凝膠成像及Quantity-One使用說明

GelDocTMXRTheDiscoverySeriesQuantityOne?1-DAnalysisSoftware使用說明書昆明友寧科技2008年9月儀器各組成局部介紹鏡頭及濾光片位控制面板紫外透射平臺鏡頭及濾光片位控制面板紫外透射平臺II控制面板UniversalHood電源開關〔ChemiDoc另有鏡頭開關〕III反面開關及保險絲UniversalHood電源開關〔ChemiDoc另有鏡頭開關〕GelDoc鏡頭ChemiDoc鏡頭濾光片選擇桿GelDoc鏡頭ChemiDoc鏡頭濾光片選擇桿VUniversalHood內(nèi)頂部圖像采集用成像儀自帶的熒光標尺和帶刻度的透明塑料板，參照后文GelDocXR成像的方法，按紫外透射、白光透射以及側(cè)面白光三種模式分別采集一次圖像。要求成像清晰、明暗適中。凝膠切割將抽屜式紫外透射平臺完全拉開至最大，將待切割的樣品放置其上。安裝上有機玻璃保護屏，翻開“TransUV”和“PrepUV”。操作者戴上手套，站在保護屏后進行切膠操作。考前須知：安裝ChemiDocXRS的圖像采集卡時，要先安裝其驅(qū)動程序，再將圖像采集卡插入；如果軟件的密碼狗不能被正常識別，請安裝帶補丁的驅(qū)動程序或向Bio-Rad安裝工程師求助；在給用戶安裝圖像儀和軟件前，先提醒用戶保存好申請來的密碼、軟件序列號和密碼狗。培訓儀器時，提醒用戶不要將潮濕的樣品長期放在暗箱內(nèi)，以防腐蝕濾光片，更不要將液體濺到暗箱底板上，以免燒壞主板。提醒用戶儀器用完，及時關上電源，特別是ChemiDocXRS的CCD電源；提醒用戶勿用控制成像儀的電腦上網(wǎng)，也不要自行重裝電腦操作系統(tǒng)或給操作系統(tǒng)升級。

第二局部儀器及QuantityOne軟件分析操作簡介凝膠電泳是每個做分子生物學的研究者天天都要打交道的根本技術。電泳之后的信息處理與電泳本身同樣重要。目前有大量軟件可以用于分析電泳結(jié)果，今天要向大家介紹的是Bio-Rad公司的1D凝膠分析軟件QuantityOne〔Bio-Rad還有一個做2D凝膠分析的軟件PDQuest〕。QuantityOne軟件是常用1D凝膠分析軟件中功能最強大，自動化程度最高的軟件。這個軟件的最新版本可以在Bio-Rad的網(wǎng)站〔://bio-rad〕免費下載，以供試用或用戶升級之用。QuantityOne軟件的主要功能包括定量分析(VolumesQuickGuide)，電泳條帶分析(BandAnalysis)，差顯分析(DifferentialDisplayAnalysis)，克隆計數(shù)(ColonyCountingAnalysis)等，此外，還可以直接控制Bio-Rad公司的各類圖像儀和ExQuest自動切膠儀，使您的凝膠分析工作變得極為輕松。QuantityOne軟件擁有與windows操作系統(tǒng)下絕大多數(shù)應用軟件相同的友好界面。插入密碼狗，翻開QuantityOne軟件，可以看到最上緣藍色橫條幅是標題欄，往下依次是菜單欄和工具欄。每個菜單的主要功能如下：File圖像翻開、保存、引入、打印等操作Match分子量估算、條帶匹配分析Edit圖像普通編輯操作Volumn定量分析View圖像縮放、三維視圖、看光密度值等操作Analysis濃度估算、克隆計數(shù)等分析Image圖像旋轉(zhuǎn)、翻轉(zhuǎn)、裁切等操作Reports分析結(jié)果輸出Lane泳道分析Window窗口分析Band條帶分析Help幫助、快捷菜單、軟件注冊等往下一行是工具欄，上面每個按鈕的功能見下表：翻開文件圖像顯示控制條帶分析工具保存操作顯示條帶匹配工具打印圖像去除分析標記輪廓修改工具看全圖圖像工具打印快捷指南局部放大文字工具定量分析快捷指南拖曳定量工具條帶分析快捷指南放大并居中灰度分析工具克隆計數(shù)快捷指南縮小并居中泳道分析工具QuantityOne軟件HelpQuickGuide快捷指南提示如何實現(xiàn)一個功能，如定量分析(VolumesQuickGuide)，電泳條帶分析(BandAnalysis)，差顯分析(DifferentialDisplayAnalysis)，克隆計數(shù)(ColonyCountingAnalysis)等?？旖葜改舷掠?，2，3…步驟，根據(jù)提示完成。使用QuantityOne軟件進行電泳結(jié)果分析，通常包括圖像獲取、圖像優(yōu)化、分析、結(jié)果輸出四局部，參考下列圖：圖像獲取就是通過軟件控制掃描儀〔GS-800、PharosFX等〕或凝膠成像系統(tǒng)〔GelDoc、ChemiDoc、VersaDoc等〕獲取圖像的過程。圖像優(yōu)化就是將掃描或拍照獲得的原始圖像進行初步處理，以便更好地進行后續(xù)分析。接下來是分析過程，根據(jù)分析的方法和目的不同，又可以分為定量分析、條帶分析、克隆計數(shù)、差異〔聚類〕分析等等。不管如何分析，最終我們都必須通過軟件的輸出功能，得到我們想要的結(jié)果。QuantityOne軟件提供了多種結(jié)果輸出方式。在接下來的幾章里，我們將按照這個思路，一步步引導您使用這一軟件。圖像獲取QuantityOne4.4－4.6版本可以控制Bio-Rad目前幾乎所有的圖像儀，如GelDocXR、ChemiDocXRS等。這些圖像儀采集到的圖像，可以直接保存成軟件可直接分析的圖像，即擴展名1sc的原始圖像文件。下面將具體介紹如何通過QuantityOne軟件從GelDocXR獲取圖像。GelDocXR是Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中最常用，操作最簡便的儀器，它可以用來拍攝EB、SYBRGreen等染料染的核酸電泳凝膠；SyproRuby、銀染、考馬斯亮藍等方法染的蛋白電泳凝膠；以及化學顯色的印記膜等。使用GelDocXR之前，先接通電源，翻開位于儀器反面右下角的電源開關；然后根據(jù)具體的應用選擇適宜的照明和濾光片位置。原那么如下：模式1模式2模式3照明類型紫外透射白光透射側(cè)面白光適用樣品EB、SYBRGreen、SyproRuby等需要紫外激發(fā)的透明樣品金屬銀、考馬斯亮藍等染料染色，直接可見的透明樣品化學顯色等非透明可見樣品載物平臺抽屜式紫外透射平臺白光轉(zhuǎn)換屏(170-8001)或白光板(170-7950)抽屜式紫外透射平臺光源按鈕“TransUV”白光板：“TransUV”

白光轉(zhuǎn)換屏白光轉(zhuǎn)換屏有自己的電源開關，位于屏下方，翻開后不必每次都關閉這個開關。：“TransWhite白光轉(zhuǎn)換屏有自己的電源開關，位于屏下方，翻開后不必每次都關閉這個開關。“EpiWhite”濾光片位IIO不管使用何種模式，根本的操作過程都是這樣的：將樣品置于適當?shù)妮d物平臺上關閉暗箱門調(diào)整濾光片翻開相應光源接下來翻開QuantityOne軟件，選擇File》GelDocXR，按以下順序操作：⑤④②③①⑤④②③①⑦⑥⑧⑦⑥⑧按下Live/Focus，成像儀進入實時成像；選擇照明模式，一般熒光樣品選擇UV,普通透射或反射樣品選擇White模式注意：該選項對圖像數(shù)據(jù)格式有影響，但不能代替光源選擇。此功能有三個上下鍵按鈕：IRIS〔光圈〕，ZOOM〔縮放〕，F(xiàn)OCUS〔聚焦〕，您可在軟件上直接調(diào)節(jié)或在儀器面板上手工調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)步驟：a調(diào)大IRIS，以看到圖像b點ZOOM,將膠適當放大c調(diào)節(jié)IRIS至適宜大小〔一般情況下盡量選擇小光圈，因為小光圈景深大，圖像更清晰)d調(diào)節(jié)FOCUS，至圖像最清晰單擊AutoExpose,系統(tǒng)將自動選擇曝光時間成像〔系統(tǒng)默認0.15%的像素飽和的成像時間為最正確時間，在Options對話框中可以修改該項設置〕，如不滿意，單擊ManualExpose，并輸入曝光時間〔秒〕圖像曝光滿意后，按下“Freeze”按鈕。按下“Analyze”按鈕，將彈出一個新窗口顯示圖像，以供分析。第5步結(jié)束后，也可以按下“Save”鍵，保存圖像。根本圖像優(yōu)化通過圖像儀采集的圖像，可能會有偏斜、比照度不佳、數(shù)據(jù)關系錯誤等問題影響分析。所以新采集的圖像應經(jīng)過優(yōu)化后再進行分析。優(yōu)化的根本過程是：Rotate〔旋轉(zhuǎn)〕》Crop〔裁剪〕》Transform〔轉(zhuǎn)化〕。另外，當數(shù)據(jù)關系錯誤的時候，需要改變之。詳細步驟見下。1．旋轉(zhuǎn)〔Rotate〕在Image》Rotate菜單中選擇適當?shù)男D(zhuǎn)角度，其中“CustomRotation”工具可以實現(xiàn)任意角度的旋轉(zhuǎn)，點擊后，圖像上出現(xiàn)如下列圖所示的情況：

圖中出現(xiàn)一個白圈和黃色十字，鼠標靠近黃色箭頭，可以任意角度拖動這個箭頭。旁邊有個小窗口顯示所需要旋轉(zhuǎn)的角度和弧度，點擊“Rotate”按鈕旋轉(zhuǎn)即可完成，請保存旋轉(zhuǎn)后圖像。2．裁剪〔Crop〕裁剪的目的是去掉電泳區(qū)域以外的局部，僅保存從電泳起點到前緣有泳道的局部。選擇Image》Crop，在圖像適當?shù)姆秶鷥?nèi)畫一個方框。鼠標移動到框邊變成雙向的箭頭，可以改變框的大小和形狀。最后鼠標移動到框內(nèi)，當鼠標變成一剪刀形的時候，單擊，選擇“拷貝并裁剪”。3．轉(zhuǎn)化〔Transform〕優(yōu)化圖像顯示，便于肉眼觀察。選擇Image》Transform，會彈出右圖所示窗口：選擇“Auto-scale”，軟件會自動調(diào)整比照度至最優(yōu)這種比照度調(diào)整并不改變具體的灰度數(shù)據(jù)，只是將圖中最這種比照度調(diào)整并不改變具體的灰度數(shù)據(jù)，只是將圖中最“淡”的點顯示成白色，最“深”的點顯示成黑色。除此之外，有時還必須檢查數(shù)據(jù)關系是否正確。即圖中黑色局部的數(shù)據(jù)是否高于白色局部。正常情況下是的，但有時會反過來。這種情況往往出現(xiàn)在用軟件分析其它公司的圖像儀時或者使用GelDocXR，第二步“ImageMode”選錯的情況下。方法是：1．選擇View》PlotDensity》DensityatCursor，在圖像中顏色較深的地方點擊一下，觀察彈出的灰度數(shù)值2．再在顏色較淺的地方點擊一下，觀察灰度數(shù)值。3．比擬前次數(shù)值是否大于后次的，如果是，那么不用再進行任何改動；如不是，選擇Image》InvertData…，按彈出的對話框的提示一步步往下做。最后進行一次“Transform”。圖像分析QuantityOne的圖像分析功能相當強大，根據(jù)不同的需要，可以分為定量分析、條帶分析、相似性分析以及克隆計數(shù)(用于藍白斑篩選)等等，而且每種分析法都有獨特的優(yōu)點和輸出方式。本章重點介紹常用的定量分析和條帶分析方法，其余更細更深的功能請參考軟件自帶的用戶手冊。定量分析〔VolumnAnalysis〕定量分析是計算選定區(qū)域內(nèi)信號強度的總和，是QuantityOne最方便的定量工具。這種分析方式考慮全定區(qū)域的真實形狀，可用于電泳條帶、斑點、大型芯片以等圖像的定量。這種定量的方法可以扣除背景，可以按照用戶的標準曲線計算出條帶或斑點的濃度，但它不能計算分子量，也不能進行條帶匹配和相似性分析。QuantityOne軟件稱這類定量的結(jié)果為Volume。Volume＝選定區(qū)域內(nèi)所有像素信號強度的總和×像素面積Volume的單位：int×mm2快捷指南VolumesQuickGuide，能夠指導您對任意所選區(qū)域進行定量分析,此分析可以報告多種結(jié)果，常用的結(jié)果是相對濃度和絕對濃度〔須提供標準品〕。具體的操作方法如下：選擇成像系統(tǒng)或翻開已保存的文件(軟件可以控制Bio-Rad所有的成像系統(tǒng)如GelDoc,ChemiDoc,VersaDoc,GS-800,FX,如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff必須是8位〔bit〕或16位〔bit〕無壓縮的tiff文件必須是8位〔bit〕或16位〔bit〕無壓縮的tiff文件ZoomBox，縮放，對圖象進行放大觀察選擇待分析區(qū)域：VolumnContourTool等高線勾勒區(qū)域，自動連接濃度濃度相同的點，如U1VolumeFreehandTool自由畫筆選擇區(qū)域，可以勾勒出無規(guī)那么形狀,如U2VolumeRectTool矩形區(qū)域選擇，如U3VolumnCircleTool圓形選擇區(qū)域，如U4按上面4種方法選擇需要定量的區(qū)域。5．雙擊所選區(qū)域，出現(xiàn)如下窗口，定義樣品類型，如未知樣品Unkonwn(U1,U2…即待計算樣品)，背景Background(B1,B2…，軟件在算濃度時會將此區(qū)域的濃度自動扣除)或標準樣品Standard〔Std1,Std2,如果該樣品是濃度標準樣品，即定量標準，需在濃度concentration一欄輸入該樣品的濃度〕。SelectTool選擇不同區(qū)域PrintImage打印圖像VolumeAnalysisReport定量報告結(jié)果。翻開出現(xiàn)如下窗口，選擇要報告的參數(shù)，主要有2個參數(shù)Volume、adj.Vol.(即adjustedvolume)和Concentration。Volume為定量值，adj.Vol.為扣除背景后的定量值，如有濃度標準樣品〔Std〕，軟件可報告Concentration絕對濃度。參數(shù)選好后，按下按鈕“done”。打印文本輸出7．軟件報告如上圖所示：按右側(cè)輸出按鈕，可將表格保存成txt文件，按左側(cè)打印按鈕，可將報告打印出來。打印文本輸出二．條帶分析〔BandAnalysis〕條帶分析是QuantityOne最根本的分析工具，它可以自動識別電泳泳道和識別條帶，依據(jù)泳道的平均光密度和條帶寬度對每個條帶進行模式化定量。這種分析方式雖然不如定量分析來得方便，但這樣可以實現(xiàn)非常復雜的電泳分析，滿足各種不同的結(jié)果需要。這種方式的最大優(yōu)點在于它可以完全拋棄人為主觀因素而進行全自動定量。用條帶分析的方法進行定量的結(jié)果叫TraceQuantity〔TraceQty〕，計算方法是：首先軟件自動計算條帶上每一橫排像素的平均光密度和平均光密度分布曲線，然后每個具體條帶的定量值是平均光密度曲線的線下面積的積分，即：TraceQuantity＝平均光密度×條帶上下邊界的距離TraceQuantity的單位：OD*mm條帶分析中的條帶定量模型下面介紹用此功能對泳道內(nèi)的所有條帶進行分子量確定，相對濃度分析翻開已保存的文件(如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff必須是8位〔bit〕或16位〔bit〕無壓縮的tiff文件必須是8位〔bit〕或16位〔bit〕無壓縮的tiff文件ZoomBox，縮放，對圖象進行放大觀察Transform轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)圖象的比照度黑白4．確定泳道(lane),并對泳道進行各種調(diào)整〔實際實驗中泳道往往不是垂直的而出現(xiàn)各種變形〕。按下列圖所示在軟件的工具欄中有一LaneTool圖標，包含有更多泳道編輯工具。BandTool條帶BandTool條帶編輯工具包LaneTool泳道編輯工具包5．選擇FrameLanes，輸入圖像實際泳道(lane)數(shù)并確認。此時圖像上泳道的位置上會出現(xiàn)一條條紅線，每條紅線就代表一根泳道。6．選擇Add/AdjustAnchors，此時泳道紅線上會出現(xiàn)一些小圓圈。這些小圓圈稱為錨定點(anchor)，錨定點規(guī)定了泳道走向。當泳道不直時，點擊出現(xiàn)彎曲的泳道部位，就可以增加錨定點。鼠標按住錨定點，可以拖動錨定點，讓每根紅線始終位于泳道的中間線上。7．LaneBackground去除泳道背景。點擊該按鈕，選擇一條適當?shù)挠镜傈c擊之，然后在彈出的對話框中選“AllLaneOn”，在“RollingDiskSize”中填入適當?shù)臄?shù)值數(shù)值代表背景扣除數(shù)，值越大那么背景扣除越少，被計入條帶定量值越多，反之那么背景扣除越多。從經(jīng)驗來看，該數(shù)值以2－40之間為宜。數(shù)值代表背景扣除數(shù)，值越大那么背景扣除越少，被計入條帶定量值越多，反之那么背景扣除越多。從經(jīng)驗來看，該數(shù)值以2－40之間為宜。8．DetectBand，檢測泳道內(nèi)的條帶，翻開出現(xiàn)如下窗口。通過調(diào)節(jié)sensitivity靈敏度可調(diào)節(jié)檢測出的條帶數(shù)，調(diào)節(jié)LaneWidth使代表表帶的紅色橫線與條帶寬度差不多寬。中間一行人工編輯按鈕可以用來增加/減少條帶、調(diào)節(jié)條帶的上、下邊界等。翻開工具欄中BandTool條帶編輯工具包可看到更多編輯工具〔如上圖〕人工編輯按鈕人工編輯按鈕Standard輸入分子量標準，軟件自帶有許多Bio-Rad的分子量標準，如你用的是自己的標準，進入NewStandard建立新的分子量標準，軟件可以選擇標準單位是MW〔蛋白質(zhì)〕還是BP〔核酸〕等〔左下列圖〕。在Protein-Standard對話框中輸入分子量數(shù)值，完成后單擊賦值圖標〔右下列圖〕，回到圖象文件上單擊標準樣品的泳道，軟件自動將所輸?shù)姆肿恿繑?shù)值和泳道內(nèi)的條帶一一對應。賦值圖標：告訴軟件哪條是分子量標準樣品的泳道輸入分子量數(shù)值賦值圖標：告訴軟件哪條是分子量標準樣品的泳道輸入分子量數(shù)值BandAttribute條帶屬性，在完成第9步以后，軟件已自動計算出了其他未知條帶的分子量,翻開bandattribute選擇要報告的參數(shù)，這里我們選擇MolecularWeight，圖象上可以看到所有條帶的分子量〔紅顏色標記〕，標準分子量為藍色標記。PrintImage打印圖象相對豐度〔純度〕分子量條帶號相對豐度〔純度〕分子