高效液相色譜法操作規(guī)程與注意事項(xiàng)

高效液相色譜法操作規(guī)程與注意事項(xiàng)程序1.1.儀器及性能要求：所用的儀器為高效液相色譜儀，由泵系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，色譜柱，檢測(cè)器和色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。泵系統(tǒng)：HPLC泵系統(tǒng)通過(guò)高壓力管和設(shè)備從溶劑瓶中吸取計(jì)量的流動(dòng)相到柱子中。現(xiàn)行的泵系統(tǒng)有一元或多元計(jì)算機(jī)控制的計(jì)量泵組成，這些泵可以按照梯度洗脫的要求改變流動(dòng)相的比例或者是按等度洗脫的要求混合流動(dòng)相。進(jìn)樣系統(tǒng)：化合物被溶解在流動(dòng)相或合適的溶劑中，可以通過(guò)手動(dòng)進(jìn)樣器或定量環(huán)，或自動(dòng)進(jìn)樣器轉(zhuǎn)移到流動(dòng)相中。自動(dòng)進(jìn)樣器由可存放進(jìn)樣瓶的卡盤(pán)組成，進(jìn)樣瓶的頂部有一個(gè)可以刺入的隔膜，進(jìn)樣針通過(guò)這個(gè)隔膜將樣品轉(zhuǎn)移到一個(gè)定量環(huán)中然后輸送到色譜系統(tǒng)中。色譜柱：最常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠。反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅膠和氨基鍵合硅膠）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統(tǒng)使用離子交換填充劑量；分子排阻色譜系統(tǒng)凝膠或系統(tǒng)高分子多孔微球等；對(duì)映異構(gòu)體的分離通常使用手性柱。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫。檢測(cè)器：常用的檢測(cè)器包括紫外分光檢測(cè)器，示差折光檢測(cè)器，二極管陣列檢測(cè)器。固定波長(zhǎng)檢測(cè)器在單一波長(zhǎng)下運(yùn)行，典型的波長(zhǎng)是254nm,通過(guò)低壓力的汞燈發(fā)射?？勺儾ㄩL(zhǎng)的檢測(cè)器包含持續(xù)的能源，例如氘燈或高壓力氙燈，通過(guò)單色器或干涉過(guò)濾器產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的單色光。1.2.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)1.2.1.為了確定最終運(yùn)行系統(tǒng)的有效性，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。整個(gè)系統(tǒng)可以用以下指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)：信噪比、理論塔板數(shù)，分離度，重復(fù)性，拖尾因子，其指標(biāo)及計(jì)算方法應(yīng)在相關(guān)分析方法中予以規(guī)定，如果沒(méi)有專門的規(guī)定，按以下方法進(jìn)行計(jì)算：信噪比：用于評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)檢測(cè)微量物質(zhì)的能力，美國(guó)藥典的計(jì)算公式：S/N=2H/h,H為峰頂?shù)交€的距離，h為基線中噪聲峰最大值與最小值的差，該段基線需取A5倍半峰高寬的距離，如果有可能，目標(biāo)峰兩側(cè)取相等的距離（如圖1）。美國(guó)藥典規(guī)定：定量限測(cè)定時(shí)，信噪比S/N>10；檢測(cè)限測(cè)定時(shí)，信噪比S/N>2或S/N>3。中國(guó)藥典規(guī)定：定量限測(cè)定時(shí)，信噪比S/N>10；檢測(cè)限測(cè)定時(shí)，信噪比S/N>3。

(tR/W)2,當(dāng)用電子積分時(shí)，可能通過(guò)以下公式計(jì)算：N=5.54*(tR/Wh/22。tR為物質(zhì)保留時(shí)間，W、Wh/2分別為物質(zhì)的峰寬和半高峰寬。中國(guó)藥典中兩個(gè)公式均可用，且中國(guó)藥典和美國(guó)藥典均規(guī)定：當(dāng)測(cè)定結(jié)果存在爭(zhēng)議時(shí)，色譜柱的理論塔板數(shù)以峰寬的計(jì)算結(jié)果為準(zhǔn)。? 分離度：用于評(píng)價(jià)待測(cè)組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標(biāo)。兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度，美國(guó)藥典的計(jì)算公式：R=2*(tR2-tR1)/(W]+W2),當(dāng)用電子積分時(shí)，可能通過(guò)以下公式計(jì)算：R=1.18*(tR2-tR1)/(W1h/2+W2h/2)。tR1為相鄰兩色譜中前一峰的保留時(shí)間,tR2為相鄰兩色譜中后一峰的保留時(shí)間，tR2>tR1。W1，W2和W]h/2和W2h/2分別為相鄰兩物質(zhì)的峰寬和半高峰寬(如圖2)。中國(guó)藥典中兩個(gè)公式均可用，規(guī)定：當(dāng)測(cè)定結(jié)果存在爭(zhēng)議時(shí)，色譜柱分離度以峰寬的計(jì)算結(jié)果為準(zhǔn)。除另有規(guī)定外，待測(cè)物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間分離度應(yīng)大于1.5。?重復(fù)性：為了充分驗(yàn)證系統(tǒng)的精密度，可以在樣品進(jìn)樣之前以及穿插在樣品進(jìn)樣中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)試液的重復(fù)進(jìn)樣。>一般要求根據(jù)USPv621>規(guī)定，對(duì)用于含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)溶液或其他標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣分析，比較結(jié)果來(lái)確認(rèn)精密度是否符合要求。連續(xù)進(jìn)樣5次，除在方法中已明確規(guī)定外，其峰面積測(cè)量值RSDS2.0%。如果5針的RSD>2.0%，可連續(xù)進(jìn)樣6針,其峰面積測(cè)量值的RSDS2.0%。對(duì)于雜質(zhì)檢測(cè)，除非另有規(guī)定，要求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于10.0%。>EP藥典關(guān)于含量檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差所允許的最大值規(guī)定：表中B%：規(guī)定的限度上限減去100%。進(jìn)樣次數(shù)3456B%最大允許的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.00.410.590.730.852.50.520.740.921.063.00.620.891.101.27?拖尾因子：描述峰的對(duì)稱性，完美對(duì)稱的峰托尾因子是1,拖尾越明顯其數(shù)值會(huì)增大。在某些情況下，托尾因子小于1。峰的不對(duì)稱增加，積分及精確度都會(huì)變差。美國(guó)藥典中的計(jì)算公式：As=W0.05%/2f，W0.05%為5%峰高處的峰寬，f為峰頂在5%峰高處橫坐標(biāo)平行線的投影點(diǎn)至峰前沿與此平行線交點(diǎn)的距離（如圖3）。中國(guó)藥典中也用此公式且規(guī)定：以峰高作定量參數(shù)時(shí)，除另有規(guī)定外，測(cè)定的T應(yīng)在0.95~1.05之間。以峰面積作定量參數(shù)時(shí)，一般的峰拖尾或前伸不會(huì)影響峰面積積分，但嚴(yán)重拖尾會(huì)影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準(zhǔn)如果為了滿足系統(tǒng)適用性要求，各個(gè)運(yùn)行條件作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整是必要的，但不能根本地修改方法，必須考慮各個(gè)條件的最大改變值。為了滿足系統(tǒng)適用性要求進(jìn)行色譜系統(tǒng)的調(diào)整并不是為了彌補(bǔ)柱子的失效或者是系統(tǒng)的功能失常。多種改變可能會(huì)對(duì)系統(tǒng)行為有累積效果，在執(zhí)行時(shí)應(yīng)當(dāng)詳細(xì)的考慮。流動(dòng)相的pH：緩沖溶液的pH有土0.2個(gè)單位的波動(dòng)或指定范圍調(diào)整，適用于梯度分離和等度分離。緩沖鹽的濃度：在滿足pH變化的情況下，緩沖鹽的濃度可有±10%的波動(dòng)。適用于梯度分離和等度分離。流動(dòng)相組分的比例：下列的調(diào)整限度適用于流動(dòng)相中的次要組分（三50%）。這些組分相對(duì)含量可以有±30%的波動(dòng)。然而，任何組分的絕對(duì)含量不可以超過(guò)±10%的波動(dòng)。在三元混合溶液中，可以對(duì)一種次要組分進(jìn)行調(diào)整。下列給出了二元和三元混合溶液的調(diào)整。二元混合溶液：指定混合比例50：50---50的30%是15%，但是超過(guò)了絕對(duì)含量只有±10%的波動(dòng)。因此，流動(dòng)相的比例只能在40：60-60：40內(nèi)波動(dòng)。指定混合比例2：98---2的30%為0.6%，因此允許的變化比例為1.4：98.6-2.6：97.4三元混合溶液指定混合比例60：35：5---對(duì)于第二種組分，35的30%為10.5%，超過(guò)了絕對(duì)含量只有±10%波動(dòng)的限度。因此第二種組分可調(diào)整的范圍在25%-45%。對(duì)于第三種組分，5的30%為1.5%。在所有的情況中，第一種組分有足夠的數(shù)量滿足100%的要求。因此，混合比例50：45：5-70：25：5或58.5-35-6.5-61.5：35：3.5。?可見(jiàn)紫外波長(zhǎng)檢測(cè)器：不允許背離方法中指定的波長(zhǎng)。檢測(cè)器廠商指定的規(guī)程或者另外經(jīng)驗(yàn)證的規(guī)程，用來(lái)驗(yàn)證檢測(cè)器波長(zhǎng)的誤差在±3nm內(nèi)。柱長(zhǎng)：看粒徑柱內(nèi)徑：如果線速度保持不變是可以調(diào)整的，看流速。粒徑：對(duì)于等度分離來(lái)說(shuō)，粒徑或柱長(zhǎng)可以修改，條件是柱長(zhǎng)（L）和粒徑（dp）的比例保持不變或在規(guī)定柱長(zhǎng)（L）和粒徑（dp）比例的-25%至50%內(nèi)修改。另外（只要粒徑的改變適用于表面多孔粒徑），其他L和dp的組合也能用，條件是柱理論塔板數(shù)（N）的變化在-25%至+50%內(nèi)。需要小心的是這種調(diào)整會(huì)導(dǎo)致更高的理論塔板數(shù)，會(huì)產(chǎn)生更小峰體積，這樣可能要求通過(guò)儀器泵、檢測(cè)器單元體積、采樣率和進(jìn)樣體積來(lái)使附加柱的譜帶增寬降至最小。如果個(gè)論中沒(méi)有提及粒徑，這比例的計(jì)算必須利用USP中定義的柱最大粒徑的大小。對(duì)于梯度分離來(lái)說(shuō)，改變長(zhǎng)度、柱內(nèi)徑和粒徑是不允許的。流速：當(dāng)粒徑改變了，流速也需要調(diào)整，因?yàn)楦〉念w粒柱需要更高的線速度來(lái)滿足同樣的性能（通過(guò)減少塔板高度來(lái)衡量）。流速改變由柱內(nèi)徑和粒徑?jīng)Q定：F二Fxl（dc2xdp）/（de2xdp）」212112式中：F］、F2——分別是初始和更改后的流速；dc「dc2 分別是初始和更改后柱內(nèi)徑；dp】、dp2 分別是初始和更改后粒徑。在等度分離中當(dāng)粒徑從＞3^m改至v3ym,在柱效降低不超過(guò)20%的條件下，可以增加線速度（通過(guò)改變流速）。相似地，從＜3pm改至》pm需要另外減低線速度（流速）來(lái)避免柱效降低超過(guò)20%。在梯度分離中，改變F、dc和dp的是不允許的。另外，流速可以調(diào)整±50%（僅等度）。例如：可以對(duì)柱長(zhǎng)、內(nèi)徑、粒徑和流速的組合調(diào)整來(lái)得到相等的條件（相同的N）,但會(huì)形成不同的壓力和運(yùn)行時(shí)間。以下表格列出了常用柱的一些配置通過(guò)這些變量的調(diào)整得到相同的效果（N）。長(zhǎng)度（L，mm）柱徑(de,mm)粒徑(dp,pm)相關(guān)變量L/dp流速F理論塔板數(shù)N壓力運(yùn)行時(shí)間2504.610250000.50.80.23.31504.65300001.01.01.01.01502.15300000.21.01.01.01004.63.5286001.41.01.90.51002.13.5286000.31.01.90.5754.62.5300002.01.04.00.3752.12.5300000.41.04.00.3504.61.7294002.91.08.50.1502.11.7294000.61.08.50.1例如，如果在個(gè)論中指定一根柱子150mmx4.6mm,5pm在1.5ml/min條件下操作，用一根75mmx2.1mm,2.5um的柱子在1.5ml/minx0.4=0.6ml/min條件下操作也可能達(dá)到一樣的分離。?進(jìn)樣體積：進(jìn)樣體積可以盡可能的調(diào)整直到精度、線性和檢測(cè)限能夠滿足。注意過(guò)多的進(jìn)樣體積能導(dǎo)致不可接受的譜帶增寬，引起N的減少和分離。適用于梯度分離和等度分離。?柱溫（HPLC）：調(diào)整±10°C。推薦使用柱溫箱來(lái)提咼控制柱溫和保留時(shí)間的重復(fù)性。適用于梯度分離和等度分離。測(cè)定方法1.3.1.內(nèi)標(biāo)法按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱取對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測(cè)量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積，按下式計(jì)算校正因子校正因子（f）=（AS/CS）/（AR/CR）式中AS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積,Ar為對(duì)照品的峰面積,CS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度,Ar為對(duì)照品的濃度。再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液,注入儀器,記錄色譜圖,測(cè)量供試品中待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積,按下式計(jì)算含量含量（Cx）=f*Ax/（A's/C's）式中，Ax為供試品峰面積，Cx為供試品的濃度，A's為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積,C's為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度，f為校正因子。采用內(nèi)標(biāo)法，可避免因樣品前處理或進(jìn)樣體積誤差對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。1.3.2.外標(biāo)法按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱取對(duì)照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品溶液和供試品溶液中待測(cè)成分的峰面積，按下式計(jì)算含量：Cx=CR*Ax/ARCx——試樣中待測(cè)成分的濃度xCR——對(duì)照品溶液中待測(cè)成分的濃度Ax 試樣中待測(cè)成分的峰面積xAr――對(duì)照品溶液中待測(cè)成分的峰面積加校正因子的主成分自身對(duì)照法?測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，可采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法。在建立方法時(shí)，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱取雜質(zhì)對(duì)照品和待測(cè)組分對(duì)照品各適量，配制成測(cè)定雜質(zhì)校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按以下公式計(jì)算待測(cè)物的校正因子：校正因子=（cA/aA）/（CB/AB）CA——待測(cè)物的濃度AA——待測(cè)物的峰面積CB——參比物質(zhì)的濃度AB——參比物質(zhì)的峰面積也可精密稱取主成分對(duì)照品和雜質(zhì)對(duì)照品各適量，分別配制成不同濃度的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖。繪制主成分濃度和雜質(zhì)濃度對(duì)其峰面積的回歸曲線，以主成分回歸直線率與雜質(zhì)直線斜率的比計(jì)算校正因子。此校正因子可直接載入各品種項(xiàng)下，用于校正雜質(zhì)的實(shí)測(cè)峰面積。這些需作校正計(jì)算的雜質(zhì)，通常以主成分為參照，采用相對(duì)保留時(shí)間定位。其數(shù)值一并載入各品種項(xiàng)下。?測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷?duì)照溶液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度（以噪聲水平可接受為限）或進(jìn)樣量（以柱子不過(guò)載為限），使對(duì)照溶液的主成分色譜峰的峰高約達(dá)滿量程的10%~25%或其峰面積能準(zhǔn)確積分［通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于10%；含量在0.5%~2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于5%；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于2%］。然后，取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，分別進(jìn)樣，供試品溶液的記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時(shí)間的2倍，測(cè)量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，依法計(jì)算各雜質(zhì)含量。不加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，若沒(méi)有雜質(zhì)對(duì)照品，也可采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法。同上述1.3.3法配制對(duì)照溶液并調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度后，取供試品溶液和對(duì)照溶液適量，分別進(jìn)樣，前者的記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時(shí)間的2倍，測(cè)量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算雜質(zhì)含量。若供試品所含的部