)的光源。電源體積較小，采用脈沖閃光方式工作，閃光次數(shù)可達(dá)109次，壽命相對(duì)氘燈和鎢燈較長(zhǎng)。

物質(zhì)的吸收光譜

如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液，此時(shí)在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜，它出現(xiàn)了幾條暗線，即光源發(fā)射光譜中某些波長(zhǎng)的光因溶液吸收而消失，這種被溶液吸收后的光譜稱(chēng)為該溶液的吸收光譜。

不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的。因此根據(jù)吸收光譜，可以鑒別溶液中所含的物質(zhì)。

物質(zhì)的吸收光譜

當(dāng)光線通過(guò)某種物質(zhì)的溶液時(shí)，透過(guò)的光的強(qiáng)度減弱。因?yàn)橛幸徊糠止庠谌芤旱谋砻娣瓷浠蚍稚?，一部分光被組成此溶液的物質(zhì)所吸收，只有一部分光可透過(guò)溶液。入射光=反射光＋分散光＋吸收光＋透過(guò)光

如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為“空白”去校正反射、分散等因素造成的入射光的損失，則：入射光

=吸收光

十

透過(guò)光

原理

分光光度計(jì)進(jìn)行樣品濃度測(cè)定的原理是根據(jù)朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律,A=εbc

其中，A——為物質(zhì)的吸光度；

ε——為物質(zhì)的吸光系數(shù)；

b——為光路長(zhǎng)度（光程）；

c——為物質(zhì)的濃度。

上式說(shuō)明了物質(zhì)的吸光度與吸收物質(zhì)的濃度和液層的厚度成正比。吸光度與濃度之間的關(guān)系吸光度與物質(zhì)的濃度成正比

分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)

分光光度計(jì)一般包括5部分：光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和測(cè)量?jī)x表。分光光度計(jì)各部件的次序如圖所示:

K5500微量分光光度計(jì)是一款新型全波長(zhǎng)（200～850nm）微量分光光度計(jì)，可用來(lái)檢測(cè)核酸(A260nm)、蛋白質(zhì)(A280nm,以及試劑盒法)、細(xì)胞溶液、微陣列（基因芯片，同時(shí)檢測(cè)核酸(或蛋白)和熒光染料）樣品以及可以進(jìn)行常規(guī)紫外-可見(jiàn)（200～850nm）全波長(zhǎng)掃描等。K5500微量分光光度計(jì)儀器特點(diǎn)樣品用量少（1～2μL）！無(wú)需比色皿！紫外-可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描（200～850nm）！無(wú)需預(yù)熱，可隨時(shí)檢測(cè)！檢測(cè)速度快！直接顯示濃度值！樣品無(wú)需稀釋?zhuān)蓽y(cè)樣品的濃度范圍是常規(guī)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的50倍！數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件方便容易掌握！與傳統(tǒng)分光光度計(jì)的區(qū)別與優(yōu)勢(shì)傳統(tǒng)分光光度計(jì)

K5500微量分光光度計(jì)●樣品體積要求大，絕大部分要50μL以上●所需樣品體積小，僅需1～2μL●需使用比色皿●不需要比色皿，用移液槍直接將樣品滴加到檢測(cè)平臺(tái)上，測(cè)量時(shí)樣品會(huì)自動(dòng)形成液柱●每次換樣品時(shí)，比色杯需要清洗，工作繁重●只需用干凈的吸水紙將樣品從檢測(cè)平臺(tái)上擦拭干凈即可●光程一般為10mm，樣品需要稀釋?zhuān)瑴y(cè)量濃度范圍小●具有1mm和0.2mm兩個(gè)光程(由電磁閥調(diào)節(jié))，樣品無(wú)需稀釋?zhuān)瑴y(cè)量范圍可達(dá)到常規(guī)分光光度計(jì)的50倍傳統(tǒng)分光光度計(jì)K5500微量分光光度計(jì)●燈源一般由氘燈（紫外）和鎢燈（可見(jiàn)）組成壽命短●氙氣閃光燈為燈源壽命長(zhǎng),性能穩(wěn)定●需要預(yù)熱半個(gè)小時(shí)以上●不需要預(yù)熱，可隨時(shí)檢測(cè)●顯示吸光度值，不顯示濃度值●顯示吸光度值同時(shí)，程序直接給出濃度值（核酸、蛋白和熒光染料）●儀器體積大，質(zhì)量重●體積?。?1cm×17cm×11cm），質(zhì)量輕（1.35kg）與傳統(tǒng)分光光度計(jì)的區(qū)別與優(yōu)勢(shì)性能指標(biāo)

樣品體積要求：1～2μL波長(zhǎng)范圍：200～850nm波長(zhǎng)精度：1nm波長(zhǎng)分辨率：3nm(FWHMatHg546nm)吸光率精確度：0.003Abs吸光率準(zhǔn)確度：1%(0.76吸光率在350nm)吸光率范圍：0.02～75（等效于10mm）儀器外形尺寸：21cm×17cm×11cm儀器重量：1.35kg測(cè)量

在測(cè)量類(lèi)型選項(xiàng)區(qū)選擇正確的測(cè)量類(lèi)型。測(cè)量樣品之前，要先做空白對(duì)照?？瞻讓?duì)照（1）打開(kāi)取樣臂，用移液槍吸取1～2μL樣品溶劑滴加到檢測(cè)平臺(tái)上。（2）合上取樣臂，液柱會(huì)在上下基座之間自動(dòng)形成。（3）點(diǎn)擊測(cè)量功能區(qū)的“Blank”按鈕，軟件會(huì)對(duì)溶劑自動(dòng)進(jìn)行測(cè)量，并自動(dòng)記錄空白值。（4）打開(kāi)取樣臂，用干凈的吸水紙將上下基座上的空白對(duì)照溶劑擦干凈。樣品測(cè)量（1）以移液槍吸取樣品（1～2μL）滴加到檢測(cè)平臺(tái)上。（2）放下取樣臂。（3）點(diǎn)擊軟件界面上的“Measure”按鈕，即可得出樣品參數(shù)（吸光度和濃度）和圖表。（4）以干凈的吸水紙擦去上下檢測(cè)平臺(tái)上的空白對(duì)照用溶劑。（5）如需保存圖表，可點(diǎn)擊“SaveGraph”按鈕。（6）待全部樣品測(cè)定結(jié)束后，點(diǎn)擊“ShowReport”按鈕，已測(cè)樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)將出現(xiàn)在Excel表格中。儀器應(yīng)用范圍K5500型微量分光光度計(jì)可用于測(cè)量：核酸：核酸樣品的濃度和純度，包括雙鏈DNA，單鏈DNA和RNA。蛋白質(zhì)：①A280測(cè)蛋白質(zhì)樣品濃度，包括1Abs=1mg/mL，BSA，IgG，Lysozyme；②試劑盒法（Lowry法、BCA法、Bradford法）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，軟件自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接給出濃度值。常規(guī)紫外/可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描：可進(jìn)行紫外/可見(jiàn)全波長(zhǎng)（200～850nm）掃描。細(xì)胞溶液：細(xì)胞溶液密度的測(cè)定。微陣列樣品：可同時(shí)檢測(cè)