TTPPA -2021 中藥注射劑體外抗氧化活性評(píng)價(jià) DPPH法

T/TPPAXXX-XXXX中藥注射劑體外抗氧化活性評(píng)價(jià)DPPH法1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了中藥注射劑體外抗氧化活性評(píng)價(jià)DPPH法的基本原則和要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于具有自由基清除能力的中藥注射劑體外抗氧化活性的評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T33087儀器分析用高純水規(guī)格及試驗(yàn)方法GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定GB/T12810實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器玻璃量器的容量校準(zhǔn)和使用方法JJG646移液器檢定規(guī)程GB/T27418測(cè)量不確定度評(píng)定與表示RB/T030化學(xué)分析中測(cè)量不確定度評(píng)估指南GB/Z19027GB/T19001的統(tǒng)計(jì)技術(shù)指南3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和文件適用于本文件。3.1中藥注射劑traditionalChinesemedicineinjection中藥注射劑是指在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，采用先進(jìn)的制備工藝，從中藥或天然藥物的單方或復(fù)方中提取有效物質(zhì)制成的可供注人體內(nèi)的制劑。3.2自由基freeradical任何包含未成對(duì)電子的原子或原子團(tuán)。3.3氧化oxidation分子或原子團(tuán)失去電子(或稱(chēng)氧化態(tài)增加)的過(guò)程。3.4抗氧化antioxidant某些物質(zhì)可以通過(guò)直接作用于自由基，或通過(guò)間接消耗掉可生成自由基的物質(zhì)，而達(dá)到有效抑制自由基氧化的反應(yīng)。3.5遮光shading2T/TPPAXXX-XXXX指用不透明的容器進(jìn)行包裝，使其不被照射，例如用棕色容器、黑色包裝材料包裹或置于暗箱。3.6半抑制濃度halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50,使DPPH控制溶液吸光度變化量為0.500時(shí)，對(duì)應(yīng)的供試品溶液或陽(yáng)性對(duì)照溶液的濃度。3.7相對(duì)抗氧化活性Relativeantioxidantactivity，RAA單位濃度供試品溶液使DPPH控制溶液吸光度下降與單位濃度陽(yáng)性對(duì)照溶液使DPPH控制溶液吸光度下降的比值。3.8回歸分析regressionanalysis將所關(guān)心的特性（通常稱(chēng)為“響應(yīng)變量”）的性能與潛在的原因（通常稱(chēng)為“解釋變量”聯(lián)系起來(lái)。這樣一種關(guān)系可通過(guò)科學(xué)、經(jīng)濟(jì)、工程等學(xué)科的模型作出規(guī)定，或經(jīng)驗(yàn)地得到。目的是幫助理解響應(yīng)變差的潛在原因，并解釋每個(gè)因素對(duì)該變差所起的作用有多大。通過(guò)統(tǒng)計(jì)將響應(yīng)變量的變差與解釋變量的變差聯(lián)系起來(lái)，以及將預(yù)期和實(shí)際響應(yīng)變量之間的偏差減至最小達(dá)到最佳擬合可做到這一點(diǎn)。3.9相關(guān)系數(shù)correlationcoefficient，R根據(jù)樣本數(shù)據(jù)計(jì)算的度量?jī)蓚€(gè)變量之間線性關(guān)系強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)量。3.10判定系數(shù)coefficientofdetermination，R2回歸平方和占總平方和的比例，它是對(duì)估計(jì)的回歸方程擬合優(yōu)度的度量。4原理2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（簡(jiǎn)稱(chēng)DPPH）是一種較為穩(wěn)定的、以氮為中心的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm附近有強(qiáng)吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使DPPH乙醇溶液光吸收減弱。DPPH乙醇溶液褪色程度與其接受的電子數(shù)呈線性關(guān)系，由此可評(píng)價(jià)供試品清除自由基的能力，即用半抑制濃度（IC50）評(píng)價(jià)抗氧化活性的大小，并通過(guò)與陽(yáng)性對(duì)照（L-抗壞血酸）抗氧化活性的比較，得到相對(duì)抗氧化活性（RAA），以評(píng)估不同供試品（如品種、批次等）間抗氧化活性。5環(huán)境、儀器、設(shè)備及耗材5.1對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的要求5.1.1實(shí)驗(yàn)室的溫度控制在25±2℃;5.1.2實(shí)驗(yàn)室的相對(duì)濕度要控制在45%~55%；5.1.3實(shí)驗(yàn)室的照度，一般試驗(yàn)區(qū)域不應(yīng)小于300Lx；對(duì)于稱(chēng)重、分析等區(qū)域照度不應(yīng)低于500Lx。3T/TPPAXXX-XXXX5.2對(duì)儀器、設(shè)備及耗材的要求5.2.1儀器設(shè)備電子分析天平（感量0.01mg/0.1mg可調(diào)節(jié)移液器（20~100μl精度0.02μl、0~200μl精度0.2μl、100~1000μl精度1μl、0.5~5ml精度0.005ml和1~10ml精度0.01ml等全波長(zhǎng)酶標(biāo)分析儀（波長(zhǎng)范圍200~900nm，吸光度值精確至0.001容量瓶（5±0.02ml、10±0.02ml、25±0.03ml、50±0.05ml和100±0.08ml等超純水儀；漩渦混合器（轉(zhuǎn)速600-3200rpm）；超聲波清洗器（40KHz）；暗箱等。5.2.2主要耗材96孔微孔板（96孔透明平底聚苯乙烯微孔板，帶蓋，孔容積360μL，建議工作容積75-200μL）；按扣蓋聚丙烯微量離心管（2ml、5ml）；微孔濾膜（0.45μm）；移液器吸頭（20~100μl、0~200μl、100~1000μl、0.5~5ml和1~10ml）；一次性注射器（2ml、5ml）；鋁箔等。6試劑和試藥除有另外說(shuō)明外，所用試劑均為分析純。6.1乙醇（Ethanol）別名：酒精,乙醇線性分子式：CH3CH2OHCASNo.：64-17-5分子量：46.07ECNo.：200-578-6BeilsteinNo.：1718733等級(jí)：液相色譜級(jí)（gradientgradeforliquidchromatography）6.22,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl）別名：2,2-二苯基-1-苦基肼,DPPH,1,1-二苯基-2-苦肼基自由基EmpiricalFormula(HillNotation)：C18H12N5O6CASNo.：1898-66-4分子量：394.32ECNo.：217-591-84T/TPPAXXX-XXXXBeilsteinNo.：18460816.3L-抗壞血酸（L-AscorbicAcid）別名：維生素C,抗壞血病因子,L-維生素CEmpiricalFormula(HillNotation)：C6H8O6CASNo.：50-81-7分子量：176.12ECNo.：200-066-2BeilsteinNo.：84272等級(jí)：認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（certifiedreferencematerial）、藥品二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（pharmaceuticalsecondarystandard）6.4供試品（Samples）指需要測(cè)定抗氧化活性的中藥注射劑或注射劑。6.5儀器分析用高純水（Ultrapurewaterforinstrumentalanalysis）除另有說(shuō)明，本方法所用水應(yīng)符合GB/T33087規(guī)定的儀器分析用高純水規(guī)格要求。7測(cè)定步驟7.1空白空白溶液的制備色譜乙醇。7.2DPPHDPPH溶液的制備取DPPH標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，精密稱(chēng)定，加色譜乙醇適量，混合均勻，即得（遮光保存）。DPPH控制溶液的制備精密量取DPPH溶液適量，加入色譜乙醇適量，使其濃度約為60μg/ml混合均勻，即得。測(cè)定其吸光度，其吸光度范圍為0.70~0.90。說(shuō)明DPPH溶液和DPPH控制溶液均應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。記錄DPPH控制溶液配制中DPPH溶液與色譜乙醇的配制比例，該比例將應(yīng)用于陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液和供試品反應(yīng)溶液的配制過(guò)程。7.3陽(yáng)性對(duì)照5T/TPPAXXX-XXXX陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備精密稱(chēng)取L-抗壞血酸適量，加高純水，分別制成每1ml含L-抗壞血酸5~20μg的系列溶液，混合均勻，即得。陽(yáng)性對(duì)照本底溶液的制備精密量取相同體積的上述濃度水平的陽(yáng)性對(duì)照溶液（與DPPH控制溶液的中色譜乙醇的加入體積相同）置于離心管底部，分別精密加入色譜乙醇（與DPPH控制溶液的中DPPH溶液的加入體積相同），混合均勻，置于暗箱反應(yīng)，即得。陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液的制備精密量取相同體積的上述濃度水平的陽(yáng)性對(duì)照溶液（與DPPH控制溶液的中色譜乙醇的加入體積相同）置于離心管底部，分別精密加入DPPH溶液（與DPPH控制溶液的中DPPH溶液的加入體積相同），混合均勻，置于暗箱反應(yīng)，即得。7.4供試品供試品溶液的制備精密稱(chēng)取/量取供試品適量，加高純水，分別制成一系列供試品溶液，至少制備由高到低的5個(gè)不同濃度水平（其濃度水平之比可以參考為1.50：1.25：1.00：0.75：0.50）。供試品本底溶液的制備精密量取相同體積的上述濃度水平的供試品溶液（與DPPH控制溶液的中色譜乙醇的加入體積相同）置于離心管底部，分別精密加入色譜乙醇（與DPPH控制溶液的中DPPH溶液的加入體積相同），混合均勻，置于暗箱反應(yīng)，即得。供試品反應(yīng)溶液的制備精密量取相同體積的上述濃度水平的供試品溶液（與DPPH控制溶液的中色譜乙醇的加入體積相同）置于離心管底部，分別精密加入DPPH溶液（與DPPH控制溶液的中DPPH溶液的加入體積相同），混合均勻，置于暗箱反應(yīng)，即得。7.5吸光度測(cè)定精密吸取上述空白溶液、陽(yáng)性對(duì)照本底溶液、供試品本底溶液、DPPH控制溶液、陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液和供試品反應(yīng)溶液各200μl，分別加入至96孔微孔板底部，蓋上蓋板，移入全波長(zhǎng)酶標(biāo)分析儀，測(cè)定其517nm處的吸光度。7.6說(shuō)明如供試品為稀溶液或所含抗氧化活性物質(zhì)濃度較低，可采取相應(yīng)的方法（包含但不局限于如下方法：濃縮蒸發(fā)、液液萃取、固相萃取、固相微萃取、沉淀法、交換等富集方法）將供試品進(jìn)行富集后再進(jìn)行試驗(yàn)。富集過(guò)程不應(yīng)造成供試品中抗氧化活性物質(zhì)種類(lèi)和總量的損失，不引入新的干擾物質(zhì)，并確保經(jīng)富集后的供試品/供試品溶液與DPPH溶液混合后能夠均勻分散。如供試品中含有干擾物質(zhì)，如干擾物質(zhì)在517nm處有強(qiáng)吸收或?qū)┰嚻?供試品溶液與DPPH溶液混合后的均勻分散不利，可采取相應(yīng)的方法（包含但不局限于如下方法：沉淀、6T/TPPAXXX-XXXX溶劑萃取、離子交換、層析、揮發(fā)、蒸餾、固相萃取、膜分離等分離方法）將供試品進(jìn)行分離后再進(jìn)行試驗(yàn)。分離過(guò)程不應(yīng)造成供試品中抗氧化活性物質(zhì)種類(lèi)和總量的損失，不引入新的干擾物質(zhì)，并確保經(jīng)分離后的供試品/供試品溶液與DPPH溶液混合后能夠均勻分散。L-抗壞血酸易溶于水，可溶于乙醇，因此以高純水作為溶劑進(jìn)行配制，且可確保其反應(yīng)溶液的均勻分散。DPPH在可溶于乙醇，不溶于水，因此反應(yīng)溶液的配制中應(yīng)盡量控制水的比例，以滿足供試品能夠均勻分散即可。如供試品為固體或半固體，也可稱(chēng)采用分別精密稱(chēng)定后置于容量瓶中，再分別加入一定體積的DPPH溶液（供試品反應(yīng)溶液）/色譜乙醇（供試品本底溶液），定容至刻度后進(jìn)行測(cè)供試品反應(yīng)溶液的吸光度建議控制在0.1~0.8之間，且相鄰濃度反應(yīng)溶液的吸光度差值較為均勻。應(yīng)確保DPPH控制溶液、陽(yáng)性對(duì)照本底溶液、陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液、供試品本底溶液和供試品反應(yīng)溶液的反應(yīng)時(shí)間（配制完成至移入全波長(zhǎng)酶標(biāo)分析儀進(jìn)行測(cè)定）的一致。8結(jié)果計(jì)算8.1計(jì)算吸光度變化量關(guān)于吸光度變化量的計(jì)算公式：?A陽(yáng)=（A控–A空） ?A供=（A控–A空） 式中：?A陽(yáng)—陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液吸光度變化量，即反應(yīng)溶液中的活性物質(zhì)捕獲DPPH自由基而使反應(yīng)溶液的吸光度較同濃度DPPH控制溶液吸光度下降的量A陽(yáng)本—陽(yáng)性對(duì)照本底溶液在517nm處吸光度A陽(yáng)—陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液在517nm處吸光度?A供—供試品反應(yīng)溶液吸光度變化量，即反應(yīng)溶液中的活性物質(zhì)捕獲DPPH自由基而使反應(yīng)溶液的吸光度較同濃度DPPH控制溶液吸光度下降的量A供本—供試品本底溶液在517nm處吸光度A供—供試品反應(yīng)溶液在517nm處吸光度A控—DPPH控制溶液在517nm處吸光度A空—空白溶液在517nm處吸光度8.2回歸分析和半抑制濃度（IC50）的計(jì)算7T/TPPAXXX-XXXX8.2.1陽(yáng)性對(duì)照將陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液濃度作為解釋變量（C陽(yáng)吸光度變化量(?A陽(yáng)）作為響應(yīng)變量，繪制散點(diǎn)圖（即以吸光度變化量作為陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液濃度的函數(shù)作圖，即C陽(yáng)—?A陽(yáng)圖根據(jù)散點(diǎn)圖的提示（觀察是否呈線性再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。必要時(shí)，吸光度變化量(?A陽(yáng)）可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算，或者可采用描述陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液濃 度—吸光度變化量（C陽(yáng)—?A陽(yáng)）關(guān)系的非線性模型。應(yīng)列出回歸方程或非線性模型、相關(guān)系數(shù)（R）和/或判定系數(shù)（R2）、殘差平方和、線性圖（或其他數(shù)學(xué)模型）。將吸光度變化量(?A陽(yáng)）取值設(shè)定為0.500，代入回歸方程，計(jì)算求得陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液濃度取值（或代入所建立的模型，預(yù)測(cè)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液濃度取值即半抑制濃度（IC50陽(yáng)計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。一元線性回顧的回歸方程如式3，其半抑制濃度（IC50陽(yáng)）的計(jì)算式如式4。?A陽(yáng)=a陽(yáng)C陽(yáng)+b陽(yáng)直線回歸 IC50陽(yáng)=適用于直線回歸 式中：?A陽(yáng)—陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液吸光度變化量，即反應(yīng)溶液中的活性物質(zhì)捕獲DPPH自由基而使反應(yīng)溶液的吸光度較同濃度DPPH控制溶液吸光度下降的量；響應(yīng)變量C陽(yáng)—陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液濃度（單位：μg/ml解釋變量；由于反應(yīng)溶液的制備采取了陽(yáng)性對(duì)照溶液與DPPH溶液混合的方法，因此反應(yīng)溶液濃度應(yīng)按陽(yáng)性對(duì)照溶液濃度分別乘以系數(shù)計(jì)a—回歸方程解釋變量系數(shù)b—回歸方程常量（截距）IC50陽(yáng)—陽(yáng)性對(duì)照的半抑制濃度（單位：μg/ml即當(dāng)?A陽(yáng)=0.500時(shí)對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液濃度8.2.2供試品將供試品反應(yīng)溶液濃度作為解釋變量（C供吸光度變化量(?A供）作為響應(yīng)變量，繪制散點(diǎn)圖（即以相應(yīng)信號(hào)作為供試品反應(yīng)溶液濃度的函數(shù)作圖，即C供—?A供圖根據(jù)散 點(diǎn)圖的提示（觀察是否呈線性再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。必要時(shí)，吸光度變化量(?A供）可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算，或者可采用描述供試品反應(yīng)溶液濃度—吸光度變化量（C供—?A供）關(guān)系的非線性模型。應(yīng)列出回歸方程或非線性模型、相關(guān)系數(shù)（R）和/或判定系數(shù)（R2）、殘差平方和、線性圖（或其他數(shù)學(xué)模型）。將吸光度變化量(?A供）取值設(shè)定為0.500，代入回歸方程，計(jì)算求得供試品反應(yīng)溶液濃度取值（或代入所建立的模型，預(yù)測(cè)供試品反應(yīng)溶液濃度即半抑制濃度（IC50供計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。一元線性回顧的回歸方程如式5，其半抑制濃度（IC50供）的計(jì)算8式如式6。?A供=a供C供+b供IC50供=直線回歸適用于直線回歸T/TPPAXXX-XXXX式中：?A供—供試品反應(yīng)溶液吸光度變化量，即反應(yīng)溶液中的活性物質(zhì)捕獲DPPH自由基而使反應(yīng)溶液的吸光度較同濃度DPPH控制溶液吸光度下降的量；響應(yīng)變量C供—供試品反應(yīng)溶液濃度（單位：μg/ml解釋變量；由于反應(yīng)溶液的制備采取了陽(yáng)性對(duì)照溶液與DPPH溶液混合的方法，因此反應(yīng)溶液濃度應(yīng)按供試品溶液濃度分別乘以系數(shù)計(jì)a—回歸方程解釋變量系數(shù)b—回歸方程常量（截距）IC50供—供試品的半抑制濃度（單位：μg/ml或μl/ml即當(dāng)?A供=0.500時(shí)對(duì)應(yīng)的供試品反應(yīng)溶液濃度8.2.3相對(duì)抗氧化活性（RAA）根據(jù)相對(duì)抗氧化活性（RAA）的定義可得式7，為了便于計(jì)算，減小誤差，統(tǒng)一取吸光度變化量為0.500時(shí)濃度進(jìn)行計(jì)算，得式8；計(jì)算結(jié)果以百分?jǐn)?shù)形式，保留三位有效數(shù)字。?A供/C供RAA供=×?A供/C供?A陽(yáng)/C陽(yáng)RAA供=×100%……式8式中：C陽(yáng)—吸光度變化量為?A陽(yáng)時(shí)對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液濃度（單位：μg/ml）C供—吸光度變化量為?A供時(shí)對(duì)應(yīng)的供試品反應(yīng)溶液濃度（單位：μg/ml）?A陽(yáng)—陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液吸光度變化量，即反應(yīng)溶液中的活性物質(zhì)捕獲DPPH自由基而使反應(yīng)溶液的吸光度較同濃度DPPH控制溶液吸光度下降的量?A供—供試品反應(yīng)溶液吸光度變化量，即反應(yīng)溶液中的活性物質(zhì)捕獲DPPH自由基而使反應(yīng)溶液的吸光度較同濃度DPPH控制溶液吸光度下降的量IC50陽(yáng)—陽(yáng)性對(duì)照的半抑制濃度（單位：μg/ml）IC50供—供試品的半抑制濃度（單位：μg/ml或μl/ml）9結(jié)果報(bào)告9.1空白溶液吸光度空白溶液吸光度測(cè)定的意義在于扣除實(shí)驗(yàn)的背景噪聲（如溶劑吸光度、96孔微孔板吸光度等干擾），該吸光度參與過(guò)程計(jì)算，應(yīng)納入結(jié)果報(bào)告。9T/TPPAXXX-XXXX9.2本底溶液吸光度本底溶液吸光度測(cè)定的意義在于扣除不同濃度供試品溶液的背景噪聲（不同濃度供試品溶液的吸光度等），該吸光度參與過(guò)程計(jì)算，應(yīng)納入結(jié)果報(bào)告。如陽(yáng)性對(duì)照（L-抗壞血酸）本底溶液和供試品本底溶液在517nm的吸光度與空白溶液的吸光度基本相同（|A空–A陽(yáng)本|≤0.005；|A空–A供本|≤0.005），在進(jìn)行多批次檢測(cè)中可不制備陽(yáng)性對(duì)照本底溶液和供試品本底溶液，以空白溶液吸光度（A空）替代陽(yáng)性對(duì)照本底溶液吸光度（A陽(yáng)本）和供試品本底溶液吸光度（A供本），吸光度變化量的計(jì)算可簡(jiǎn)化為：（A陽(yáng)–A陽(yáng)本）≈A控–A陽(yáng)……式7（A供–A供本）≈A控–A供……式89.3DPPH控制溶液吸光度因DPPH控制溶液吸光度參與吸光度變化量的計(jì)算，應(yīng)納入結(jié)果報(bào)告。9.4反應(yīng)溶液吸光度陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)溶液和供試品反應(yīng)溶液吸光度，應(yīng)納入結(jié)果報(bào)告。9.5反應(yīng)起始時(shí)間和反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)因中藥注射劑（或注射用提取物體）所含成分復(fù)雜、空間結(jié)構(gòu)多樣，使得不同中藥注射劑