《RNAi綜述完整》課件

RNAi綜述中科院植物研究所陳寧1精選課件ppt

摘要

雙鏈RNA介導的遺傳干擾的機制是1998年發(fā)現(xiàn)的。它通過雙鏈RNA的介導特異性的降解相應(yīng)序列的mRNA，從而導致轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。2精選課件ppt到目前為止在真菌、擬南芥、線蟲、錐蟲、果蠅、小鼠、斑馬魚等真核生物中都發(fā)現(xiàn)存在這一基因沉默機制。目前的研究表明，RNA干擾與植物中的共抑制、真菌中的基因壓制很可能具有共同的基本分子機制。RNA干擾對于抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動等具有重要作用，對于生物體的發(fā)育和基因調(diào)控可能也有重要作用。3精選課件ppt1.RNA干擾的發(fā)現(xiàn)

1995年，康乃爾大學的SuGuo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲(C.elegans)的par-1基因時，發(fā)現(xiàn)了一個意想不到的現(xiàn)象。她們本想利用反義RNA技術(shù)特異性地阻斷上述基因的表達，而同時在對照實驗中給線蟲注射正義RNA以期觀察到基因表達的增強，但得到的結(jié)果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達途徑。這是與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。該研究小組一直未能給這個意外以合理解釋。4精選課件ppt1998年，華盛頓卡耐基研究院的Fire和麻省大學醫(yī)學院的Mello首次在秀麗新小桿線蟲中證明上述現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。他們發(fā)現(xiàn)SuGuo博士遇到的正義RNA抑制基因表達的現(xiàn)象，以及過去的反義RNA技術(shù)對基因表達的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。當他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達，其抑制基因表達的效率比純化后的反義RNA至少高2個數(shù)量級。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾。5精選課件ppt安德魯·法爾（AndrewFire,1959—

），美國科學家、生物醫(yī)學家。1959年出生于美國，1983年獲美國麻省理工學院生物學博士學位。1998年，他和美國馬薩諸塞大學醫(yī)學院教授克雷格·梅洛在《自然》雜志上共同發(fā)表論文，稱他們發(fā)現(xiàn)了RNA具有可以干擾基因的機制。因在RNA（核糖核酸）干擾機制方面的突出貢獻，他倆一起獲得了2006年度諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。安德魯·法爾現(xiàn)任斯坦福醫(yī)學院病理學和遺傳學教授。

6精選課件ppt克雷格·梅洛（CraigC.Mello,1960年—），美國馬薩諸塞州大學醫(yī)學院分子醫(yī)學教授。2006年因與斯坦福醫(yī)學院病理學和遺傳學教授安德魯·法厄發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象而共同獲得2006年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

克雷格·梅洛出生于1960年，美國公民，1990年獲得哈佛大學的生物學博士學位，現(xiàn)任馬薩諸塞州醫(yī)學院分子醫(yī)學教授。

7精選課件ppt2.RNA干擾的作用機制

當病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內(nèi)，并利用宿主細胞進行轉(zhuǎn)錄時，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應(yīng)，其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA（大約21～23bp），即siRNA。siRNA在細胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。8精選課件pptRISC與外源性基因表達的mRNA的同源區(qū)進行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應(yīng)。siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。9精選課件ppt10精選課件ppt11精選課件ppt3.RNA干擾現(xiàn)象具有以下幾個重要的特征

①RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制；②RNAi具有很高的特異性，只降解與之序列相應(yīng)的單個內(nèi)源基因的mRNA；③RNAi抑制基因表達具有很高的效率，表型可以達到缺失突變體表型的程度，而且相對很少量的dsRNA分子(數(shù)量遠遠少于內(nèi)源mRNA的數(shù)量)就能完全抑制相應(yīng)基因的表達，是以催化放大的方式進行的；

12精選課件ppt④RNAi抑制基因表達的效應(yīng)可以穿過細胞界限，在不同細胞間長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳等特點;⑤dsRNA不得短于21個堿基，并且長鏈dsRNA也在細胞內(nèi)被Dicer酶切割為21bp左右的siRNA，并由siRNA來介導mRNA切割。而且大于30bp的dsRNA不能在哺乳動物中誘導特異的RNA干擾，而是細胞非特異性和全面的基因表達受抑和凋亡；⑥ATP依賴性：在去除ATP的樣品中RNA干擾現(xiàn)象降低或消失顯示RNA干擾是一個ATP依賴的過程。13精選課件ppt

3.RNA干擾的應(yīng)用

3.1研究基因功能的新工具

由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具。已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢，近來RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型的報道日益增多，標志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。14精選課件ppt3.2病毒性疾病的治療

加州大學洛杉磯分校和加州理工學院的研究人員開發(fā)出使用RNAi技術(shù)來阻止艾滋病病毒進入人體細胞。這個研究小組設(shè)計合成的lenti病毒載體引入siRNA，激發(fā)RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5進入人體外周Ｔ淋巴細胞，而不影響另一種HIV-1主要的coreceptor-CCR4，從而使以lenti病毒載體為媒介引導siRNA進入細胞內(nèi)產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，由此治療HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。

15精選課件pptRNAi還可應(yīng)用于其它病毒感染如脊髓灰質(zhì)炎病毒等，siRNA已證實介導人類細胞的細胞間抗病毒免疫，用siRNA對Magi細胞進行預(yù)處理可使其對病毒的抵抗能力增強。16精選課件ppt在全世界約30個國家和地區(qū)散發(fā)或流行的嚴重急性呼吸綜合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)的防治研究中，RNAi也受到了重視。17精選課件pptsiRNA在感染的早期階段能有效地抑制病毒的復制，病毒感染能被針對病毒基因和相關(guān)宿主基因的siRNA所阻斷，這些結(jié)果提示RNAi能勝任許多病毒的基因治療，RNAi將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對于許多嚴重的動物傳染病的防治具有十分重大的意義。18精選課件ppt

3.3遺傳性疾病的治療

美國西北大學的CarthewRW和日本基因研究所的IshizukaA等人發(fā)現(xiàn)RNAi同脆性Ｘ染色體綜合征（與FMR-1基因異常有關(guān)的導致智力低下的染色體?。┲g的關(guān)系密切，揭示了與RNAi相關(guān)機制的缺陷可能導致人類疾病的病理機制。遺傳性疾病的RNAi治療成為當今研究RNAi的又一大熱點。19精選課件ppt3.4腫瘤病的治療

腫瘤是多個基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計針對這一區(qū)段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個基因同時剔除的表現(xiàn)，也可以同時注射多種dsRNA而將多個序列不相關(guān)的基因同時剔除。Maen等應(yīng)用R