免疫室SOP文件及孟姜女故事研究

丙型肝炎病毒抗體檢測（酶聯(lián)免疫法）1、原理：本法采用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗原理。在微孔條上預包被基因重組HCV結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)區(qū)，配以酶標記IgG抗體及TMB顯色等其他試劑，檢測人血清或血漿中的丙型肝炎病毒抗體。2、標本采集與處理?2.1受檢者準備：對于體檢對象抽血前保持平時的飲食習慣，采血前應禁食4-6小時。2.2靜脈采血：除非是臥床病人，一般在采血時取坐位。體位影響水分在血管內(nèi)外的分布，因此影響測定水平。故在采血前至少應靜坐５分鐘。一般從肘靜脈取血，使用止血帶的時間不超過１分鐘，穿刺成功后立即松開止血帶。2.3采血管：一般采用血清做檢驗，可以用一般潔凈的塑料管或玻璃試管作為容器。2.4標本處理：血液標本應盡快地送實驗室。本試劑使用樣品為人血清或血漿，含EDTA、檸檬酸鈉或肝素等抗凝劑的樣品可用于本實驗。2.5標本接收：接收標本時應檢查標本是否符合要求(要求密封、無溶血、無雜物)、所用試管是否正確、試管是否填寫完整、并問訊采血日期，對不合格標本應退回重采，并填寫記錄。2.6標本儲存：樣品中應無微生物，可在2-8oc儲存1周，長期儲存應低溫凍存，避免反復凍融。3、試劑與儀器：?3.1測定試劑：3.1.1生產(chǎn)廠商：北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司3.1.2批準文號：國藥準字S200100143.1.3包裝：96T×13.1.3試劑配置：濃縮洗滌液50ml×1瓶樣品稀釋液12ml×1瓶HCV酶標板8×12孔或12×8孔HCV酶標試劑12ml×1瓶HCV陽性對照0.2ml×1支HCV陰性對照0.2ml×1支底物液A、B液各6ml×1瓶終止液6ml×1瓶自封袋1個封版膜2張說明書1份3．2測定儀器：3.2.1酶標儀：上海安泰modelMT-8583.2.2洗板機：ANALYTECH8284、操作步驟：4．1配液：濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋。4．2編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照3孔，陽性對照2孔和空白對照1孔（空白對照孔只加稀釋液不加樣品及酶標試劑）其余各孔加入100UL樣本稀釋液。4．3加樣：分別在相應孔中加入待測樣品，陰，陽對照10微升，輕輕振蕩混勻。4．4溫育：用封版膜封版后，置37oc溫育60分鐘。4．5洗滌：揭掉封版膜，用洗板機洗滌5遍，最后一次盡量扣干。4．6加酶標抗體：空白對照孔不加酶標試劑，每孔加入酶標記抗體100微升，輕輕振蕩混勻。4．7溫育：置37oc溫育30分鐘。4．8洗滌：揭掉封版膜，用洗板機洗滌5遍，最后一次盡量扣干4．9顯色：每孔加入顯色劑A，B液各1滴（50微升），輕輕振蕩勻，37oc避光顯色30分鐘。4．10終止：每孔加終止液1滴（50微升），輕輕振蕩混勻。4．11測定：10分鐘內(nèi)測定結(jié)果，設定酶標儀單波長450nm或雙波長450nm/600-650nm測定。用空白孔調(diào)零點后測定各孔A值。5：結(jié)果判斷5．1目測：在白色背景下觀察各孔顯色情況，有明顯黃色者為丙型肝炎病毒抗體（抗HCV）陽性；無色者為丙型肝炎病毒抗體（抗HCV）陰性。5．2酶標儀檢測：5．2．1臨界值（CUT/OFF）計算：CUT/OFF=陰性對照孔A均值+0.12。（不足0.02按0.02計算）5．2．2陽性判定：樣品A值≥臨界值（CUTOFF）者判為抗HCV陽性。(注意初試陽性應重新取樣雙孔復試)5．2．3陰性判定：樣品A值<臨界值（CUTOFF）者判為抗HCV陰性。6：注意事項：6．1本品僅用于體外診斷，操作應按說明書嚴格進行。封版膜不能重復使用，不同批號酶標板、酶標試劑和陰陽對照不可混用，不能與其他廠家試劑混用。6．2避免在有揮發(fā)性物質(zhì)及次氯酸類消毒劑（如84消毒液）的環(huán)境下操作。6．3使用前請將試劑平衡至室溫（平衡30分鐘以上）實驗前將試劑輕輕振蕩混勻，使用后立即放回2-8oc.未用完的微孔板條與干燥劑一起用自封袋密封2-8oc保存。過期試劑請勿使用。6．4加樣時必須使用加樣器，并經(jīng)常校對加樣器的準確性。加入不同樣品或不同試劑組分時，用更換加樣器吸頭和加樣槽，以防出現(xiàn)交叉污染。6．5洗滌時各孔均需加滿洗液，防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。使用洗板機應設定30-60秒浸泡時間。再洗板結(jié)束后，必須立即進行下一步，不可使酶標板干燥。避免長時間的中斷實驗步驟，以確保每孔實驗條件的均一。6．6結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準。讀取結(jié)果時，應擦干酶標板底部，且孔內(nèi)不能有氣泡。不要觸碰孔底部的外壁，指印或劃痕都可能影響板孔的讀值。6．7所有樣品、廢液和廢棄物都應按傳染物處理。終止液為硫酸，使用時必須注意安全。6．8顯色時必須加顯色劑A液后再加顯色劑B液，以免顯色過低。6．9由于ELISA反應原理的限制，本試劑檢測陰性并不排除HCV感染的可能。檢測的陽性結(jié)果必須結(jié)合臨床信息進行分析。7：臨床意義：檢測人血清或血漿中的HCV抗體。適用于血液的篩查及臨床丙型肝炎病毒感染的輔助診斷。梅毒螺旋體抗體（酶聯(lián)免疫法）1、原理：本試劑盒采用雙抗原夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗原理。在微孔條上預包被梅毒螺旋體抗體基因重組抗原，配以酶標記抗原及TMB顯色劑等其他試劑，檢測人血清或血漿中的梅毒螺旋體抗體。2、標本采集與處理?2.1受檢者準備：對于體檢對象抽血前保持平時的飲食習慣，采血前應禁食4-6小時。2.2靜脈采血：除非是臥床病人，一般在采血時取坐位。體位影響水分在血管內(nèi)外的分布，因此影響測定水平。故在采血前至少應靜坐５分鐘。一般從肘靜脈取血，使用止血帶的時間不超過１分鐘，穿刺成功后立即松開止血帶。2.3采血管：一般采用血清做檢驗，可以用一般潔凈的塑料管或玻璃試管作為容器。2.4標本處理：血液標本應盡快地送實驗室。本試劑使用樣品為人血清或血漿，含EDTA、檸檬酸鈉或肝素等抗凝劑的樣品可用于本實驗。2.5標本接收：接收標本時應檢查標本是否符合要求(要求密封、無溶血、無雜物)、所用試管是否正確、試管是否填寫完整、并問訊采血日期，對不合格標本應退回重采，并填寫記錄。2.6標本儲存：樣品中應無微生物，可在2-8oc儲存1周，長期儲存應低溫凍存，避免反復凍融。3、試劑與儀器：?3.1測定試劑：3.1.1生產(chǎn)廠商：北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司3.1.2批準文號：國藥準字S200100133.1.3包裝：96T×13.1.3試劑配置：濃縮洗滌液50ml×1瓶TP酶標板8×12孔或12×8孔TP酶標試劑12ml×1瓶TP陽性對照0.2ml×1支TP陰性對照0.2ml×1支顯色劑A、B液各6ml×1瓶終止液6ml×1瓶自封袋1個封版膜2張說明書1份3．2測定儀器：3.2.1酶標儀：上海安泰modelMT-8583.2.2洗板機：ANALYTECH8284、操作步驟：4．1配液：濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋。4．2編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照3孔，陽性對照2孔和空白對照1孔（用雙波長檢測，可不設空白對照孔）4．3加樣：分別在相應孔中加入待測樣品，陰，陽對照100微升，輕輕振蕩混勻。4．4溫育：用封版膜封版后，置37oc溫育60分鐘。4．5洗滌：揭掉封版膜，用洗板機洗滌5遍，最后一次盡量扣干。4．6加酶標抗體：空白對照孔不加酶標試劑，每孔加入酶標記抗體100微升，輕輕振蕩混勻。4．7溫育：用封版膜封板后，置37oc溫育30分鐘。4．8洗滌：揭掉封版膜，用洗板機洗滌5遍，最后一次盡量扣干4．9顯色：每孔加入顯色劑A，B液各1滴（50微升），輕輕振蕩勻，37oc避光顯色30分鐘。4．10終止：每孔加終止液1滴（50微升），輕輕振蕩混勻。4．11測定：10分鐘內(nèi)測定結(jié)果，設定酶標儀波長于450nm（建議雙波長450nm/600-650nm測定）用空白孔調(diào)零點后測定各孔A值。5：結(jié)果判斷5．1目測：在白色背景下觀察各孔顯色情況，有明顯黃色者為梅毒螺旋體抗體（TP-AB）陽性；無色者為梅毒螺旋體抗體（TP-AB）陰性。5．2酶標儀檢測：5．2．1臨界值（CUT/OFF）計算：臨界值=陰性對照孔A均值+0.18。5．2．2陽性判定：樣品A值≥臨界值（CUTOFF）者判為TP陽性。(注意:初試陽性應重新取樣雙孔復試)5．2．3陰性判定：樣品A值<臨界值（CUTOFF）者判為TP陰性。6：注意事項：6．1本品僅用于體外診斷，操作應按說明書嚴格進行。封版膜不能重復使用，不同批號酶標板、酶標試劑和陰陽對照不可混用，不能與其他廠家試劑混用。6．2避免在有揮發(fā)性物質(zhì)及次氯酸類消毒劑（如84消毒液）的環(huán)境下操作。6．3使用前請將試劑平衡至室溫（平衡30分鐘以上）實驗前將試劑輕輕振蕩混勻，使用后立即放回2-8oc.未用完的微孔板條與干燥劑一起用自封袋密封2-8oc保存。過期試劑請勿使用。6．4加樣時必須使用加樣器，并經(jīng)常校對加樣器的準確性。加入不同樣品或不同試劑組分時，用更換加樣器吸頭和加樣槽，以防出現(xiàn)交叉污染。6．5洗滌時各孔均需加滿洗液，防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。使用洗板機應設定30-60秒浸泡時間。再洗板結(jié)束后，必須立即進行下一步，不可使酶標板干燥。避免長時間的中斷實驗步驟，以確保每孔實驗條件的均一。6．6結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準。讀取結(jié)果時，應擦干酶標板底部，且孔內(nèi)不能有氣泡。不要觸碰孔底部的外壁，指印或劃痕都可能影響板孔的讀值。6．7所有樣品、廢液和廢棄物都應按傳染物處理。終止液為硫酸，使用時必須注意安全。6．8顯色時必須加顯色劑A液后再加顯色劑B液，以免顯色過低。6．9由于ELISA反應原理的限制，本試劑檢測陰性并不排除HCV感染的可能。檢測的陽性結(jié)果必須結(jié)合臨床信息進行分析。7：臨床意義：檢測人血清或血漿中的梅毒螺旋體抗體。適用于血液的篩查及臨床梅毒螺旋體抗體感染的輔助診斷。乙肝五項操作規(guī)程1、目的：通過對乙型肝炎病毒抗原、抗體系統(tǒng)的檢測，用于乙肝的臨床診斷，還可應用于對供血員的乙肝篩選、乙肝流行病學的調(diào)查，了解各地人群乙型肝炎感染狀況。此外，還可用于乙肝疫苗免疫效果的觀察。2、方法：酶聯(lián)免疫吸附試驗（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA）試驗過程大致分三個步驟：=1\*GB3①包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附結(jié)合到固相載體表面，使抗原或抗體固相化。=2\*GB3②抗原抗體反應：先后加入被檢標本和酶標記物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應而被結(jié)合固定，經(jīng)洗滌除去游離的酶標記物。=3\*GB3③酶促反應：在反應體系中加入酶的相應底物，使之發(fā)生酶促反應而顯色。3.臨床意義：HBV抗原抗體血清學標志與臨床關系較為復雜，必須結(jié)合臨床特點，對各項檢測結(jié)果進行綜合分析，必要時進行HBV-DNA的檢測。常見的HBV抗原、抗體血清學標志物檢測結(jié)果的分析見下表：HBsAgHBsAbHBcAbHBeAgHBeAb結(jié)果分析IgMIgG＋———＋—潛伏期、感染早期或無癥狀攜帶者＋—＋—＋—急性乙型肝炎＋—＋＋＋/——急性乙型肝炎后期或慢性感染＋——＋—＋曾感染過HBV—＋————感染過HBV或接種乙型肝炎疫苗后

乙型肝炎表面抗原（HBsAg）1、原理：采用抗-HBs包被反應板，加入待測樣本，經(jīng)孵育后，加入抗-HBs-HRP,當樣本中存在HBsAg時，該HBsAg與包被抗-HBs結(jié)合并與抗-HBs-HRP結(jié)合形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs-HRP復合物，加入TMB底物產(chǎn)生顯色反應，反之則無顯色反應。2、標本采集與處理?2.1受檢者準備：對于體檢對象抽血前保持平時的飲食習慣，采血前應禁食4-6小時。2.2靜脈采血：除非是臥床病人，一般在采血時取坐位。體位影響水分在血管內(nèi)外的分布，因此影響測定水平。故在采血前至少應靜坐５分鐘。一般從肘靜脈取血，使用止血帶的時間不超過１分鐘，穿刺成功后立即松開止血帶。2.3采血管：一般采用血清做檢驗，可以用一般潔凈的塑料管或玻璃試管作為容器。2.4標本處理：血清：采血后，室溫下自然放置1-2小時，待血液凝固、血塊收縮后，在于3000轉(zhuǎn)每分鐘離心15分鐘，吸出血清待用。血漿：采血后，樣本和抗凝劑輕輕顛倒混勻6-8次后，充分離心，將血漿與血細胞分離后，吸出血漿待用。2.5標本接收：接收標本時應檢查標本是否符合要求(要求密封、無溶血、無雜物)、所用試管是否正確、試管是否填寫完整、并問訊采血日期，對不合格標本應退回重采，并填寫記錄。2.6標本儲存：一般該標本應隨到隨做，血清和血漿標本在2-8oc保存。如需長期保存，可在-20℃3、試劑與儀器：3.1測定試劑：3.1.1生產(chǎn)廠商：英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司3.1.2批準文號：國藥準字S109101483.1.3包裝：48T×1、96T×13.1.3試劑配置：25倍濃縮稀釋液40ml×1瓶HBsAg微孔反應板96孔HBsAg酶結(jié)合物6.2ml×1瓶HBsAg陽性對照1.0ml×1瓶HBsAg陰性對照1.0ml×1瓶顯色液A、B液各8.0ml×1瓶終止液7ml×1瓶封板紙5片說明書1份3．2測定儀器：3.2.1酶標儀：上海安泰MODELMT-8583.2.2洗扳機：ANALYTECH8284、操作步驟：4．1配液：配制工作濃度洗滌液（以純化水做25倍稀釋）4．2編號：將樣品對應微孔按序編號（共預留陰性對照孔3孔、陽性對照1孔、建議預留空白對照1孔）4．3加樣：加入75微升待測樣本和陰、陽性對照與反應孔中。4．4溫育：用封片紙覆蓋反應板后，置37oc溫育60分鐘。4．5加酶標抗體：取出反應板，撕去封片，在已加入待測樣本和陰性、陽性對照孔中加入50微升酶結(jié)合物。微孔振蕩器或手工輕輕振蕩10秒鐘。4．6溫育：用封片紙覆蓋反應板后，置37oc溫育30分鐘。4．6洗滌：4．6．1手工：扣去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置20秒，扣去洗滌液，重復5次在吸水紙上拍干。4．6．2洗板機：將孔內(nèi)液體甩干。選擇5次洗滌程序，洗板后在吸水紙上拍干。4．7顯色：每孔加入顯色劑A，B液各1滴（50微升），輕輕振蕩勻，用封板紙覆蓋反應板后，將反應板放置37oc孵育30分鐘。4．8終止：每孔加終止液1滴（50微升），混勻。4．9測定：用酶標儀讀數(shù)，波長450nm。（建議使用雙波長的酶標儀比色，參考波長630nm或630相近的波長）若需扣除顯色劑空白，則先用顯色劑空白對照孔校零，然后讀取各孔OD值。5：結(jié)果判斷5．1目測：在白色背景下觀察各孔顯色情況，有明顯黃色者為乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽性；無色者為乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陰性。5．2酶標儀檢測：5．2．1臨界值（CUT/OFF）計算：COV:Cut-offValue參考值PC：陽性對照OD值NCx:陰性對照平均OD值。NCx=(NC1+NC2+NC3)÷3檢測有效性：NCx≤0.1、PC≥1.0,則檢測結(jié)果有效。COV=NCx+0.100S:待測樣品的OD值，S/COV：待測樣本和COV的比值。5．2．2陽性判定：樣品OD值S/COV≥1.0者判為HBsAg陽性。5．2．3陰性判定：樣品OD值S/COV<1.0者判為HBsAg陰性。6：注意事項：6．1從冷藏環(huán)境中取出時應室溫平衡至室溫后方可使用，未用完的微孔條用加有干燥劑的自封袋密封保存。在平衡試劑的同時，待測樣本需平衡至室溫后再行測試。6．2使用前試劑應搖勻。6．3顯色過程必須封片。所有封片紙不能重復使用。6．4結(jié)果判斷須在反應終止后10分鐘內(nèi)完成。6．5嚴格按操作步驟進行，不同批次試劑不可混用。6．6洗板機洗板是應時常檢查加液頭，確保其暢通無阻塞，洗板是所用的吸水紙請勿反復使用。洗板機的管路用純化水沖洗，以防阻塞和腐蝕。6．7待測樣品不可用NaN3防腐。6．8本試劑盒應視為有傳染性物質(zhì)，請按傳染病實驗室檢查規(guī)程處理。7：臨床意義：檢測人血清或血漿樣本中的乙型肝炎病毒表面抗原，用于血源篩查及臨床乙型肝炎病毒感染的輔助判斷。乙型肝炎表面抗體（抗-HBs）1、原理：采用純化HBsAg包被反應板，加入待測樣品，同時加入HBsAg-HRP，如待測樣品中含有抗-HBs時，該抗-HBs就與包被HBsAg、HBsAg-HRP結(jié)合形成HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP復合物。加入TMB底物產(chǎn)生顯色反應，反之就顯色反應。2、標本采集與處理?2.1受檢者準備：對于體檢對象抽血前保持平時的飲食習慣，采血前應禁食4-6小時。2.2靜脈采血：除非是臥床病人，一般在采血時取坐位。體位影響水分在血管內(nèi)外的分布，因此影響測定水平。故在采血前至少應靜坐５分鐘。一般從肘靜脈取血，使用止血帶的時間不超過１分鐘，穿刺成功后立即松開止血帶。2.3采血管：一般采用血清做檢驗，可以用一般潔凈的塑料管或玻璃試管作為容器。2.4標本處理：血清：采血后，室溫下自然放置1-2小時，待血液凝固、血塊收縮后，在于3000轉(zhuǎn)每分鐘離心15分鐘，吸出血清待用。血漿：采血后，樣本和抗凝劑輕輕顛倒混勻6-8次后，充分離心，將血漿與血細胞分離后，吸出血漿待用。2.5標本接收：接收標本時應檢查標本是否符合要求(要求密封、無溶血、無雜物)、所用試管是否正確、試管是否填寫完整、并問訊采血日期，對不合格標本應退回重采，并填寫記錄。2.6標本儲存：一般該標本應隨到隨做，血清和血漿標本在2-8oc保存。如需長期保存，可在-20℃3、試劑與儀器：3.1測定試劑：3.1.1生產(chǎn)廠商：英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司3.1.2批準文號：國藥準字2009第34007023.1.3包裝：48T×1、96T×13.1.3試劑配置：25倍濃縮稀釋液40ml×1瓶HBsAb包被板96孔HBsAb酶標記抗體6.21ml×1瓶HBsAb陽性對照1.0ml×1瓶HBsAb陰性對照1.0ml×1瓶底物液A、B液8.0ml×1瓶終止液7.0ml×1瓶封片2片說明書 1份3．2測定儀器：3.2.1酶標儀：上海安泰MODELMT-8583.2.2洗扳機：ANALYTECH8284、操作步驟：4．1配液：濃縮洗滌液配置前充分混勻（如有結(jié)晶析出應充分溶解），將濃縮洗滌液（20*）用蒸餾水或去離子水按1：19稀釋后使用。4．2編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰陽性對照各2孔和空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑）4．3加樣：分別在相應孔中加入待測樣品50微升和陰，陽對照50微升及質(zhì)控血清。4．4加酶標抗體：空白對照孔不加酶標試劑，每孔加入酶結(jié)合物50微升，輕輕振蕩混勻。4．5溫育：置37oc溫育30分鐘。4．6洗滌：4．6．1手工：扣去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置5秒，扣去洗滌液，重復5次在吸水紙上拍干。4．6．2洗板機：將孔內(nèi)液體甩干。選擇4次洗滌程序，洗板后在吸水紙上拍干。4．7顯色：每孔加入顯色劑A，B液各1滴（50微升），輕輕振蕩勻，37oc避光顯色15分鐘。4．8終止：每孔加終止液1滴（50微升），混勻。4．9測定：用酶標儀讀數(shù)，取波長450nm（建議使用雙波長的酶標儀比色，參考波長630nm）測定各孔OD值先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。5：結(jié)果判斷5．1目測：在白色背景下觀察各孔顯色情況，有明顯黃色者為乙型肝炎表面抗體（抗－HBs）陽性；無色者為乙型肝炎表面抗體（抗－HBs）陰性。5．2酶標儀檢測：5．2．1臨界值（CUT/OFF）計算：COV=陰性對照平均OD值×2.1。（陰性對照孔OD值低于0.05者按0.05計算，高于0.05按實際OD值計算。5．2．2陽性判定：樣品的OD值大于或等于COV值時，說明HBsAg陽性。5．2．3陰性判定：樣品OD值小于COV值時，說明為HBsAg陰性。6：注意事項：6．1從冷藏環(huán)境中取出時試劑盒內(nèi)全部瓶裝試劑及待測標本所需微孔反應條應置37℃6．2使用前試劑應搖勻，并棄去1-2滴后垂直滴加。6．3封片不能重復使用。6．4結(jié)果判斷須在反應終止后10分鐘內(nèi)完成。6．5嚴格按操作步驟進行，不同批次試劑不得混用。6．6待測標本不可用NaN3防腐，如需稀釋標本，請用小牛血清稀釋。6．7本試劑盒應視為有傳染性物質(zhì)，請按傳染病實驗室檢查規(guī)程處理。乙型肝炎核心抗體（抗-HBc）1、原理：采用基因工程重組HbcAg包被反應板，加入待測樣品，同時加入抗-HBc-HRP，與抗原形成競爭結(jié)合，如待測樣品中抗-HbcAg含量高，則抗-HBc-HRP與HbcAg結(jié)合少，加入TMB底物時顯色淡，反之則顯色深。2、標本采集與處理?2.1受檢者準備：對于體檢對象抽血前保持平時的飲食習慣，采血前應禁食4-6小時。2.2靜脈采血：除非是臥床病人，一般在采血時取坐位。體位影響水分在血管內(nèi)外的分布，因此影響測定水平。故在采血前至少應靜坐５分鐘。一般從肘靜脈取血，使用止血帶的時間不超過１分鐘，穿刺成功后立即松開止血帶。2.3采血管：一般采用血清做檢驗，可以用一般潔凈的塑料管或玻璃試管作為容器。2.4標本處理：血清：采血后，室溫下自然放置1-2小時，待血液凝固、血塊收縮后，在于3000轉(zhuǎn)每分鐘離心15分鐘，吸出血清待用。血漿：采血后，樣本和抗凝劑輕輕顛倒混勻6-8次后，充分離心，將血漿與血細胞分離后，吸出血漿待用。2.5標本接收：接收標本時應檢查標本是否符合要求(要求密封、無溶血、無雜物)、所用試管是否正確、試管是否填寫完整、并問訊采血日期，對不合格標本應退回重采，并填寫記錄。2.6標本儲存：一般該標本應隨到隨做，血清和血漿標本在2-8oc保存。如需長期保存，可在-20℃3、試劑與儀器：3.1測定試劑：3.1.1生產(chǎn)廠商：英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司3.1.2批準文號：國藥準字2008第34007003.1.3包裝：48T×1、96T×13.1.3試劑配置：25倍濃縮稀釋液40ml×1瓶HBcAb包被板96孔HBcAb酶標記抗體6.21ml×1瓶HBcAb陽性對照1.0ml×1瓶HBcAb陰性對照1.0ml×1瓶底物液A、B液8.0ml×1瓶終止液7.0ml×1瓶封片2片說明書 1份3．2測定儀器：3.2.1酶標儀：上海安泰MODELMT-8583.2.2洗扳機：ANALYTECH8284、操作步驟：4．1配液：濃縮洗滌液配置前充分混勻（如有結(jié)晶析出應充分溶解），將濃縮洗滌液（25*）用蒸餾水或去離子水按1：19稀釋后使用。4．2編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰陽性對照各2孔和空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑）4．3加樣：將待測樣本用生理鹽水1:30稀釋。（稀釋樣本檢測結(jié)果為臨床意義；樣本原液加樣，檢測結(jié)果為流行病學意義。用戶可根據(jù)實際情況選擇。）分別在相應孔中加入稀釋樣本50微升和陰，陽對照50微升及質(zhì)控血清。4．4加酶標抗體：空白對照孔不加酶標試劑，每孔加入酶結(jié)合物50微升，輕輕振蕩混勻。4．5溫育：置37oc溫育30分鐘。4．6洗滌：4．6．1手工：扣去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置20秒，扣去洗滌液，重復5次在吸水紙上拍干。4．6．2洗板機：將孔內(nèi)液體甩干。選擇4次洗滌程序，洗板后在吸水紙上拍干。4．7顯色：每孔加入顯色劑A，B液各1滴（50微升），輕輕振蕩勻，37oc避光顯色15分鐘。4．8終止：每孔加終止液1滴（50微升），混勻。4．9測定：用用酶標儀讀數(shù)，取波長450nm（建議使用雙波長的酶標儀比色，參考波長630nm）測定各孔OD值先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。5：結(jié)果判斷5．1目測：在白色背景下觀察各孔顯色情況，有明顯黃色者為乙型肝炎表面抗體（HBcAb）陽性；無色者為乙型肝炎表面抗體（HBcAb）陰性。5．2酶標儀檢測：5．2．1臨界值（CUT/OFF）計算：未稀釋樣品CUT/OFF=陰性對照孔OD均值N×0.3。1:30稀釋樣品CUT/OFF=陰性對照孔OD均值N×0.5。5．2．2陽性判定：樣品OD值小于COV，說明該樣品HBcAb陽性。5．2．3陰性判定：樣品OD值大于或等于COV,說明該樣品HBcAb陰性。6：注意事項：6．1從冷藏環(huán)境中取出時試劑盒內(nèi)全部瓶裝試劑及待測標本所需微孔反應條應置37℃6．2使用前試劑應搖勻，并棄去1-2滴后垂直滴加。6．3封片不能重復使用。6．4結(jié)果判斷須在反應終止后10分鐘內(nèi)完成。6．5嚴格按操作步驟進行，不同批次試劑不得混用。6．6待測標本不可用NaN3防腐，如需稀釋標本，請用小牛血清稀釋。6．7本試劑盒應視為有傳染性物質(zhì)，請按傳染病實驗室檢查規(guī)程處理。乙型肝炎e抗原（HBeAg）1、原理：采用抗-HBe包被反應板，加入待測樣品，同時加入抗-HBe-HRP，如待測樣品中含有HBeAg時就與包被抗-HBe、抗-HBe-HRP結(jié)合形成復合物，加入底物產(chǎn)生顯色反應，反之就無顯色反應。2、標本采集與處理?2.1受檢者準備：對于體檢對象抽血前保持平時的飲食習慣，采血前應禁食4-6小時。2.2靜脈采血：除非是臥床病人，一般在采血時取坐位。體位影響水分在血管內(nèi)外的分布，因此影響測定水平。故在采血前至少應靜坐５分鐘。一般從肘靜脈取血，使用止血帶的時間不超過１分鐘，穿刺成功后立即松開止血帶。2.3采血管：一般采用血清做檢驗，可以用一般潔凈的塑料管或玻璃試管作為容器。2.4標本處理：血清：采血后，室溫下自然放置1-2小時，待血液凝固、血塊收縮后，在于3000轉(zhuǎn)每分鐘離心15分鐘，吸出血清待用。血漿：采血后，樣本和抗凝劑輕輕顛倒混勻6-8次后，充分離心，將血漿與血細胞分離后，吸出血漿待用。2.5標本接收：接收標本時應檢查標本是否符合要求(要求密封、無溶血、無雜物)、所用試管是否正確、試管是否填寫完整、并問訊采血日期，對不合格標本應退回重采，并填寫記錄。2.6標本儲存：一般該標本應隨到隨做，血清和血漿標本在2-8oc保存。如需長期保存，可在-20℃3、試劑與儀器：3.1測定試劑：3.1.1生產(chǎn)廠商：英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司3.1.2批準文號：國藥準字2009第34007023.1.3包裝：48T×1、96T×13.1.3試劑配置：25倍濃縮稀釋液40ml×1瓶HBeAg包被板96孔HBeAg酶標記抗體6.21ml×1瓶HBeAg陽性對照1.0ml×1瓶HBeAg陰性對照1.0ml×1瓶底物液A、B液8.0ml×1瓶終止液7.0ml×1瓶封片2片說明書 1份3．2測定儀器：3.2.1酶標儀：上海安泰MODELMT-8583.2.2洗扳機：ANALYTECH8284、操作步驟：4．1配液：濃縮洗滌液配置前充分混勻（如有結(jié)晶析出應充分溶解），將濃縮洗滌液（25*）用蒸餾水或去離子水按1：19稀釋后使用。4．2編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰陽性對照各2孔和空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑）4．3加樣：分別在相應孔中加入待測樣品50微升和陰，陽對照50微升及質(zhì)控血清。4．4加酶標抗體：空白對照孔不加酶標試劑，每孔加入酶結(jié)合物50微升，輕輕振蕩混勻。4．5溫育：置37oc溫育30分鐘。4．6洗滌：4．6．1手工：扣去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置浸泡30-60秒，扣去洗滌液，重復5次在吸水紙上拍干。4．6．2洗板機：將孔內(nèi)液體甩干。選擇4次洗滌程序，洗板后在吸水紙上拍干。4．7顯色：每孔加入顯色劑A，B液各1滴（50微升），輕輕振蕩勻，37oc避光顯色15分鐘。4．8終止：每孔加終止液1滴（50微升），混勻。4．9測定：用用酶標儀讀數(shù)，取波長450nm（建議使用雙波長的酶標儀比色，參考波長630nm）測定各孔OD值先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。5：結(jié)果判斷5．1目測：在白色背景下觀察各孔顯色情況，有明顯黃色者為乙型肝炎e抗原（HBeAg）陽性；無色者為乙型肝炎e抗原（HBeAg）陰性。5．2酶標儀檢測：5．2．1臨界值（CUT/OFF）計算：CUT/OFF=陰性對照孔OD均值N×2.1。（陰性對照孔OD值低于0.05者按0.05計算，高于0.05按實際OD值計算）5．2．2陽性判定：樣品OD值大于或等于COV值時，說明該樣品HBeAg陽性。5．2．3陰性判定：樣品OD值小于COV值時，說明該樣品HBeAg陰性。6：注意事項：6．1從冷藏環(huán)境中取出時試劑盒內(nèi)全部瓶裝試劑及待測標本所需微孔反應條應置37℃6．2使用前試劑應搖勻，并棄去1-2滴后垂直滴加。6．3封片不能重復使用。6．4結(jié)果判斷須在反應終止后10分鐘內(nèi)完成。6．5嚴格按操作步驟進行，不同批次試劑不得混用。6．6待測標本不可用NaN3防腐，如需稀釋標本，請用小牛血清稀釋。6．7本試劑盒應視為有傳染性物質(zhì)，請按傳染病實驗室檢查規(guī)程處理。乙型肝炎e抗體（抗-HBe）1、原理原理：采用抗-HBe、HBeAg包被反應板，加入待測樣品，同時加入抗-HBe-HRP，與抗原形成競爭結(jié)合，如待測樣品中抗-HBe含量高，則抗-HBe-HRP與HBeAg結(jié)合少，加入TMB底物時顯色淡，反之則顯色深。2、標本采集與處理?2.1受檢者準備：對于體檢對象抽血前保持平時的飲食習慣，采血前應禁食4-6小時。2.2靜脈采血：除非是臥床病人，一般在采血時取坐位。體位影響水分在血管內(nèi)外的分布，因此影響測定水平。故在采血前至少應靜坐５分鐘。一般從肘靜脈取血，使用止血帶的時間不超過１分鐘，穿刺成功后立即松開止血帶。2.3采血管：一般采用血清做檢驗，可以用一般潔凈的塑料管或玻璃試管作為容器。2.4標本處理：血清：采血后，室溫下自然放置1-2小時，待血液凝固、血塊收縮后，在于3000轉(zhuǎn)每分鐘離心15分鐘，吸出血清待用。血漿：采血后，樣本和抗凝劑輕輕顛倒混勻6-8次后，充分離心，將血漿與血細胞分離后，吸出血漿待用。2.5標本接收：接收標本時應檢查標本是否符合要求(要求密封、無溶血、無雜物)、所用試管是否正確、試管是否填寫完整、并問訊采血日期，對不合格標本應退回重采，并填寫記錄。2.6標本儲存：一般該標本應隨到隨做，血清和血漿標本在2-8oc保存。如需長期保存，可在-20℃3、試劑與儀器：3.1測定試劑：3.1.1生產(chǎn)廠商：英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司3.1.2批準文號：國藥準字2009第34007043.1.3包裝：48T×1、96T×13.1.3試劑配置：25倍濃縮稀釋液40ml×1瓶HBeAb包被板96孔HBeAb酶標記抗體6.21ml×1瓶HBeAb陽性對照1.0ml×1瓶HBeAb陰性對照1.0ml×1瓶底物液A、B液8.0ml×1瓶終止液7.0ml×1瓶封片2片說明書 1份3．2測定儀器：3.2.1酶標儀：上海安泰MODELMT-8583.2.2洗扳機：ANALYTECH8284、操作步驟：4．1配液：濃縮洗滌液配置前充分混勻（如有結(jié)晶析出應充分溶解），將濃縮洗滌液（25*）用蒸餾水或去離子水按1：19稀釋后使用。4．2編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰陽性對照各2孔和空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑）4．3加樣：分別在相應孔中加入待測樣品50微升和陰，陽對照50微升及質(zhì)控血清。4．4加酶標抗體：空白對照孔不加酶標試劑，每孔加入酶結(jié)合物50微升，輕輕振蕩混勻。4．5溫育：置37oc溫育30分鐘。4．6洗滌：4．6．1手工：扣去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置20秒，扣去洗滌液，重復5次在吸水紙上拍干。4．6．2洗板機：將孔內(nèi)液體甩干。選擇4次洗滌程序，洗板后在吸水紙上拍干。4．7顯色：每孔加入顯色劑A，B液各1滴（50微升），輕輕振蕩勻，37oc避光顯色15分鐘。4．8終止：每孔加終止液1滴（50微升），混勻。4．9測定：用用酶標儀讀數(shù)，取波長450nm（建議使用雙波長的酶標儀比色，參考波長630nm）測定各孔OD值先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。5：結(jié)果判斷5．1目測：在白色背景下觀察各孔顯色情況，無色者為乙型肝炎e抗體（HBeAb）陽性；黃色者為乙型肝炎e抗體（HBeAb）陰性。5．2酶標儀檢測：5．2．1臨界值（CUT/OFF）計算：COV=(陰性對照平均OD值+陽性對照平均OD值)×0.55．2．2陽性判定：樣品OD值S/CO≤1者判為HBeAb陽性。 5．2．3陰性判定：樣品OD值S/CO＞1者判為HBeAb陰性。6：注意事項：6．1從冷藏環(huán)境中取出時試劑盒內(nèi)全部瓶裝試劑及待測標本所需微孔反應條應置37℃6．2使用前試劑應搖勻，并棄去1-2滴后垂直滴加。6．3封片不能重復使用。6．4結(jié)果判斷須在反應終止后10分鐘內(nèi)完成。6．5嚴格按操作步驟進行，不同批次試劑不得混用。6．6待測標本不可用NaN3防腐，如需稀釋標本，請用小牛血清稀釋。6．7本試劑盒應視為有傳染性物質(zhì)，請按傳染病實驗室檢查規(guī)程處理。丙肝抗體檢測（HCV-Ab）1.方法：膠體金法2.原理：本品采用膠體金免疫層析專業(yè)技術(shù)，在玻璃纖維素膜上預包被金標鼠抗人IgG抗體，在硝酸纖維素膜上檢測線和對照線處分別包被丙肝混合抗原和人IgG抗體。檢測陽性標本時，血清樣本中HCV-Ab與膠體金標記鼠抗體IgG抗體結(jié)合形成復合物，由于層析作用復合物沿紙條向前移動，經(jīng)過檢測線時與預包被的抗原結(jié)合形成“Au-anti-IgGAb-HCVAb-HCVAg”夾心物而凝聚顯色，游離金標鼠抗人IgG抗體則在對照線處與人IgG抗體結(jié)合而富集顯色。陰性標本則僅在對照線處顯色，15分鐘內(nèi)觀察結(jié)果即可。3.試劑英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司4.試劑組成4.1HCV膠體金試紙條50條4.2說明書1份4.3樣品稀釋液4.4塑料滴管5.儀器目測6.操作步驟6.1將待測標本從儲存條件下取出，平衡至室溫并編號。6.2用塑料滴管加1滴樣本血清或血漿，加到試紙條指示箭頭下端的加樣處。6.3隨即加2滴樣本稀釋液。6.4加樣后，陽性標本可在1-15分鐘內(nèi)檢出，建議15分鐘再最終觀察并記錄試驗結(jié)果。7.結(jié)果判斷陰性：出現(xiàn)一條紅線。陽性：出現(xiàn)二條紅線。無效：不出現(xiàn)紅線。8.正常參考值陰性9.臨床意義同ELISA法測定。10.標本采集10.1無菌條件下抽取靜脈血2毫升，及時分離血清。10.2如采用血漿測定，臨床常用抗凝劑（EDTA、肝素、枸櫞酸鈉）不影響實驗結(jié)果。10.3標本溶血、脂血、嚴重黃疸或加熱滅活的血清標本均可能影響檢測結(jié)果。11.注意事項11.1標本應新鮮澄清。11.2在良好光線下判斷結(jié)果。11.3試劑從包裝中取出后，應盡快進行實驗，避免放置于空氣中時間過長，導致受潮。11.4檢測線顏色的深淺程度與樣品中抗體的滴度沒有一定的必然；聯(lián)系。11.5任何一種測試都不能絕對保證樣品中沒有低濃度抗體存在，所以陰性結(jié)果任何時候不能排除含有HCV暴露和感染的可能。11.6實驗證實，乙肝、艾滋、甲肝、庚肝、類風濕因子、紅斑狼瘡等各種類型的標本不會對測試產(chǎn)生干擾。梅毒抗體檢測（TP-Ab）1.方法：膠體金法2.原理：本品采用膠體金免疫檢測技術(shù)和層析原理，定性檢測血清（漿）樣本中的梅毒螺旋體抗體。檢測時，樣本中梅毒抗體可與膠體金標記抗原結(jié)合形成抗原抗體復合物，由于層析作用復合物沿紙條向前移動，經(jīng)過檢測線時與預包被的抗原結(jié)合形成“Au-TPAg-TPAb-TPAg”夾心物而凝聚顯色，游離膠體金標記梅毒抗原則在對照線處與與預包被的兔抗TP抗體結(jié)合而富集顯色。陰性標本則僅在對照線處顯色。3.試劑英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司4.試劑組成4.1TP膠體金試紙條50條4.2說明書1份5.儀器目測6.操作步驟6.1將待測標本從儲存條件下取出，平衡至室溫并編號。6.2將試劑置于干凈平坦的臺面上，在加樣條上用微量加樣器加入100ul樣本。6.3加樣后，20分鐘觀察并記錄試驗結(jié)果。7.結(jié)果判斷陰性：出現(xiàn)一條紅線。陽性：出現(xiàn)二條紅線。無效：不出現(xiàn)紅線。8.正常參考值陰性9.臨床意義同ELISA法測定。10.標本采集10.1靜脈的血清、血漿樣本必須在無菌條件下，并避免樣品溶血。10.2血清和血漿樣品（EDTA抗凝）收集后7天內(nèi)檢測，樣品須放在2-8℃保存11.注意事項11.1本試劑盒僅用于體外診斷試驗，僅用于人血清（漿），其它體液和樣本可能得不到準確結(jié)果。11.2樣本的加樣建議使用微量加樣器準確加入。11.3試劑從包裝中取出后，應盡快進行實驗，避免放置于空氣中時間過長，導致受潮。11.4檢測線顏色的深淺程度與樣品中抗體的滴度沒有一定的必然；聯(lián)系。22分鐘后判讀，結(jié)果無效。11.5任何一種測試都不能絕對保證樣品中沒有低濃度抗體存在，所以陰性結(jié)果任何時候不能排除含有梅毒螺旋體暴露和感染的可能。本品檢測陽性樣本，需用其它方法作進一步的確認。乙肝病毒表面抗原（HBsAg）1方法膠體金法2原理本品采用膠體金免疫層析專業(yè)技術(shù)，在玻璃纖維素膜上預包被HBsAg,在硝酸纖維素膜上檢測線和對照線處分別包被HBsAg單抗（sAb2）和羊抗鼠IgG.檢測陽性血清或血漿樣本時，樣本中HBsAg與膠體金標記抗體結(jié)合形成復合物，由于層析作用復合物沿紙條向前移動，經(jīng)過檢測線時與預包被的抗體結(jié)合形成夾心物而凝聚顯色，游離金標抗體則在對照線處與羊抗鼠IgG結(jié)合而富集顯色。陰性標本則盡在對照線處顯色。3試劑英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司4試劑組成4.1試紙條25條4.2說明書1份5儀器目測6操作步驟6.1將試紙條取出，水平放置并做好標記。6.2用加樣器或毛細吸管吸取60ul新鮮全血（或血清、血漿）緩慢滴加與試劑條箭頭下方的墊片上6.3為防止弱陽性標本的漏檢，請于加樣后10分鐘觀察并記錄試驗結(jié)果。7結(jié)果判斷陰性：出現(xiàn)一條紅線。陽性：出現(xiàn)二條紅線。無效：不出現(xiàn)紅線。8正常參考值陰性9臨床意義同ELISA法測定。10標本采集10.1可采用全血、血清、血漿進行檢測，血漿標本對抗凝劑無要求。10.2采集靜脈血的血清血漿應在無菌條件下，避免樣品溶血。10.3血清、血漿在7天內(nèi)檢測，樣品須放在2-8℃11注意事項11.1實驗室環(huán)境應保持一定濕度、避風。避免在過高溫度下進行。11.2試紙可在室溫下保存，謹防受潮。低溫保存下的應平衡室溫方可使用。11.3試劑從包裝中取出后，應盡快進行實驗，避免放置于空氣中時間過長，導致受潮。11.4實驗應在加樣10分鐘內(nèi)判讀結(jié)果，只需在檢測線出現(xiàn)紫紅線，即可判斷陽性結(jié)果。 室內(nèi)質(zhì)量控制程序1.目的：保證ELISA檢測結(jié)果準確可靠,充分發(fā)揮其方法學的優(yōu)點。2.該SOP變動程序：本標準操作程序的變動，可由任一使用本SOP的工作人員提出，并報經(jīng)下述人員批準簽字：專業(yè)主管、科主任。3.方法3.1分析前質(zhì)控3.1.1人員培訓⑴實驗是人操作的，因此檢驗人員需經(jīng)過培訓，熟練掌握本專業(yè)如下幾方面的技術(shù)知識：⑵檢驗項目的基本原理（ELISA原理）；⑶臨床意義；⑷熟悉檢測技巧，了解易出差錯的環(huán)節(jié)及難點；⑸熟悉檢測試劑性能（包括試劑盒組成，包被片段及其組成）；⑹熟悉檢測儀器的原理及性能；掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質(zhì)量控制知識。⑺某些特殊項目檢測如抗HIV等需經(jīng)有關部門組織的專門培訓班，考試合格后持證上崗。室內(nèi)質(zhì)控血清的制備：⑴質(zhì)控血清每年列出計劃報質(zhì)控組采購，一般采用CutOff值附近的陽性⑵質(zhì)控血清-20℃凍存?zhèn)溆?；⑶使用前室溫復融。試劑盒選擇衛(wèi)生部規(guī)定乙肝試劑，丙肝試劑，艾滋病試劑，梅毒試劑及血型試劑必須使用經(jīng)衛(wèi)生部生物制品檢定所檢定合格，并貼有防偽標簽的產(chǎn)品。試劑盒評價：⑴根據(jù)該試劑生物制品鑒定所的批批檢定報告，了解其質(zhì)量水平，按照質(zhì)量計劃選擇靈敏度高的或特異性高的試劑；⑵通過詢問試劑包被物的組成，如原料來源（基因工程或合成多肽），片段的組合（按比例混合或化學合成），片段的長短等判斷試劑的優(yōu)劣；⑶參考室間質(zhì)評報告中對試劑的評價結(jié)果，了解不同試劑的質(zhì)控成績。⑷臨床實驗室根據(jù)權(quán)威部門發(fā)布的試劑評價結(jié)果，了解市場上試劑的質(zhì)量優(yōu)劣。儀器質(zhì)控為使儀器保持最佳工作狀態(tài)應建立維護和校正儀器的標準操作程序（SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍），水浴箱（溫箱），洗板機和酶標儀。⑴移液器：ELISA加樣量?。?-100ｕl），其準確性直接影響實驗結(jié)果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，一般應在±10%以內(nèi)；⑵水浴箱：經(jīng)常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實測溫度是否一致，允許有±1℃的誤差；⑶洗板機：每個廠家設置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul，人工扣板時，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；⑷酶標儀：經(jīng)常維護其光學部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。⑸酶標儀校正程序：a)濾光片波長精度檢查：將不同波長的濾光片從酶標儀上卸下，用UV-2201型紫外-可見分光光度計（波長精度±0.3nm）于可見光區(qū)對每個濾光片進行掃描，其檢測值與標定值之差為濾光片波長精度。一般酶標儀無585nm濾光片，可選用550nm或630nm濾光片。450nm濾光片的檢定選用普魯蘭溶液（校正波長為630nm）。b)通道差與孔間差檢測：通道差檢測是取一只酶標板小孔杯（杯底須光滑，透明，無污染以酶標板架作載體，將其（內(nèi)含200ul甲基橙溶液吸光度調(diào)至0.500A左右）置于8個通道的相應位置，蒸溜水調(diào)零，于490nm處連續(xù)測三次,觀察其不同通道的檢測器測量結(jié)果的一致性，可用極差值來表示?？组g差的測量是選擇同一廠家，同一批號酶標2板條（8條共96孔）分別加入200ul甲基橙溶液（吸光度調(diào)至0.100A左右）先后置于同一通道，蒸溜水調(diào)零,于490nm處檢測，其誤差大小用±1.96s衡量。c)零點飄移（穩(wěn)定性觀察）：取8只小孔杯分別置于8個通道的相應位置，均加入200ul蒸餾水并調(diào)零，于490nm處每隔30分鐘測一次，觀察各個通道4小時內(nèi)吸光度的變化。d)精密度評價：每個通道3只小杯分別加入200ul高中低3種不同濃度的甲基橙溶解，蒸餾水調(diào)零，于490nm作雙份平行測定，每日測二次（上下午各一次），連續(xù)測定20天。分別計算其批內(nèi)精密度，日內(nèi)批精密度,日間精密度和總精密度及相應的CV值。e)線性測定：用電子天平精確稱取甲基橙配制5個系列的溶液，于490nm平行測8次，取其均值。計算其回歸方程，相關系數(shù)及標準估計誤差s，并用±1.96s表示樣品測量的誤差范圍.雙波長測定評價：取一分甲基橙溶液，分別加入3種不同濃度的溶血液（測定波長為490nm，校正波長為585nm），先后于8個通道檢測，每個通道測3次，比較各組之間是否具有統(tǒng)計學差異，以考察雙波長消除干擾組分的效果。3.1.5標本的采集和保存⑴標本采集時應盡量避免溶血，因紅細胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質(zhì)干擾立可讀方法的結(jié)果，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本會增加非特異性顯色造成假陽性。臨床實驗室⑵長菌的標本同樣的道理也易產(chǎn)生假陽性，因菌體中可能含有內(nèi)源性HRP也會產(chǎn)生假陽性反應。臨床實驗室⑶抗凝不完全的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗凝劑。⑷標本在冰箱中保存時間過長易導致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深，一般血清置4℃冰箱5天內(nèi)完成測試。如需保存一周以上則要-20℃冰凍保存，凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，融解時應上下顛倒充分混勻，同時避免氣泡?？缮舷骂嵉够旌停灰诨靹蚱魃蠌娏艺袷?。反復凍融會使抗體效價跌落，如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。⑸ELISA的靈敏度>1ng/ml水平上,標本間的污染要盡量避免，尤其不應與生化試驗用同一管標本。3.2分析中質(zhì)控臨床實驗室ELISA實驗的結(jié)果受操作影響很大，每個步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標儀讀數(shù)均應認真負責才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強特異的優(yōu)點。因此,應建立實驗項目的標準操作程序(SOP)。⑴加樣應用微量移液器（加樣槍）按規(guī)定的量加入微孔板底部，避免加在孔壁上部，不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。⑵每次加樣應更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染；干吸頭預先在血清中抽吸三次。⑶樣本稀釋，目的是為了減少非特異性反應，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時均需振蕩混勻。⑷如用滴瓶滴加試劑應先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣。3.2.2溫育⑴抗原抗體反應需要在一定溫度下（37°C），經(jīng)過一定的時間才能達到反應的平衡點，ELISA邊緣效應是由溫育形成的。所以溫育一般采用能使反應液溫度迅速達到平衡的水浴法。水要浸至板條的1/3處。⑵反應板不宜疊放，注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定控制，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。3.2.3洗滌⑴手工洗滌一般采用浸泡方法：1）甩去孔內(nèi)反應液；2）用洗滌液過洗一遍（即注滿孔后即甩去）；3）微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動；4）甩去孔內(nèi)液體，拍板，用紙吸干。重復以上操作至少5次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。⑵洗板機洗板一定要預先把板架放平，使洗板機上的每個放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內(nèi)液體全部吸干，同時要設置一定的浸泡時間。如出現(xiàn)機洗后拍板有較多殘留液時應再用手工洗2次以上。關機前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。臨床實驗室3.2.4顯色⑴HRP催化底物的一步呈色反應，同樣需要一定的時間和溫度，一定要按照說明書規(guī)定的時間溫度（一般為37°C，10-15分鐘）恒定反應后終止；⑵或根據(jù)臨界值質(zhì)控血清吸光度值達0.2左右使的時間而恒定反應時間。3.2.5酶標儀判讀結(jié)果a)顯色反應終止后應立刻比色（30分鐘內(nèi)）。b)常見的顯色系統(tǒng)有OPD和TMB二種，以后者最為常見，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結(jié)果。OPD終止后顯棕色，測定波長為490nm；TMB終止后顯黃色，測定波長為450nm，二種底物的校正波長均用630nm。c)使用雙波長的優(yōu)點可以消除反應板條上的劃痕手印的干擾。同時要注意反應板應用紙吸干后才能置酶標儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負值或損壞濾光片。3.3分析后質(zhì)控3.3.1報告方式定性試驗：國內(nèi)外為便于統(tǒng)一計算，一律按S/COV方式報告，S為標本A值，COV即CutOff值（或COV）⑴夾心法和間接法以S/COV≥1為陽性；競爭法與中和法以S/COV﹤1為陽性⑵COV的計算公式以試劑盒說明書的為準常見的有：a)COV=2.1×N（當N不足0.05時按0.05計），此公式由P/N>2.1換算而來，常用于夾心法。b)COV=0.5×N，從抑止率公式換算而來，常用于競爭，中和法。c)COV=N+C（C為常數(shù)），用于間接法。d)COV=C×P+N（C為常數(shù)），用于間接法。此公式最客觀，但對廠家要求很高，陰陽性對照測定值要基本恒定。定量分析：嚴禁用定性試劑盒做定量分析。⑴用已知量的系列標準品，繪制標準曲線，結(jié)果以絕對量或單位表示。ELISA的標準曲線每次都要和待測標本做在同一塊板上。⑵現(xiàn)有的ELISA定量試劑盒標準曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直線，要得到精確的結(jié)果實屬不易。⑴所有實驗的原始資料均應存檔；所有的記錄均應規(guī)范登記在冊；原始登記表應記錄試劑來源、批號；質(zhì)控血清的來源及測定值并注明是否在控；簽上實驗者姓名及審核者姓名。⑵如試驗結(jié)果對臨床診斷有決定意義，其樣本應保留，至少與病歷保存期一致。a)定性試驗ELISA定性試驗的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關，因此QC要保證試驗的靈敏度和特異性。生化的質(zhì)控圖方法僅能觀察靈敏度而無法監(jiān)控特異性。建議使用臨界值血清界定法：將試劑盒所設的陰陽性對照作為內(nèi)對照指示反應；另設臨界值、高值質(zhì)控血清，正常人血清作為外對照，與標本同時檢測，臨界值S/C.O≥1，高值質(zhì)控血清S/C.O≥10，正常人血清A值在0.05-0.07之間。陽性質(zhì)控血清失控（臨界值為靈敏度，高值為“HOOK”效應監(jiān)控）應重做陰性標本；陰性對照失控應重做陽性標本。以表格式記錄每塊板的外對照實驗結(jié)果，作為QC資料存檔。b)定量試驗ELISA定量試驗常見于腫瘤因子（如AFP，CEA，CA系列），激素類，免疫球蛋白類，這些物質(zhì)在體內(nèi)有一定的量（正常范圍），超出這個量才呈病理情況，故需定量測定。定量試驗的質(zhì)控方法可參考生化方式。c)“即刻性”質(zhì)控在開始進行質(zhì)控時，只需要有3個質(zhì)控血清測定值即可進行質(zhì)控。當這組數(shù)據(jù)擴大到20次有效值時就可以計算RCV的X，s。方法：⑴先將測定值從小到大排列，X1最小，Xn最大；⑵計算X和s；⑶計算SI上限值和下限值。SI上=（X最小-X）/S，SI下=（X最大-X）/S⑷對照SI表，檢查是否出控，SI上、下限≤規(guī)定值，在控；SI上或下限>規(guī)定值，失控。室間質(zhì)量控制程序目的采用一系列的辦法連續(xù)地、客觀地評價各實驗室的試驗結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)室內(nèi)質(zhì)控不易發(fā)現(xiàn)的不準確性，了解各實驗室之間結(jié)果的差異，并幫助校正，使具有可比性。?！净靖拍睢俊举|(zhì)量控制】是監(jiān)視ELISA操作全過程，排除誤差，維持標準化操作的一個管理過程。這一過程是通過一個反饋環(huán)路進行的：1.確定控制的對象；2.規(guī)定控制對象的標準（預期值）；3.制定或選擇控制方法和手段；4.測量實際數(shù)據(jù)；5.比較或較對實際數(shù)據(jù)與預期值之間的差異，并說明原因。超出預定誤差范圍，報警系發(fā)出信號，反饋通道中斷。6.采取行動，解決差異?；謴驮瓲睿ㄔ瓨藴薁顟B(tài)）的手段發(fā)揮作用。質(zhì)量控制主要采用質(zhì)控圖進行。質(zhì)控圖是把某一檢驗的性能數(shù)據(jù)與所計算出來的預期的"控制限"進行比較的圖。這種性能數(shù)據(jù)是在按規(guī)程正常進行時，按時間順序而抽選出來的，其目的是檢測檢驗過程中變異的可追查性原因?？勺纺嫘缘恼`差原因，是指除去隨機誤差以外的其他原因。在GLP概念里QC即指IQC，其定義為：由實驗室工作人員采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本室工作的可靠性，旨在監(jiān)測和控制本室常規(guī)工作的精密度，提高批內(nèi)批間樣本檢驗的一致性，以確定檢驗報告是否可靠或可否發(fā)出的一項工作。免疫測定方法的靈敏度和特異性要比生化方法高得多，因此QC手段不能照搬生化模式?！净覅^(qū)概念】把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將COV值上下的一段區(qū)域定為陽性可疑，需重復實驗或換試劑重測以確定其陰陽性，如仍落在灰區(qū)范圍內(nèi)則報告+（陽性）。灰區(qū)概念對血站系統(tǒng)的獻血員篩查尤為重要?；覅^(qū)的設置有二種：1.COV×（1±CV），CV為該試劑的批內(nèi)CV(一般在15-20%間)；2.COV±2s，s為實驗室做室內(nèi)質(zhì)控ROC的s?！靖咧点^鐮效應（HD-HOOK）】在二位點夾心ELISA中，其劑量反應曲線的高劑量（HIGHDOSE，HD）區(qū)段，線性走向不是呈平臺狀無限后延，而是向下彎曲狀，似一只鉤子或一把鐮刀（HOOK），MILES（1974）根據(jù)此現(xiàn)象寫實性地稱之為"HD-HOOK"效應。產(chǎn)生該現(xiàn)象的分子機理有"分子變構(gòu)說"和"濃度效應"等推論。一步法和二步法均存在"HD-HOOK"效應，只是前者出現(xiàn)的更早些，大多數(shù)是高值低吸光度，很少陰性結(jié)果?！举|(zhì)量控制血清】質(zhì)控血清是已有靶值的血清，在每次的常規(guī)檢驗中加入一份或數(shù)份，通過所得結(jié)果來了解本次檢驗的情況。質(zhì)控血清檢驗的結(jié)果如能控制其誤差在一定范圍內(nèi)，就說明該檢驗沒有發(fā)生不允許的誤差。如果出現(xiàn)超過允許誤差范圍的異常結(jié)果，提示該檢驗不合格，應尋找原因，糾正后，重檢待測標本。因此質(zhì)控血清在質(zhì)控工作中起重要作用。衛(wèi)生部臨床檢驗中心制備的乙肝標志物質(zhì)控血清，可以在-20℃保持半年定值不變。冰凍狀態(tài)融化使用時，應先混勻，未用完部分可在4℃保存5天。不宜反復冰融或自行分裝。開展某項檢驗的室內(nèi)質(zhì)控工作需要的質(zhì)控血清，一般按3-6個月用量準備。自制的不定值質(zhì)控血清，在一批質(zhì)控血清將用完之前，需準備下一批質(zhì)控血清。質(zhì)控血清要求性能穩(wěn)定，較長期內(nèi)效價不變，其理化性質(zhì)應與病人樣本相近，這樣才能有效地起到監(jiān)測作用。質(zhì)控制血清分定值和未定值兩種。如只用一份質(zhì)控血清定值，一般定在正常值與異常值交界點上，定性測定時處于弱陽性水平，稱為臨界值。乙肝標志物臨界值的制定，應按臨床要求，為臨床提供統(tǒng)一的判斷弱陽性的標準。臨界值質(zhì)控血清可以作為試劑盒中的陽性對照品和陰性對照品以外的第三個對照品，它可以靈敏地反映出試劑盒的檢出水平，確保弱陽性反應的標本不漏檢。質(zhì)控血清的制備，每個實驗室可以根據(jù)自己的條件，選用臨床中心提供的質(zhì)控血清，或按以下方法自己制備本室使用的質(zhì)控血清（以乙肝質(zhì)控血清為例）。1.收集新鮮的無溶血、無黃疸、無細菌污染的陽性血清。2.56℃3.離心或過濾除去沉淀。4.用10%的小牛血清或正常人血清（PBS緩沖液）將收集的血清稀釋至所需的濃度。如能用正常的人血清稀釋更好，因其成份更接近于檢測標本。5.抽濾除菌。按一次使用的量分裝小安瓿，封口，20℃6.標定含量。20-30次測定結(jié)果刪除>±2SD數(shù)據(jù)的均值作為靶值，并與已知定值血清對比測定?！臼议g質(zhì)評的方法】1.發(fā)質(zhì)控物進行調(diào)查，這是目前國內(nèi)外常見的形式，采用定期發(fā)放質(zhì)控物至各實驗室，各實驗室在規(guī)定的日期進行檢驗，并將結(jié)果報至組織者（部、省臨檢中心）。組織者通過統(tǒng)計分析，再將評價結(jié)果寄回實驗室，使其了解工作質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)問題，提高質(zhì)量。其缺點為由于各實驗室吃小灶或互相打電話修改結(jié)果而達不到真正評價作用。這是國內(nèi)外室間質(zhì)評的常用形式。部臨檢中心對乙肝標志物ELISA檢驗的室間質(zhì)評采用定期發(fā)放質(zhì)控物至各實驗室，各實驗室在規(guī)定的日期進行檢驗，并將檢驗結(jié)果報至部臨檢中心。部臨檢中心經(jīng)統(tǒng)計分析，將評價結(jié)果寄回各實驗室。通過評價，各實驗室了解本室工作質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)差距，并設法改進，以不斷提高檢驗質(zhì)量。這種評價方式有一定缺點，即各實驗室常對質(zhì)控物特殊對待，在檢驗時選用特殊試劑盒，選派特別的技術(shù)員進行檢驗，有的實驗室互相和對結(jié)果并作修改。這就使EQA的結(jié)果不能反映該實驗室日常工作水平。2.現(xiàn)場調(diào)查，事先不通知，臨時派出人員到各實驗室，規(guī)定采用常規(guī)方法，檢測一組標本，進行評價。這種方法可以解決實際問題，進行現(xiàn)場指導，組織者常因人力、物力的原因而不能經(jīng)常性進行。派觀察員到實驗室進行試劑調(diào)查，這種調(diào)查事先不通知，臨時派觀察員到實驗室，指定采用常規(guī)方法，檢驗規(guī)定的一組標本，進行評價。【成績計算方法】1.定性試驗：檢驗結(jié)果與預期結(jié)果一致，得100分，錯誤不得分，總計實驗室的得分。從全部參評單位的得分中求出該批質(zhì)控物平均分（X）和標準差（s），再通過公式計算出每一個實驗室的得分比值（SI）SI=（實驗室得分-平均分X）/平均標準差（s），SI在0.0-0.9間為良好,1.0-1.9間為優(yōu)秀,SI為負值時數(shù)值越大成績越差。2.定量試驗：SI=（實驗室測定值-預期值X）/預期值的標準差s，SI越小，表明越靠近靶值，成績越好。0-1.0為優(yōu)秀,1.1-2.0為良好,>2.0為差。SI無正負之分。質(zhì)量改進（QualityImprovement，QI）】質(zhì)量改進的建議來源于三方面：1.室內(nèi)質(zhì)控：提示實驗的精密度差，應規(guī)范各項操作；2.室間質(zhì)評：提示實驗的準確性差，應改進設備的準備或更換試劑；3.病人或醫(yī)生的報怨：提示實驗的偶然誤差，應分析實驗的質(zhì)控過程是否達標。一、孟姜女故事歷史的系統(tǒng)

(1)此故事最早見的，是《左傳》。襄公二十三年(公元前549)傳說，齊將記梁在莒國戰(zhàn)死；齊侯回來，在郊中遇見記梁之妻，使吊之。她以為郊中不是吊喪的地方，把他卻去。因此齊侯到她的家里吊了。在這一段記載里，只見得她是一個知禮的婦人。還有和記梁同戰(zhàn)的華還結(jié)果如何，書上沒有記載。

(2)次見的是《檀弓》。它引曾子的話道：“杞梁死，其妻迎其柩于路而哭之哀?！边@是說明她遇見齊侯為的是迎柩；“哭之哀”三字又涂上了感情的色彩了。

(3)其次是《孟子》上的淳于憑的話。他道：“王豹處于淇而河西善漚，綿駒處于高唐而齊右善歌，華周杞梁之妻善哭其夫而變國俗。”他把記梁妻的哭和王豹、綿駒的歌謳同舉，并說因她的哭夫而變了國俗，可見齊國唱她的哭調(diào)的風氣是很盛行的。據(jù)戰(zhàn)國時的記載，雍門周以哭見孟嘗君，孟嘗君為之流涕狼戾；韓娥過雍門，曼聲哀哭，一里老幼悲愁，其后雍門人善放娥之遺聲：可見齊都中人的好唱哭調(diào)原是戰(zhàn)國時的風氣。所以我們可以懷疑淳于髠這話是倒果為因的：因為齊國有此風氣，所以成了記梁之妻的哭；她的哭中原有韓娥們的成分，她的故事中加入的哀哭一段事原是戰(zhàn)國時音樂界風氣的反映。

(4)在西漢時，她的故事依然向著這方面發(fā)展。枚乘《雜詩》說：“上有弦歌聲，音響一何悲?誰能為此曲，無乃記梁妻?”王褒《洞策賦》形容策聲的妙，說：“鐳期、牙、悵張然而愕立兮，杞梁之妻不能為其氣?！?/p>

(5)到西漢的后期，這個故事的中心忽從悲歌而變?yōu)楸莱?。劉向在《說苑》及《列女傳》中都說她在夫死后向城而哭，城為之崩；《列女傳》中并說她因無人可靠，赴淄水而死。這樣的任性運行，和卻郊吊的知禮的態(tài)度大不相同，劉向采入書中，可見“齊東野人”的傳說的力量勝過了經(jīng)典中的記載了。

(6)她哭崩的城的所在，東漢初年王充《論據(jù)》里首說是記城，并說給她哭崩了五丈(《變動篇》》。杞國當把梁死時建都在緣陵(今山東昌樂縣)，離臨淄很近，從莒到齊可以經(jīng)過，這說如當實事看也說得通。順從這一說的，有東漢末邯鄲淳說的“杞崩城隅”(《曹娥碑》)，西晉時崔豹說的“杞都城感之而頹”(《古今注》》。

(7)三國時，她的故事忽然出了一個非常可怪之論。曹植在《黃初六年令》中說“杞妻哭梁，山為之崩”，又于《精微篇》中說“杞妻哭死夫，梁山為之傾”，可見那時有她哭崩梁山的傳說。這種傳說在王充時還沒有，所以他駁崩城之說時尚說“哭能崩城，復能壞山乎！”他從大處極力的一駁，哪知不久就從他駁桔的理內(nèi)中生出了新的傳說來了。梁山崩是春秋時的—件大事(成公五年，公元前五八六)，當然在山陜間可以構(gòu)成一種傳說。這種傳說和杞妻的傳說結(jié)合，主要的理由固然為了她的哀哭的感天，但一半也因了記梁的字“梁”，與杞梁的氏“杞”而崩杞城一樣。這種傳說似乎并不普遍(曹植文中既說“崩山隕霜”，又說“崩城隕霜”)，后來便歇絕了。李白詩中雖有。梁山感杞妻，鋤哭為之傾”(《東海有勇婦》)的話，說不定他是沿襲曹植所用的典故。(清《韓城縣志》云，“孟姜女祠在大崩邨，今廢”，或是這件故事的尾聲。)

(8)東漢末，蔡呂著的《琴操》有《記梁妻嘆》一曲，這是第一次把她的歌辭寫出的；歌道：“樂莫樂號新相知！悲莫悲今生別離!哀感皇天城為墮！”上二句是《楚辭·少司命》中語，下一句是她自己說墮城，都很奇突。此后敘述她的歌曲的，有西晉崔豹《古今注》和五代馬縞《中華古今注》。崔豹說此歌是她的妹明月所作，馬縞說是她的妹朝日所作。

(9)后魏酈道元在《水經(jīng)注》中說她哭崩的城是莒城(《沐水》條)。這或因《列女傳》中有“枕其夫之尸于城下而哭”的話，杞梁既死于莒，其妻也應該到莒去哭，所以由他自己改定的。這句話因為沒有傳說在背后襯托，所以沒有勢力；只有明楊儀及清王照圓一班讀書人才在《明良記＝和《列女傳》注中引了。

(10)《同賢記》(不知何人撰，見《{王周}玉集》引；日本寫本《{王周}玉集》題天平十九年，即唐玄宗天寶六年[七四七]，可見此書是中唐以前人所作，《同賢記》又在其前》說燕人記良避始皇筑長城之役，逃入孟超后園；孟超女仲姿浴于池中，仰見之，請為其妻。杞良辭之。她說：“女人之體不得再見丈夫”，就告知父親嫁他。夫妻禮畢，良回作所，主典怒其逃走，打殺之，筑城內(nèi)。仲姿既知，往向城哭。死人白骨交橫，不能辨別，乃刺指血滴白骨，云，“若是記良骨者，血可流入”。瀝至良骸，血逕流入！便收歸葬之。這個記載比較了以前的傳說頓然換了一副新面目。第一，它把杞梁改名為良，并且變成了秦朝的燕人而筑長城了。第二，它把杞梁之妻的姓名說出了，是姓孟名仲姿。第三，杞良是避役被捉打殺，筑在長城內(nèi)的，所以她要向城而哭。第四，筑入長城內(nèi)的死尸太多，所以她要滴血認骨。

這幾點都很可注意。孟仲姿的姓名或是從孟姜訛變的，也許孟姜是從孟仲姿訛變的，現(xiàn)在沒有證據(jù)，未能斷定。說杞良為燕人，想因燕近長城之故，或者這一種傳說是從燕地起來的。滴血認骨是六朝時盛行的一種信仰，蕭綜私發(fā)齊東昏墓一件事是一個證據(jù)。至于記梁筑長城，孟仲姿哭長城，這里面自有復雜的原因。其一，是由于事實上的。隋、唐間開邊的武功極盛，長城是邊疆上的屏障，戍役思家，閨人懷遠，長城便是悲哀所集的中心。記梁妻是以哭夫崩城著名的，但哭崩記城和莒城與當時民眾的情感不生什么聯(lián)系，在他們的情感里非要求她哭崩長城不可。其二，是由于樂曲上的。樂曲里說到城的，大抵是描寫筑城士卒的痛苦。如陳琳《飲馬長城窟行》說“君獨不見長城下，死人骸骨相撐拄”，王翰的詩說“長城道傍多白骨，……云是秦王筑城卒，……鬼哭啾啾聲沸天”，張籍《筑城曲》說“千人萬人齊抱杵，……軍吏執(zhí)鞭催作遲，……杵聲未定人皆死；家家養(yǎng)男當門戶，今日作君城下士”，都是。在這些歌詞中，都有招他們的閨人去痛哭崩城的傾向。杞梁妻既以哭城和崩城著名，自然會得請她作這些歌詞中的主人，把她的故事變?yōu)榭揲L城而收