膿毒癥病理生理機(jī)制研究新動(dòng)態(tài)

膿毒癥病理生理機(jī)制研究新動(dòng)態(tài)

國(guó)家973課題和國(guó)家杰出青年基金工程研究背景膿毒癥(Sepsis)是嚴(yán)重創(chuàng)(燒、戰(zhàn))傷、休克、感染、外科大手術(shù)患者常見(jiàn)的并發(fā)癥，進(jìn)一步開(kāi)展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(MODS)，是臨床危重患者的最主要死亡原因之一。膿毒癥和MODS來(lái)勢(shì)兇猛、病情進(jìn)展迅速、預(yù)后險(xiǎn)惡，給臨床救治工作帶來(lái)極大困難，已成為現(xiàn)代危重病醫(yī)學(xué)面臨的突出難題。研究背景盡管膿毒癥新概念與臨床特征的認(rèn)識(shí)有所進(jìn)步，但嚴(yán)重膿毒癥、MODS的臨床試驗(yàn)性治療相繼失敗，其病死率仍居高不下(50~80%)。究其原因，關(guān)鍵是有關(guān)膿毒癥和MODS的根本發(fā)病環(huán)節(jié)及作用機(jī)制尚未充分說(shuō)明，缺乏早期有效的預(yù)防與治療措施。因此，開(kāi)展其研究具有極其重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。膿毒癥根底研究進(jìn)展遺傳背景(基因多態(tài)性研究)重要誘發(fā)因素(微生物及其產(chǎn)物、內(nèi)/外毒素作用)晚期炎性介質(zhì)與效應(yīng)分子(高遷移率族蛋白-1)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(MAPK通路,JAK/STAT通路)網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)與器官間相互作用(神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫凝血-纖溶-炎癥)調(diào)節(jié)方法與干預(yù)途徑(活化蛋白C)嚴(yán)重?fù)p傷后全身性炎癥反響失控及器官損害受體內(nèi)眾多基因的調(diào)控，但為何有的人群易于并發(fā)膿毒癥和MODS？對(duì)MODS患者采取相似的治療方案，但機(jī)體反響和預(yù)后可能完全不同。這些現(xiàn)象是否與體內(nèi)存在某種MODS相關(guān)的“易感基因〞或基因表達(dá)特性的改變影響宿主對(duì)應(yīng)激狀態(tài)的敏感有關(guān)？基因多態(tài)性TNF-2純合子患者TNF-水平和病死率均高于雜合子或TNF-1純合子患者，證實(shí)TNF-2基因型可能是嚴(yán)重膿毒癥患者出現(xiàn)高TNF-水平和不良預(yù)后的基因標(biāo)志之一。TNF-雙等位基因Nco1多態(tài)性與嚴(yán)重膿毒癥和器官損害的發(fā)生密切相關(guān),分析其多態(tài)性有助于評(píng)估并發(fā)膿毒癥和MODS的易感性及明確對(duì)抗TNF免疫治療的反響性?；蚨鄳B(tài)性(基因組序列上的變異)是決定人體對(duì)應(yīng)激打擊易感性與耐受性、臨床表型多樣性及藥物治療反響差異性的重要因素?；蚨鄳B(tài)性

基因大規(guī)模直接測(cè)序，明確了中國(guó)人群中一些在創(chuàng)、燒傷感染發(fā)病中起關(guān)鍵作用的效應(yīng)分子的基因多態(tài)性分布，并初步進(jìn)行了臨床關(guān)聯(lián)分析和功能研究。

已明確TLR4受體5’區(qū)-1892G→A、-1837A→G、CD14啟動(dòng)子區(qū)-1145G/A和-159C/T、IL-1β啟動(dòng)子區(qū)-1470G→C、-511T→C和-31C→T與創(chuàng)傷感染易感性存在密切的內(nèi)在聯(lián)系。

CD14C-159T基因多態(tài)性對(duì)TNF-αmRNA表達(dá)的影響8攜帶不同CD14基因多態(tài)性燒傷患者單核細(xì)胞外表HLA-DR的表達(dá)*

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燒傷膿毒癥患者預(yù)后與單核細(xì)胞

HLA-DR結(jié)合量的關(guān)系**

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CD14C-159T基因多態(tài)性與MODS發(fā)生率及死亡率的關(guān)系基因型例數(shù)（n）MODS例數(shù)（n）死亡例數(shù)（n）-159CC700-159CT1064-159TT4331171例特重度燒傷患者基因型與膿毒癥及死亡率的關(guān)系

基因型例數(shù)非膿毒癥（例）膿毒癥（例）死亡率（%）CC73（42.9）4（57.1）2（28.6）TC4618（39.1）28（60.9）11（23.9）*TT185（27.8）13（72.2）9（50.0）

臨床試驗(yàn)性治療膿毒癥的實(shí)踐中，應(yīng)當(dāng)考慮基因的因素。如果對(duì)照和治療組CD14C-159T或其他易感基因多態(tài)性的分布頻率不一致，那么結(jié)果無(wú)論是支持或是否認(rèn)試驗(yàn)性治療，其判定很可能會(huì)產(chǎn)生偏差。膿毒癥早期識(shí)別與判定預(yù)后的輔助工具。在不久的將來(lái)，基因多態(tài)性的檢測(cè)很可能會(huì)幫助患者選擇個(gè)體化的有針對(duì)性的治療，從而有利于降低膿毒癥和/或MODS的發(fā)病率。13外毒素研究背景諸多研究證實(shí)，細(xì)菌、內(nèi)毒素、病毒及寄生蟲(chóng)感染等在機(jī)體的膿毒性反響中均可起觸發(fā)劑作用,其中革蘭陰性菌及其內(nèi)毒素在膿毒癥發(fā)病中的作用與機(jī)制已進(jìn)行了較為廣泛、深入的研究。然而，長(zhǎng)期以來(lái)，人們對(duì)于革蘭陽(yáng)性菌及其外毒素的致病意義認(rèn)識(shí)缺乏。臨床資料說(shuō)明,革蘭陽(yáng)性菌膿毒癥的發(fā)病率逐年上升，至二十世紀(jì)90年代末已達(dá)膿毒癥發(fā)病率的50％以上，并仍有升高趨勢(shì)。其中金黃色葡萄球菌(簡(jiǎn)稱金葡菌)發(fā)病率位居首位，是燒傷創(chuàng)面感染、急性肝功能衰竭的重要病原菌。

金葡菌主要致病因子外毒素(腸毒素、TSST-1、溶血素)酶(血漿凝固酶、透明質(zhì)酸酶、溶脂酶)細(xì)胞抗原(莢膜抗原、細(xì)胞壁成分、A蛋白)細(xì)菌學(xué)研究說(shuō)明，可溶性外毒素的產(chǎn)生是G＋菌感染的重要標(biāo)志之一，在G＋菌感染性疾病的發(fā)生、開(kāi)展中具有重要意義。其中金葡菌腸毒素因其“超抗原〞特性以及在中毒性休克綜合征發(fā)病中的特殊意義而倍受關(guān)注。T細(xì)胞抗原呈遞細(xì)胞T細(xì)胞抗原受體MHCII分子T細(xì)胞抗原呈遞細(xì)胞普通抗原超抗原TCRV

區(qū)ng/ml

金葡菌及其外毒素的分布、產(chǎn)毒率與意義

創(chuàng)面別離病原菌1880株，金葡菌別離率從1995年的17.7%(第3位)上升為1999年的29.3%(居第1位)、2003年44.4%。278例次靜脈內(nèi)置管的嚴(yán)重?zé)齻∪耍?例次發(fā)生導(dǎo)管膿毒癥(5例死亡)，其別離病原菌中金葡菌占50%以上。燒傷患者別離127株金葡菌產(chǎn)毒率達(dá)91.6%，以同時(shí)產(chǎn)生多種類型毒素者居多[同時(shí)產(chǎn)腸毒素B、C者最為常見(jiàn)]，其中90%以上為耐藥菌株。檢測(cè)100株金葡菌腸毒素產(chǎn)生情況，其中60株MRSA全部產(chǎn)一種以上腸毒素，而40株非MRSA產(chǎn)毒率僅為20%。腎臟蓄積排泄腎組織中SEB含量明顯高于其它臟器。SEB可經(jīng)腎小球自由濾過(guò)，并被近端小管細(xì)胞完全重吸收。腎動(dòng)脈結(jié)扎和腎切除均可導(dǎo)致體內(nèi)腸毒素的去除延遲，增強(qiáng)其對(duì)動(dòng)物的致死能力。給家兔靜脈注射125I標(biāo)記腸毒素,循環(huán)中腸毒素迅速去除，并分布到肝、腎、肺、脾等組織，其中腎臟含量最高。

腎臟是腸毒素蓄積和排泄的最重要場(chǎng)所之一。燙傷膿毒癥大鼠臟器功能的改變

y/x相關(guān)系數(shù)(r)P值回歸方程GPT/肝臟SEB0.84620.0040y=0.4249x+56.2483Cr/腎臟SEB0.67060.0480y=0.0283x+37.1327CK-MB/心臟SEB0.78940.0114y=2.1720x+157.7869MPO/肺臟SEB0.43630.2404

DAO/血漿SEB-0.43980.0170y=-0.0042x+0.2339組織SEB與臟器功能指標(biāo)的相關(guān)分析SEB單抗對(duì)燙傷膿毒癥大鼠6小時(shí)死亡率的影響

組別死亡率P值燙傷膿毒癥組55.6%(20/36)SEB單抗組17.6%(3/17)0.021

金葡菌腸毒素介導(dǎo)膿毒癥發(fā)病的分子機(jī)制

干擾素-

激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)其殺菌活性(保護(hù)效應(yīng))炎癥早期炎癥晚期誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TNF-、NO等介質(zhì)大量生成(損害效應(yīng))抗原呈遞細(xì)胞外表MHCII表達(dá)增加，促進(jìn)T細(xì)胞依賴性休克、MODS

腸毒素B

T細(xì)胞活化JAK2/STAT3SOCS1/3金葡菌致病因子的靶細(xì)胞為T淋巴細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞(1)腸毒素和TSST-1以T淋巴細(xì)胞為主要靶細(xì)胞(介導(dǎo)Th1細(xì)胞因子反響，包括IFN-)(2)肽聚糖和磷壁酸那么主要作用于單核/巨噬細(xì)胞內(nèi)毒素的靶細(xì)胞為單核/巨噬細(xì)胞(以TNF-α促炎因子占優(yōu)勢(shì))，且誘導(dǎo)細(xì)胞因子反響速度顯著快于外毒素金葡菌外毒素與內(nèi)毒素作用的差異金葡菌TSST-1可顯著提高宿主及細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素攻擊的敏感性，與內(nèi)毒素發(fā)生致死性協(xié)同作用，這是該毒素最重要的特性之一。健康家兔單獨(dú)接受TSST-1僅表現(xiàn)為發(fā)熱反響，即使劑量高達(dá)100g/kg亦不能產(chǎn)生致死效應(yīng)，提示該毒素本身致死性作用并不強(qiáng)。同時(shí)給予低劑量?jī)?nèi)毒素與TSST-1，動(dòng)物即可出現(xiàn)典型的TSS病癥和體征，表現(xiàn)為呼吸、循環(huán)、肝、腎及消化道等多器官功能嚴(yán)重障礙，導(dǎo)致動(dòng)物死亡。金葡菌外毒素與內(nèi)毒素的協(xié)同效應(yīng)早期炎癥介質(zhì)(TNF)釋放可能與多器官損害相關(guān)HMGB1的產(chǎn)生明顯晚于其它介質(zhì),被稱之為“潛在的晚期介質(zhì)〞

?提示還可能存在TNF-

以外的重要因子介導(dǎo)了內(nèi)毒素的致死效應(yīng)拮抗早期介質(zhì)對(duì)臨床病人并沒(méi)有明顯的保護(hù)作用內(nèi)毒素對(duì)TNF基因缺陷動(dòng)物亦具有致死效應(yīng)致死量?jī)?nèi)毒素攻擊，局部動(dòng)物數(shù)天后才出現(xiàn)死亡

HMGB1是否確實(shí)參與了失控性炎癥反響的發(fā)生、開(kāi)展過(guò)程？HMGB1的誘生機(jī)制及其作用如何？與嚴(yán)重創(chuàng)、燒傷后膿毒癥及器官損害的本質(zhì)聯(lián)系和臨床意義如何？針對(duì)HMGB1進(jìn)行干預(yù)是否有助于膿毒癥及多器官損害的防治？課題擬解決的問(wèn)題HMGB1mRNA腹腔感染膿毒癥大鼠組織HMGB1mRNA表達(dá)*時(shí)間〔小時(shí)〕對(duì)照組26122448720.96*******************************0.720.480.24ALT(u/L)*正丁酸鈉對(duì)膿毒癥大鼠器官功能指標(biāo)的影響肝功腎功6050454055Cr(μmol/L)***給小鼠腹腔注射純化的重組HMGB1攻擊可出現(xiàn)膿毒癥樣表現(xiàn)較大劑量HMGB1攻擊可導(dǎo)致動(dòng)物死亡氣管內(nèi)給予HMGB1可引起急性肺損傷，大量PMN聚積和肺水腫HMGB1的直接組織損害作用炎性因子(TNF-α)上調(diào)HMGB1合成HMGB1對(duì)TNF-α/IL-10表達(dá)的影響HMGB1對(duì)Toll樣受體表達(dá)的影響HMGB1的調(diào)節(jié)作用HMGB1對(duì)淋巴細(xì)胞免疫功能的影響〔包括增殖反響、IL-2/IL-2R表達(dá)、Th1/Th2極化〕HMGB1對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬、提呈功能的影響HMGB1與嚴(yán)重?zé)齻蠹?xì)胞免疫功能紊亂的本質(zhì)聯(lián)系及其信號(hào)機(jī)制HMGB1的免疫效應(yīng)

抗HMGB1抗體對(duì)內(nèi)毒素休克小鼠的治療效果

延遲HMGB1抗體治療組

時(shí)間〔小時(shí)〕2244872963361007550025存活率〔%〕內(nèi)毒素休克對(duì)照組

正丁酸鈉對(duì)嚴(yán)重膿毒癥大鼠的治療效果

時(shí)間〔天〕212341007550025存活率〔%〕5670.5************正丁酸鈉治療組嚴(yán)重膿毒癥組血清HMGB1(ng/ml)正常對(duì)照組**膿毒癥患者血清HMGB1水平與預(yù)后的關(guān)系存活組死亡組膿毒癥患者*血清HMGB1(ng/ml)休克初期失血性休克患者血清HMGB1水平與血壓的關(guān)系低血壓期血壓正常血壓恢復(fù)期HMGB1出現(xiàn)較晚且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，與膿毒癥的發(fā)生、開(kāi)展密切相關(guān)體液中存在穩(wěn)定、持續(xù)，防止“早期〞細(xì)胞因子半衰期短、“脈沖〞式改變的缺陷可能成為反映膿毒癥、MODS病理過(guò)程更為方便、實(shí)用的監(jiān)測(cè)指標(biāo)檢測(cè)HMGB1的臨床意義

生物喋呤及其調(diào)節(jié)作用一氧化氮(NO)過(guò)度產(chǎn)生是誘發(fā)膿毒性休克和MODS的最后共同通路，而生物喋呤(BH4)為一氧化氮合酶重要的輔因子，調(diào)控著細(xì)胞內(nèi)NO的產(chǎn)生。盡管BH4確實(shí)切病理效應(yīng)尚未明了，我們的研究發(fā)現(xiàn)，它可能作為潛在“炎癥因子〞參與了內(nèi)/外毒素所致膿毒性休克及MODS的病理生理過(guò)程。內(nèi)毒素可刺激多種細(xì)胞中GPT-CHI基因/蛋白表達(dá)和BH4產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)iNOS基因表達(dá)。

內(nèi)/外毒素休克動(dòng)物肝、肺、腎等組織生物喋呤含量分別與反映相應(yīng)器官損害的功能指標(biāo)呈顯著正相關(guān)關(guān)系。中和毒素及GPT-CHI抑制劑可不同程度地抑制組織生物喋呤的合成過(guò)程。12生物喋呤在膿毒性休克和MODS中的作用3BH4為iNOS重要輔因子，可促進(jìn)NO不斷合成、釋放；NO大量誘生加重內(nèi)毒素所致血流動(dòng)力學(xué)障礙、細(xì)胞毒作用和局部組織損傷。BH4與內(nèi)/外毒素在誘導(dǎo)iNOS表達(dá)及促進(jìn)TNF-a產(chǎn)生方面具有協(xié)同效應(yīng),可造成廣泛炎癥反響。采用GTP-CHI抑制劑或BH4競(jìng)爭(zhēng)抑制劑能有效拮抗低血壓，提高多器官微循環(huán)灌注。膿毒癥時(shí)BH4與MAPKp38激活密切相關(guān)。12生物喋呤介導(dǎo)組織損傷效應(yīng)的機(jī)理34新喋呤在體液中存在較穩(wěn)定，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，不易滅活或降解，克服了某些炎性介質(zhì)作為早期診斷指標(biāo)的缺陷。

通過(guò)64例大面積燒傷和41例多發(fā)傷病人前瞻性觀察，確立了新喋呤對(duì)嚴(yán)重膿毒癥的預(yù)警閾值(35.0nmol/L)。嚴(yán)重?zé)齻笱h(huán)新喋呤水平改變較早，自傷后3天起并發(fā)MODS者其含量持續(xù)上升，比臨床出現(xiàn)MODS提前數(shù)天作出判斷。發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用新喋呤和內(nèi)毒素能進(jìn)一步提高M(jìn)ODS的臨床診斷效率。

新喋呤與創(chuàng)、燒傷后嚴(yán)重膿毒癥及MODS的關(guān)系

血清新喋呤含量與MODS積分值的關(guān)系傷后時(shí)間〔天〕項(xiàng)目137142128新喋呤/積分值r值-0.1770.4700.7220.2640.8110.080P值>0.05<0.05<0.01>0.05<0.01>0.05

敏感性特異性準(zhǔn)確性陽(yáng)性陰性