圖1高效液相色譜儀的系統(tǒng)流程圖原理

高效液相色譜儀制作人：何朦朦組員：沈夏潔周天逸吳方威

高效液相色譜儀的原理原理基本結(jié)構(gòu)特點(diǎn)應(yīng)用使用注意事項(xiàng)高效液相色譜儀的系統(tǒng)流程圖如圖1所示。圖1高效液相色譜儀的系統(tǒng)流程圖原理優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用使用注意事項(xiàng)由流程圖可以看出系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相,被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相)

內(nèi),由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別,被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出,通過檢測(cè)器時(shí),樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來?；窘Y(jié)構(gòu)原理優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用使用注意事項(xiàng)基本結(jié)構(gòu)混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相之間會(huì)發(fā)生吸附、溶解或其他親和作用，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的遷移速度不同得到分離石油醚碳酸鈣顆粒色素玻璃柱高效液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)原理基本結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用使用注意事項(xiàng)貯液器脫氣器高壓泵進(jìn)樣器色譜柱檢測(cè)器原理基本結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用使用注意事項(xiàng)貯液器是用于存放溶劑的裝置。貯液器中的溶劑必須很純，貯液器材料要耐腐蝕，對(duì)溶劑呈惰性，一般情況下通常采用1升~2升的大容量玻璃瓶，也可采用不銹鋼制成的容器，貯液器應(yīng)配有溶劑過濾器，以防止流動(dòng)相中的顆粒進(jìn)入泵內(nèi)，溶劑過濾器一般用耐腐蝕的鎳合金制成，孔隙大小一般為2μm。貯液器原理基本結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用使用注意事項(xiàng)脫氣的目的是為了防止流動(dòng)相從高壓柱內(nèi)流出時(shí)釋放出氣泡進(jìn)入檢測(cè)器而使噪聲劇增，至使不能正常檢測(cè)，一般情況下通常采用氦氣鼓泡來驅(qū)除流動(dòng)相中溶解的氣體，因?yàn)楹庠诟鞣N液體中的溶解度極低，所以必須先用氯氣快速清掃溶劑數(shù)分鐘，然后再使氦氣以極小流量不斷流過此溶劑。脫氣器原理基本結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用使用注意事項(xiàng)泵應(yīng)耐壓、耐腐蝕、密封性好。高壓泵主要用于輸送流動(dòng)相，其壓力一般為幾兆帕至數(shù)十兆帕。這是液體的黏度比氣體大100倍，同時(shí)由于固定相的顆粒極細(xì)，柱內(nèi)壓降大，為保證一定的流速，必須借助高壓迫使流動(dòng)相通過柱子。高壓泵應(yīng)無脈動(dòng)或脈動(dòng)極小，以保證輸出的流動(dòng)相具有恒定的流速，同時(shí)采用脈動(dòng)阻尼裝置可將產(chǎn)生的脈動(dòng)除去，使流動(dòng)相的流量變動(dòng)范圍不宜超過2%~3%。高壓泵主要分為恒壓泵、恒流泵和螺旋傳動(dòng)注射泵三類。高壓泵原理基本結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用使用注意事項(xiàng)高效液相色譜儀進(jìn)樣器普遍使用高壓進(jìn)樣閥，用微量注射器將樣品注入樣品環(huán)管，使用的樣品環(huán)管分別有不同的尺寸，可根據(jù)分析要求選用。當(dāng)進(jìn)樣閥手柄放在吸液位置時(shí)，流動(dòng)相直接通過孔的通路流向色譜柱，樣品通過注射器從另外的位置進(jìn)入樣品環(huán)管，如果有過量的樣品則會(huì)從出口孔排出，然后將手柄轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位置，此時(shí)流動(dòng)相便將樣品帶進(jìn)了柱子。進(jìn)樣器原理基本結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用使用注意事項(xiàng)色譜柱是整個(gè)色譜系統(tǒng)的心臟，它的質(zhì)量優(yōu)劣直接影響到分離的效果，一般情況下色譜柱通常采用優(yōu)質(zhì)不銹鋼管制成，并且柱內(nèi)壁必須光潔平滑，否則內(nèi)壁的縱向溝痕和表面多孔性也會(huì)引起譜帶的展寬，柱接頭的體積應(yīng)盡可能小，柱長一般為10cm~25cm，內(nèi)徑4mm~5mm。若使用直徑為5μm~10μm固定相顆粒，理論塔板可達(dá)到5×104/m。尺寸排阻色譜柱的內(nèi)徑通常大于5mm，制備色譜柱則會(huì)更大；為了減少溶劑用量，可采用微徑柱，內(nèi)徑為1mm，長度為30mm~75mm，若采用3μm顆粒，理論塔板數(shù)高達(dá)1×105/m。為了保護(hù)分析柱不被污染，有時(shí)需在分析柱前加一短柱，約數(shù)厘米長，此柱稱為衛(wèi)柱，為了防止衛(wèi)柱過分增加柱阻力，在衛(wèi)柱中使用的顆粒大小約為10μm~30μm色譜柱原理基本結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用使用注意事項(xiàng)高效液相色譜儀常用的檢測(cè)器有紫外吸收、示差折光率、熒光和安培檢測(cè)器等，對(duì)它們的要求和性能指標(biāo)與氣相色譜檢測(cè)儀基本相同。檢測(cè)器主要分為紫外吸收檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器和示差檢測(cè)器。檢測(cè)器高效液相色譜儀的優(yōu)點(diǎn)原理基本結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用使用注意事項(xiàng)高壓——壓力可達(dá)150～300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。高速——流速為0.1～10.0mL/min。高效——塔板數(shù)可達(dá)5000/米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。高靈敏度——紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：

速度快——通常分析一個(gè)樣品在15～30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。

分辨率高——可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。

靈敏度高——紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。

色譜柱可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。

樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。高效液相色譜儀的應(yīng)用原理基本結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用使用注意事項(xiàng)

高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液,不受樣品揮發(fā)性的限制,流動(dòng)相可選擇的范圍寬,固定相的種類繁多,因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合,HPLC所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度,使分離和同時(shí)測(cè)定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能,能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展,有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離。

HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機(jī)分析等各種領(lǐng)域。高效液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個(gè)重要的發(fā)展方向。

液相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)受到普遍重視,如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等;液相色譜-紅外光譜連用也發(fā)展很快,如在環(huán)境污染分析測(cè)定水中的烴類,海水中的不揮發(fā)烴類,使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。高效液相色譜儀的使用注意事項(xiàng)原理基本結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用使用注意事項(xiàng)1熟悉設(shè)備2設(shè)備易出現(xiàn)的問題3正確的實(shí)驗(yàn)步驟4其他應(yīng)注意的問題1熟悉設(shè)備完全的了解設(shè)備可以避免因操作失誤而導(dǎo)致儀器損壞，有利于對(duì)儀器進(jìn)行保養(yǎng)，高效液相重在保養(yǎng)。新購入設(shè)備，廠家的技術(shù)人員負(fù)責(zé)進(jìn)行安裝、調(diào)試，這時(shí)候，負(fù)責(zé)高效液相檢驗(yàn)的化驗(yàn)員最好選擇一種藥物，進(jìn)行完整的演練，這樣印象深刻，省得以后的很多不確信。另外，最好在調(diào)試的時(shí)候由化驗(yàn)員自己重新安裝一下工作站，因?yàn)樵谝院蟮墓ぷ髦锌赡軙?huì)損壞工作站，到時(shí)候再打電話咨詢就很難說得明白了，并且最好完整記錄下安裝的步驟。2設(shè)備易出現(xiàn)的問題高效液相色譜儀主要由四大部分組成：柱溫箱(包括進(jìn)樣閥)、高壓輸液泵、檢測(cè)器、工作站。（1）柱溫箱及進(jìn)樣閥容易出現(xiàn)的問題是：溫控儀失靈，不能正確控制柱溫箱的溫度，這時(shí)只要更換一下溫控儀就可以了，溫控儀只在各樣品系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中有溫控要求時(shí)應(yīng)用，如果無要求，就不必開啟；漏液，如發(fā)現(xiàn)對(duì)照品和樣品的出峰時(shí)間都不規(guī)律，而且每次的出峰面積也差別很大，根本無法對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量，這時(shí)候需要檢查色譜柱和各金屬細(xì)管的連接處，可能是連接處的塑料套因連接時(shí)未按要求而變形了，因其一旦變形就沒法修復(fù)，所以換一個(gè)新的，按要求套上即可。（2）高壓輸液泵容易出現(xiàn)的問題是：①壓力升不上去：檢查一下桌面上是否有漏下的液滴，如果有擰緊漏液處即可。②壓力過高：看一下抽取流動(dòng)相的塑料管里是否有氣泡，如果有，則按一下Stop，這時(shí)候千萬別抽氣泡，等壓力降下來，最好到0Psi，這時(shí)候抽出氣泡。如果在過高的壓力下抽氣泡，后果會(huì)非常嚴(yán)重，流通池會(huì)被鼓破，無法分析樣品，并且會(huì)給你帶來很多困惑，當(dāng)然如果有經(jīng)驗(yàn)的話會(huì)及時(shí)發(fā)現(xiàn)，因?yàn)榱魍ǔ仄屏撕髸?huì)流出藍(lán)色的墨水樣的液體。（3）檢測(cè)器容易出現(xiàn)的問題：①流通池：以上已經(jīng)提過了，如果流通池破了，則需要及時(shí)更換。②氘燈：氘燈的壽命一般為2000h，如果檢測(cè)器打不開了，則說明氘燈超過其使用期限，需要更換了。在日常檢測(cè)中，一般在進(jìn)樣品之前開啟檢測(cè)器，樣品分析完畢，及時(shí)關(guān)閉檢測(cè)器，這樣可以延長其使用年限，避免不必要的浪費(fèi)。（4）工作站容易出現(xiàn)的問題：安裝工作站的電腦一般不要進(jìn)行其他的工作，一旦出現(xiàn)問題，則需重新安裝。3正確的實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟包括樣品的處理和流動(dòng)相的配制。（1）樣品的配制：嚴(yán)格按照樣品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)配制，樣品最好現(xiàn)配先做，不要擱置，以防樣品分解，導(dǎo)致含量變小。（2）流動(dòng)相的配制：流動(dòng)相最好現(xiàn)配先用，尤其含鹽量高的流動(dòng)相。流動(dòng)相的抽濾需要注意：如果流動(dòng)相中含有機(jī)溶劑，則需要用有機(jī)系濾膜，若使用水系濾膜，則濾膜會(huì)被溶解入流動(dòng)相，流動(dòng)相只能廢掉。如果流動(dòng)相不含有機(jī)溶劑則需要用水系濾膜，若用有機(jī)