生化試驗(yàn)報(bào)告

2013年生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)B2013年生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)B實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名：易順學(xué)號：201145009實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2013年11月9日實(shí)驗(yàn)分組：第6組組內(nèi)成員：練偉平（201144402）黃皓輝（201144406）李雨霖（201144407）任課教師：李曉暉小牛腸堿性磷酸酶的提純及酶活測定 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量 SDS-聚丙烯凝膠電泳測定蛋白質(zhì)相對分子量易順化工1101摘要堿性磷酸酶廣泛存測定在于動物臟器，微生物和植物中，本實(shí)驗(yàn)具體介紹怎樣從小牛腸中提取堿性磷酸酶，利用考馬斯亮藍(lán)法測定期中蛋白質(zhì)含量及酶的活性；通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量關(guān)鍵詞小牛腸堿性磷酸酶、酶活測定、考馬斯亮藍(lán)法、SDS-聚丙烯凝膠電泳堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,EC3.1.3.1,AKP)是一種非特異性磷酸單酯水解酶,能催化多種磷酸單酯類化合物的水解從而得到相應(yīng)的醇。AKP廣泛存在于動物各臟器、微生物和植物中。本實(shí)驗(yàn)擬通過刮去、離心、析出等方式提取小牛腸堿性磷酸酶，從而測定其酶的活性。目前測定蛋白質(zhì)含量的常用方法主要有凱氏定氮法、考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色法、紫外分光光度法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法(Lowry法),其次雙辛可寧酸(BCA)法、銀染法、熒光法(靈敏度一般較低)的報(bào)道。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道CBB法優(yōu)于其他的方法[3]。鑒于文獻(xiàn)報(bào)道CBB染色法與其它方法相比,具有消耗蛋白質(zhì)量小、靈敏度高、受外界因素影響小的優(yōu)點(diǎn),下面采用CBB染色法測定蛋白質(zhì)含量。Shapiro[4]于1967年首次報(bào)告了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)，根據(jù)他對11種蛋白質(zhì)電泳獲得的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)（或亞基)分子量的對數(shù)與蛋白質(zhì)分子的遷移率之間有直線關(guān)系。Weber[5]等人的深入研究，肯定了Shapiro的發(fā)現(xiàn)，確立了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)分子量的新方法。Shapiro和Weber所應(yīng)用的SDS-凝膠電泳緩沖系統(tǒng)為連續(xù)的磷酸鹽系統(tǒng)，后來Laemmli[6]將SDS電泳和DaVis[7]的不連續(xù)盤狀電泳結(jié)合起來，設(shè)計(jì)出不連續(xù)的SDS-Tris-甘氨酸系統(tǒng)，此系統(tǒng)具有很好的濃縮效應(yīng)，分辨率比磷酸系統(tǒng)更髙應(yīng)用更為廣泛。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種用作測定蛋白質(zhì)分子量常用的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法。它的基本原理是SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，形成復(fù)合物。而且各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠電泳中遷移率只與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)系，因此電泳遷移率就取決于蛋白質(zhì)分子的大小。用這種方法測定蛋白質(zhì)的分子量，操作簡便，快速，所需設(shè)備廉價(jià)，所得結(jié)果在分子量為15KD-200KD的范圍內(nèi)，與其他方法測得的分子量相比，誤差一般在+10%以內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)用這種方法測定給定蛋白質(zhì)樣品的相對分子質(zhì)量。1實(shí)驗(yàn)部分1.1試劑與儀器1.試劑(2):平衡緩沖液（0.01mol/LTris-HCl,pH0.8,含1.0x10-3mol/LMgCl2和1.0x10-5mol/LZnCl2）(3):底物緩沖液：1mol/L二乙醇胺-鹽酸緩沖液。（pH9.8）(4):酶的底物溶液：用底物緩沖液配制15x10-3mol/L對硝基苯磷酸二鈉溶液。(5):分離膠緩沖溶液：1.5mol/LTris-HCl緩沖液，pH8.8，已加入10%SDS。(7):濃縮膠緩沖液：0.5mol/LTris-HCl緩沖液，pH6.8，已加入10%SDS。(8):上樣緩沖液：100mgSDS、2mg溴酚藍(lán)、2g甘油，0.1mL巰基乙醇、2mL0.05mol/LpH8.0Tris-HCl，加超純水定容至10mL。(9):染色液：含0.1%考馬斯亮藍(lán)R250，40%甲醇和10%冰醋酸的染色液500mL，過濾后備用。(10):脫色液：500mL10%甲醇和10%冰醋酸的脫色液1000mL。(11):電泳緩沖液；考馬斯亮藍(lán)；生理鹽水。2.儀器1000W，220V.AC電子萬用爐（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；eppendorf5804R型冷凍離心機(jī)；JYL-350A型勻漿機(jī)（九陽公司）；UV762型紫外可見光分光光度計(jì)（棱光）；WD-9405A型脫色搖床（北京市六一儀器廠）；GSY—2型恒溫水浴1.2實(shí)驗(yàn)過程1.聚丙烯凝膠的制備1）.裝板2）.制備分離膠：小燒杯中按下表配置所需濃度的分離膠分離膠制備（濃度10%，制備量10mL）分離膠制備（濃度10%，制備量10mL）試劑用量H2O4.1mL30%丙烯酰胺3.4mL1.5mol/LTris-HCl緩沖液pH8.82.4mL10%過硫酸銨100μLTEMED10μL3）.制備濃縮膠：小燒杯中按下表配置所需濃度的濃縮膠：濃縮膠制備（濃度5%，制備量6mL）濃縮膠制備（濃度5%，制備量6mL）試劑用量H2O3.4mL30%丙烯酰胺1.0mL0.5mol/LTris-HCl緩沖液pH6.81.5mL10%過硫酸銨60μLTEMED8μL4）.蛋白質(zhì)樣品處理：按1:1體積比例加樣品和上樣緩沖液，100℃加熱使蛋白質(zhì)變性5）.濃縮膠聚合后，將凝膠玻璃板放到電泳裝置內(nèi)槽上，加入電泳緩沖液2.小牛腸堿性磷酸酶的分離提?。?）.取新鮮小牛腸，刮取其內(nèi)粘膜，加入1.5倍于其體積的水后高速勻漿15s,重復(fù)20次。2）.緩慢加入一倍體積冰冷正丁醇高速勻漿15s，重復(fù)20次后在4℃.10000rpm條件下離心15min3）.過濾去除雜質(zhì)后靜置分層，取下層水相，調(diào)pH到4.9.4℃.10000rpm條件下離心15min4).得到上清液23.8ml，調(diào)pH到6.5后，加入1.19g硫酸銨溶解。再加11.186ml冰冷丙酮，混勻，4℃靜置30min，4℃.10000rpm條件下離心15min5).得到30.0ml上清液，加入35.3ml冰冷丙酮4℃放置30min，再在4℃，10000rpm條件下離心15min6).取沉淀，完全溶于1.2ml平衡緩沖液后放冰箱中保存。7）.底物37℃水浴5min3．小牛腸堿性磷酸酶酶活性檢測1）.將酶稀釋20倍2）.紫外分光光度計(jì)在405nm波長，測定時(shí)間60s，取值2s，記錄范圍0.0-1.5條件下檢測3）.取2個(gè)2mL比色皿，加入上述（7）加熱的底物緩沖液，校對歸零。4）.將稀釋20倍的酶液20μL加到其中1個(gè)比色皿中（儀器外側(cè)），用手堵住皿口?？焖偕舷碌?次，放回分光光度計(jì)中，測定酶動力學(xué)曲線4.考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量：1）玻璃試管中加入5mL考馬斯亮藍(lán)。2）在1.5mL離心管中，取酶液分別稀釋50、100、200倍。3）各取100μL加入到5mL考馬斯亮藍(lán)試管中，混勻，反應(yīng)5min以上。4）紫外分光光度計(jì)檢測條件：595nm波長。5）取2個(gè)比色皿，加入考馬斯亮藍(lán)，分光光度計(jì)中校對歸零。6）將樣品放入外側(cè)比色皿中，讀吸光值。7）根據(jù)蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶蛋白濃度。5．SDS-聚丙烯凝膠電泳測定蛋白質(zhì)相對分子量：1）用移液槍依次在泳道加樣。2）電泳：連接正、負(fù)極，打開電源，開始時(shí)，電流控制在40A，樣品進(jìn)入分離膠后，緩慢升高電壓至140V或電流50-60A，保持電壓或電流強(qiáng)度不變。待溴酚蘭指示劑遷移至下沿處，停止電泳,用時(shí)約2h。3）剝膠染色：電泳結(jié)束后，取出凝膠玻璃板，用水沖洗，用金屬片從玻璃兩側(cè)輕輕撬開，使板內(nèi)進(jìn)入空氣，同時(shí)用水沖洗，取出凝膠板。將剝離下來的凝膠用水漂洗，轉(zhuǎn)入染色缸中，加染色液，置搖床染色15min。4）脫色：染色完畢，回收染色液，用水漂洗，加入脫色液，置搖床脫色，30min換1次脫色液，脫色至背景清晰。5）觀察測定蛋白的遷移率及條帶，對照標(biāo)準(zhǔn)樣品，分析蛋白樣品的分子量及純度。6）拍照電泳結(jié)果，用于完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。2結(jié)果與討論2.1考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量根據(jù)考馬斯亮藍(lán)常量法測蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，其方程為：y=0.697x-0.007；蛋白質(zhì)稀釋50倍的情況下測得吸光值為0.1998，根據(jù)方程，稀釋50倍時(shí)蛋白質(zhì)濃度C=0.297mg/ml，則原蛋白質(zhì)濃度C=14.8mg/ml。 2.2小牛腸堿性磷酸酶酶活檢測根據(jù)酶動力計(jì)算公式：比活力（U/mg）＝A/mi比活力（U/mg）＝A/minVRDE405VECLVR=1.5mL；D=10；E405=18.3L/(mol*cm)；VE=0.05mL；C=14.8mg/mL;L=0.5cm；所以比活力（U/mg）=0.997U/mg；2.3SDS-聚丙烯凝膠電泳 分析知，mark中出現(xiàn)了四條蛋白質(zhì)標(biāo)記線，根據(jù)其間距及參考文獻(xiàn)中給出的mark泳道各條蛋白質(zhì)標(biāo)記線間距，可判定由上到下mark泳道中的四條蛋白質(zhì)標(biāo)記線分別是兔磷酸化酶B，牛血清白蛋白，兔肌動蛋白和牛碳酸酐酶。樣品蛋白質(zhì)標(biāo)記線與牛血清白蛋白遷移率相近，所以樣品的分子量與牛血清白蛋白分子量相近，所以樣品的分子量大致為66,200/mol.實(shí)驗(yàn)說明：我們組的凝膠是拿回宿舍進(jìn)行脫色的，脫色了四天，跟別的組的同學(xué)相比較，很明顯的脫色時(shí)間過長，自己做的，樣品蛋白標(biāo)記線已經(jīng)不太清晰，我做的是第三、四條，圖上依稀只能看見一點(diǎn)點(diǎn)。2.4小牛腸堿性磷酸酶的提純及酶活測定問題討論1.測定底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響時(shí)，對酶反應(yīng)的哪些條件要加以控制？本實(shí)驗(yàn)所取的條件是什么?答：要控制酶的濃度和活性，pH，反應(yīng)溫度，控制劑或激活劑。本實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)溫度為37℃，酶濃度為提取的酶稀釋20倍后的濃度，pH為8.0.本實(shí)驗(yàn)的體會：做實(shí)驗(yàn)過程中，一開始我們組是在老師要求的稀釋10倍的情況下測的，結(jié)果濃度過高得不到比較理想的圖，所以在老師指導(dǎo)下稀釋了20倍后重新做了實(shí)驗(yàn)。我們學(xué)會了要根據(jù)實(shí)際情況隨時(shí)分析實(shí)驗(yàn)失敗的原因并采取措施來得到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.5考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量問題討論1、考馬斯亮藍(lán)G-250測定蛋白質(zhì)含量的原理是什么？答：考馬斯亮藍(lán)G-250測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種，考馬斯亮藍(lán)G-250在酸性溶液中的游離態(tài)呈紅褐色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色。前者最大吸收波長為465nm，后者為595nm。在蛋白質(zhì)濃度為1.10-1.0mg/ml之間時(shí)，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595

nm下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，從而可以通過測定吸光度來測定蛋白質(zhì)含量。2、如何正確使用分光光度計(jì)？答：實(shí)驗(yàn)時(shí)，在一開機(jī)預(yù)熱好的條件下，設(shè)置儀器參數(shù)后，先加入兩支空白考馬斯亮藍(lán)的比色皿校對歸零，然后將樣品放入外側(cè)比色皿中，關(guān)蓋讀吸光值。3.用本實(shí)驗(yàn)方法所得的測定值與樣品的實(shí)際值之間的誤差主要是什么原因引起的？答：主要是因?yàn)槊笣舛炔粶?zhǔn)確從而導(dǎo)致的誤差。2.6SDS電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量問題討論1、電極緩沖液中甘氨酸有何作用答：SDS中樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸，電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時(shí)氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。2、用SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量時(shí)為什么要用巰基乙醇？答：巰基乙醇使蛋白二硫鍵還原,有利于蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合,蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物帶上相同密度的負(fù)電荷，并可引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小，因此聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測定蛋白質(zhì)的分子量。3.樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘？答：加熱使蛋白變性。4.分離膠與濃縮膠中均含有TEMED和AP，試述其作用。答：TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合；AP提供驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合所必須的自由基。 參考文獻(xiàn)[1]修志龍等.生物化學(xué)[M].化學(xué)工業(yè)出版社.2008.[2]路蘋，于同泉，王淑英，等.蛋白質(zhì)測定方法評價(jià)[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006,21(2)[3]蓋新娜，蔣輝，盧靜，孫少華，王鉅用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法提純蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)與管理[4]李昌厚.紫外可見分光光度計(jì)及其應(yīng)用[M].化學(xué)工業(yè)出版社。2010-08-01[5]Weber,K.andM.Osborn,1975:IntheProtein.Third.Ed.Vol.1.HansNeurathandR.L.Hill(eds.),NewYork.[6]石繼紅，趙永同，工俊樓，等.SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳分析小分子多肽[J]第四軍醫(yī)人學(xué)學(xué)報(bào)，2000,21(6)TheExtractionofCalfIntestinalAlkalinePhosphataseandDeterminationofitsActivity,DeterminationofProteinContentbyCoomassieBrilliantBlue,DeterminationofProteinMolecularWeightUsingSDSElectrophoresisMethodShunYIChemicalreactionengineeringClass1101AbstractTheintestinaljuiceofca