蟾蜍坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本制備

蟾蜍坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本制備和不同強(qiáng)度和頻率對(duì)肌肉收縮的影響實(shí)驗(yàn)摘要目的：掌握制備具有正常興奮收縮功能的蛙類坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本基本操作以及蛙類手術(shù)器械的使用方法。學(xué)習(xí)微機(jī)生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)和換能器的使用。記錄在刺激時(shí)間、強(qiáng)度變化率恒定的條件下，不同強(qiáng)度和頻率的電刺激對(duì)肌肉收縮的影響。方法：應(yīng)用蛙類捉拿方法并且毀腦脊髓后制備坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本，用鋅銅弓分別刺激坐骨神經(jīng)和腓腸肌，觀察肌肉變化。再利用張力換能器將壓力變化轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，用微機(jī)生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄不同強(qiáng)度和頻率對(duì)肌肉收縮的影響的變化曲線。結(jié)果：用鋅銅弓刺激坐骨神經(jīng)時(shí)腓腸肌發(fā)生收縮。在保持足夠的刺激時(shí)間(脈沖波寬)不變的條件下，通過逐步增加對(duì)蟾蜍坐骨神經(jīng)的刺激強(qiáng)度(脈沖振幅)和改變電脈沖刺激頻率可發(fā)現(xiàn)當(dāng)電壓低于閾值的強(qiáng)度刺激，坐骨神經(jīng)支配腓腸肌的神經(jīng)纖維不發(fā)生興奮，刺激電壓達(dá)到閾強(qiáng)度時(shí)，坐骨神經(jīng)干中閾值最低的神經(jīng)開始興奮。刺激強(qiáng)度逐漸增大，總收縮張力增加。當(dāng)刺激電壓達(dá)到使支配腓腸肌的神經(jīng)纖維全部興奮，則收縮張力達(dá)單收縮最大值。結(jié)論：在一定刺激時(shí)間下，剛能引起組織發(fā)生興奮的刺激稱為閾刺激，所達(dá)到的強(qiáng)度為閾強(qiáng)度；能引起組織發(fā)生最大興奮的最小刺激稱為最大刺激，相應(yīng)的刺激強(qiáng)度叫最大刺激強(qiáng)度。介于閾刺激和最大刺激間的刺激稱閾上刺激，相應(yīng)的刺激強(qiáng)度稱為閾上刺激強(qiáng)度。關(guān)鍵詞：坐骨神經(jīng)、腓腸肌、興奮性、閾值引言：刺激神經(jīng)使神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生興奮，興奮沿神經(jīng)纖維傳導(dǎo)，通過神經(jīng)肌接頭的化學(xué)傳遞，使肌肉終板膜上產(chǎn)生終板電極，終板電極可引起肌肉產(chǎn)生興奮（即動(dòng)作電位），傳遍整個(gè)肌肉纖維，再通過興奮-收縮耦聯(lián)使肌纖維中粗、細(xì)肌絲產(chǎn)生相對(duì)滑動(dòng)，宏觀上表現(xiàn)為肌肉收縮。[1]材料和方法實(shí)驗(yàn)對(duì)象：蟾蜍實(shí)驗(yàn)儀器：張力換能器、微機(jī)生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)、剪刀、鐵碗、培養(yǎng)皿、鋅銅弓、玻璃分針、大頭針、蛙板、尖頭鑷子、棉線、針形引導(dǎo)電極實(shí)驗(yàn)藥品和試劑：任氏液實(shí)驗(yàn)方法：觀察蟾蜍毀腦脊髓前后四肢肌張力的變化。用鋅銅弓分別刺激坐骨神經(jīng)和腓腸肌，觀察肌肉的反應(yīng)。毀腦脊髓取蟾蜍一只，用左手握住，以食指壓其頭部前端使其盡量前俯，右手持探針自枕骨大孔處垂直刺入，到達(dá)椎管，即將探針改變方向刺入顱腔，向各側(cè)不斷攪動(dòng)，徹底搗毀腦組織；再將探針原路退出，刺向尾側(cè)，捻動(dòng)探針使逐漸刺入整個(gè)椎管內(nèi)，搗毀脊髓。此時(shí)蟾蜍下頜呼吸運(yùn)動(dòng)應(yīng)消失，四肢松軟，即成為一毀腦脊髓的蟾蜍。否則須按上法再行搗毀。剪除軀干上部及內(nèi)臟用粗剪刀在顱骨后方剪斷脊柱。左手握住蟾蜍脊柱，右手將粗剪刀沿兩側(cè)（避開坐骨神經(jīng)）剪開腹壁。此時(shí)軀干上部及內(nèi)臟即全部下垂。剪除全部軀干上部及內(nèi)臟組織，棄于瓷盆內(nèi)。剝皮避開神經(jīng)，用右手拇指和食指夾住脊柱，左手捏住皮膚邊緣，逐步向下牽拉剝離皮膚。拉至大腿時(shí)，如阻力較大，可先剝下一側(cè)，再剝另一側(cè)。將全部皮膚剝除后，將標(biāo)本置于盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。洗凈雙手和用過的全部手術(shù)器械，再進(jìn)行下列步驟。分離雙腿避開坐骨神經(jīng)，用粗剪刀從背側(cè)剪去骶骨，然后沿中線將脊柱剪成左右兩半，再?gòu)膼u骨聯(lián)合中央剪開（為保證兩側(cè)坐骨神經(jīng)完整，應(yīng)避免剪時(shí)偏向一側(cè)）。將已分離的標(biāo)本浸入盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。游離坐骨神經(jīng)取腿一條，先用剝離分針沿脊柱側(cè)游離坐骨神經(jīng)腹腔部，然后用大頭針將標(biāo)本背位固定于干凈蛙板上。用玻璃分針循股二頭肌和半膜肌之間的坐骨神經(jīng)溝，縱向分離暴露坐骨神經(jīng)之大腿部分，直至分離至腘窩頸神經(jīng)分叉處。然后剪斷股二頭肌腱、半膜肌和半膜肌肌腱，并繞至前方剪斷股四頭肌腱。自上向下剪斷所以坐骨神經(jīng)分支。將連著3-4節(jié)椎骨的坐骨神經(jīng)分離出來。完成坐骨神經(jīng)小腿標(biāo)本將已游離的坐骨神經(jīng)搭在腓腸肌上。用粗剪刀自膝關(guān)節(jié)周圍向上剪除并刮凈所以大腿肌肉，在距膝關(guān)節(jié)約1cm處剪斷股骨。棄去上段股骨，保留部分即為坐骨神經(jīng)小腿標(biāo)本。完成坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本用尖子鑷子在上述坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本的跟腱下方穿孔，穿線結(jié)扎之。提起結(jié)扎線，在結(jié)扎線下方剪斷跟腱，并逐步游離腓腸肌至膝關(guān)節(jié)處，左手握住標(biāo)本的股骨部分，使已游離的坐骨神經(jīng)和腓腸肌下垂，右手持粗剪刀水平方向伸進(jìn)腓腸肌與小腿之間，在膝關(guān)節(jié)處剪斷，與小腿其余部分分離。左手保留部分即為附著于股骨之上的、具有坐骨神經(jīng)支配的腓腸肌標(biāo)本。將標(biāo)本浸入盛有新鮮任氏液的培養(yǎng)皿中待用。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連接和參數(shù)設(shè)置張力換能器的輸出端與生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)的輸入通道相連。啟動(dòng)RM6240系統(tǒng)軟件，在系統(tǒng)軟件窗口設(shè)置儀器參數(shù)：點(diǎn)擊“實(shí)驗(yàn)”菜單，選擇“刺激強(qiáng)度（或頻率）對(duì)骨骼肌收縮的影響”項(xiàng)。參數(shù)：通道模式為張力，采樣頻率400Hz～1kHz，掃描速度1s/div，靈敏度10～30g，時(shí)間常數(shù)為直流，濾波頻率100Hz。在“選擇”下拉菜單中選擇“強(qiáng)度/頻率”項(xiàng)，顯示刺激參數(shù)。將離體蟾蜍坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本固定在屏蔽盒中，腓腸肌跟腱的扎線固定在張力換能器的懸臂梁上。坐骨神經(jīng)放在刺激電極和引導(dǎo)電極上，保持神經(jīng)與電極接觸良好。針形引導(dǎo)電極插入腓腸肌并固定。觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象設(shè)定在刺激時(shí)間、強(qiáng)度變化率恒定，且強(qiáng)度和頻率初始條件均為零的條件下，采集不同強(qiáng)度和頻率的電刺激對(duì)肌肉收縮的影響數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1）用鋅銅弓刺激坐骨神經(jīng)時(shí)腓腸肌發(fā)生收縮。2）不同頻率遞增對(duì)肌肉收縮影響記錄圖不同強(qiáng)度對(duì)肌肉收縮影響記錄圖在一定刺激時(shí)間下，剛能引起組織發(fā)生興奮的刺激稱為閾刺激，所達(dá)到的強(qiáng)度為閾強(qiáng)度；能引起組織發(fā)生最大興奮的最小刺激稱為最大刺激，相應(yīng)的刺激強(qiáng)度叫最大刺激強(qiáng)度。介于閾刺激和最大刺激間的刺激稱閾上刺激，相應(yīng)的刺激強(qiáng)度稱為閾上刺激強(qiáng)度。如上圖所示：閾強(qiáng)度為0.096V，最大刺激強(qiáng)度0.162V。開始收縮的頻率為3Hz，完全強(qiáng)直收縮的頻率為23Hz實(shí)驗(yàn)分析鋅銅弓用金屬鋅和銅鉚接而成，鋅銅弓在極性溶液中形成回路時(shí)，鋅與銅兩極產(chǎn)生約0.5-0.7V的直流電壓，電流的刺激作用于神經(jīng)肌肉標(biāo)本，由于產(chǎn)生生物電流，因而引起肌肉的收縮。制備標(biāo)本的過程中，要不斷滴加任氏液，以防標(biāo)本干燥，喪失正常生理活性；操作過程中應(yīng)避免強(qiáng)力牽拉和手捏神經(jīng)或夾傷神經(jīng)肌肉；毀腦脊髓時(shí)防止蟾蜍皮膚分泌的蟾蜍毒液射入操作者眼內(nèi)或污染實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。在恒定時(shí)間間隔用不同強(qiáng)度的電壓刺激坐骨神經(jīng)，當(dāng)電壓低于閾值的強(qiáng)度刺激，坐骨神經(jīng)支配腓腸肌的神經(jīng)纖維不發(fā)生興奮，其所支配的肌細(xì)胞也不會(huì)發(fā)生興奮和收縮。刺激電壓達(dá)到閾強(qiáng)度（本次實(shí)驗(yàn)閾強(qiáng)度為0.095V）時(shí)，坐骨神經(jīng)干中閾值最低的神經(jīng)開始興奮，其所支配的運(yùn)動(dòng)單位的肌纖維興奮并發(fā)生收縮。刺激強(qiáng)度逐漸增大，坐骨神經(jīng)干中興奮的神經(jīng)纖維增加，興奮和收縮的運(yùn)動(dòng)單位增加，令總收縮張力增加。當(dāng)刺激電壓達(dá)到使支配腓腸肌的神經(jīng)纖維全部興奮，則收縮張力達(dá)單收縮最大值（本次實(shí)驗(yàn)最大刺激強(qiáng)度0.162V）。如果給肌肉以連續(xù)短促刺激，隨著刺激頻率的不同，肌肉收縮會(huì)出現(xiàn)不同的形式。當(dāng)頻率較低時(shí)（本實(shí)驗(yàn)頻率為3Hz），后一個(gè)刺激落在前一個(gè)刺激引起的收縮過程結(jié)束之后，則只引起一連串各自分開的單收縮。隨頻率增加，后一個(gè)刺激落在前一個(gè)刺激引起的收縮過程的舒張期，則如實(shí)驗(yàn)記錄數(shù)據(jù)所示的在頻率為7Hz時(shí)形成了不完全強(qiáng)直收縮。當(dāng)頻率增加到每一個(gè)后面的刺激落在前一個(gè)收縮過程中的收縮期，則各次收縮的張力變化和長(zhǎng)度完全融合或疊加起來，就形成完全強(qiáng)直收縮，如實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄所示，開始完全強(qiáng)直收縮的頻率為23Hz。實(shí)驗(yàn)結(jié)論蛙類的某些基本生命活動(dòng)和生理功能與哺乳類動(dòng)物有相似之處，而且其離體組織的生活條件比較簡(jiǎn)單，易于控制和掌握，來源也較豐富，由此在生理學(xué)實(shí)驗(yàn)，尤其是細(xì)胞生理學(xué)的某些實(shí)驗(yàn)中，常用蛙或蟾蜍的坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本來觀察神經(jīng)肌肉的興奮性、刺激與反應(yīng)的規(guī)律及肌肉收縮的特點(diǎn)等。在保持足夠的刺激時(shí)間(脈沖波寬)不變的條件下，通過逐步增加對(duì)蟾蜍坐骨神經(jīng)的刺激強(qiáng)度(脈沖振幅),當(dāng)電壓低于閾值的強(qiáng)度刺激，坐骨神經(jīng)支配腓腸肌的神經(jīng)纖維不發(fā)生興奮。刺激電壓達(dá)到閾強(qiáng)度時(shí)，坐骨神經(jīng)干中閾值最低的神經(jīng)開始興奮。當(dāng)刺激電壓達(dá)到使支配腓腸肌的神經(jīng)纖維全部興奮，則收縮張力達(dá)單收縮最大值。在保持足夠的刺激時(shí)間(脈沖波寬)不變的條件下和改變電脈沖刺激頻率可發(fā)現(xiàn)當(dāng)頻率較低時(shí),只引起一