真核細(xì)胞培養(yǎng)中的常見問題及其解決方案

真核細(xì)胞培養(yǎng)中的常見問題及其解決方案在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中，真核細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)至關(guān)重要的技術(shù)。然而，這一過程中常常會(huì)遇到各種挑戰(zhàn)和問題，這些問題可能會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖和功能。本文將探討真核細(xì)胞培養(yǎng)中常見的幾個(gè)問題，并提供相應(yīng)的解決方案，以幫助研究人員更好地掌握細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，提高實(shí)驗(yàn)效率。1.細(xì)胞培養(yǎng)不貼壁可能原因①胰蛋白酶消化過度②支原體污染③培養(yǎng)液中無貼壁因子解決方法①縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度②分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體③清潔支架和培養(yǎng)箱2.培養(yǎng)液PH變化過快可能原因①CO2張力不對(duì)②培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊③NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足④培養(yǎng)液中鹽濃度不正確⑤細(xì)菌、酵母或真菌污染解決方法①按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對(duì)應(yīng)CO2濃度為5％到10％②改用不依賴CO2培養(yǎng)液。松開瓶蓋1/4圈③加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度④在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle’s鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hank’s鹽配制的培養(yǎng)液⑤丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌3.細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢可能原因①更換了不同培養(yǎng)液或血清②試劑保存不當(dāng)③培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染④培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分如谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子耗盡或缺乏或已被破壞解決方法①比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分②比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)③增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度④換入新鮮配制培養(yǎng)液，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液⑤補(bǔ)加谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子⑥用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄⑦用抗生素除菌4.細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)死亡可能原因①培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2②培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大③細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷④培養(yǎng)液滲透壓不正確⑤培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積解決方法①檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)CO2②檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度③取新的保存細(xì)胞種④檢測(cè)培養(yǎng)液滲透壓注意：大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能耐受滲透壓為260–350mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。5.黑膠蟲污染黑膠蟲污染常在培養(yǎng)條件改變、細(xì)胞接種密度降低、細(xì)胞狀態(tài)不佳時(shí)顯現(xiàn)，尤其在凍存細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)可造成大量細(xì)胞死亡。感染黑膠蟲細(xì)胞的表現(xiàn)：①細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)的旺盛，小黑點(diǎn)會(huì)越來越少，反之則多②可以穿透濾膜，也可以通過細(xì)胞培養(yǎng)箱空氣進(jìn)行污染③換掖沖洗后也無多大作用④低倍鏡下觀察為黑色點(diǎn)狀，高倍鏡（400X）下作不規(guī)則布朗運(yùn)動(dòng)解決方法①體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)更換好一點(diǎn)的血清②如果是貼壁細(xì)胞的話，可用無菌的PBS洗幾次，可一定程度上緩解。若是懸浮的話，可以向其中少加一點(diǎn)滋養(yǎng)細(xì)胞（從小鼠腹腔內(nèi)取的巨噬細(xì)胞），加滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)有黑膠蟲的剛復(fù)蘇的細(xì)胞很有一定作用③在換液前先加入生理鹽水并輕輕拍打，沖洗干凈后再加入細(xì)胞培養(yǎng)液，堅(jiān)持天天洗，細(xì)胞傳代時(shí)加生理鹽水再離心一次，稍微加大接種密度，一段時(shí)間后，黑膠蟲數(shù)目會(huì)顯著減少④環(huán)丙沙星+哌拉西林，各10ug/ml，選擇片劑，1.5一盒/6片，每片含環(huán)丙沙星0.25g，磨成粉，PBS溶解，稀釋到適當(dāng)濃度，過濾，4度保存。哌拉西林用的注射粉劑，2.5g/瓶，溶解到相