引起犬細(xì)菌性皮膚病主要致病菌的生物學(xué)分析

PAGE中文題目:引起犬細(xì)菌性皮膚病主要致病菌的生物學(xué)分析英文題目:Biologicalanalysisofthemainpathogenscausingcaninebacterialskindiseases目錄TOC\o"1-3"\h\u216841引言……………… 3307231.1犬皮膚病現(xiàn)狀…………………… 381511.2犬細(xì)菌性皮膚病的研究進(jìn)展…………………… 3288091.2.1病原…………… 3280561.2.2致病機制……………………… 545871.2.3癥狀…………… 5224351.2.4治療…………… 678931.3DNA測序技術(shù)的研究進(jìn)展……… 6119961.3.1DNA測序在細(xì)菌性皮膚病鑒別診斷中的應(yīng)用……………… 74831.4研究目的及意義………………… 791312材料與方法……………………… 7166822.1實驗對象………… 796912.2實驗材料………… 8120742.3實驗方法………… 9246452.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析………………… 11195343結(jié)果與分析……………………… 1158413.1定性分析………… 1195693.2定量分析……………………… …1286034討論……………… 1478345結(jié)論……………… 1822087參考文獻(xiàn)……………… 1922580致謝…………………… 2330906附錄1：相關(guān)英文文獻(xiàn)原文………… 24181附錄2：英文文獻(xiàn)中文譯文………… 35摘要為了了解引起犬細(xì)菌性皮膚病的主要致病菌菌屬及其生物學(xué)性質(zhì)，從臨床病例情況，細(xì)菌分離培養(yǎng)，革蘭氏染色觀察，血平板培養(yǎng)，細(xì)菌DNA檢測等方面，對天津農(nóng)學(xué)院附屬動物醫(yī)院5只患細(xì)菌性皮膚病犬只及其患處所分離出的可疑致病菌進(jìn)行生物學(xué)分析。試驗結(jié)果顯示：5只研究對象均為長毛或毛發(fā)濃密犬種，60%處于2-4歲階段，80%犬細(xì)菌性皮膚病病例為單純感染細(xì)菌性皮膚病，20%為寄生蟲與細(xì)菌混合感染，且患犬均為繼發(fā)性感染。菌落形態(tài)均為淡黃色或白色、圓形、大小相似、光滑突起、邊緣齊整。革蘭氏染色鏡檢單獨菌落均是革蘭氏陽性菌，其中有97.29%革蘭氏陽性葡萄球菌，10.81%菌株檢出含有革蘭氏陽性桿菌，60%血平板上出現(xiàn)透明溶血環(huán)。結(jié)果說明犬細(xì)菌性皮膚病常發(fā)于2-4歲長毛犬，多為繼發(fā)感染，革蘭氏陽性葡萄球菌是引起犬細(xì)菌性皮膚病的最主要致病菌，多種細(xì)菌可同時感染致病。通過結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)理論分析，推測引起犬細(xì)菌性皮膚病主要致病菌可能為偽中間型葡萄球菌、中間型葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、產(chǎn)色葡萄球菌、短小芽孢桿菌，試驗為確定犬細(xì)菌性皮膚病的主要致病菌以及臨床及時有效對因治療犬細(xì)菌性皮膚病提供參考。關(guān)鍵詞:犬類；細(xì)菌性皮膚??；DNA技術(shù)ABSTRACTInordertounderstandthemainpathogenicbacteriathatcausebacterialskindiseasesindogsandtheirbiologicalproperties,thebiologicalanalysisofthesuspectedpathogensisolatedfrom5dogsandtheiraffectedareasintheaffiliatedAnimalHospitalofTianjinAgriculturalCollegewascarriedoutfromtheaspectsofclinicalcases,bacterialisolationandculture,Gramstainingobservation,bloodplateculture,bacterialDNAdetection,etc.Theexperimentalshowedthatthe5researchsubjectswerealllong-hairedorthick-haireddogbreeds,60%ofthemwereinthestageof2-4yearsold,80%ofcaninebacterialskindiseasecaseswerepurebacterialskindisease,20%weremixedinfectionofparasitesandbacteria,andallthedogsweresecondaryinfection.Thecolonyformsarepaleyelloworwhite,round,similarinsize,smoothandprotruding,withneatedges.TheisolatedcolonieswereallGram-positivebacteria,ofwhich97.29%wereGram-positivestaphylococci,10.81%wereGram-positivebacteria,60%ofbacterialcolonieshavehemolyticringsonbloodplates.Theresultsshowthatcaninebacterialskindiseasesoftenoccurin2-4yearoldlong-haireddogs,andmostofthemweresecondaryinfections.Gram-positiveStaphylococcuswasthemainpathogencausingbacterialskindiseasesindogs,andmanykindsofbacteriacouldinfectandcausediseasesatthesametime.Basedonthetheoreticalanalysisofrelatedliterature,itisspeculatedthatthemainpathogenicbacteriamaybeStaphylococcuspseudintermedius,S.aureus,Staphylococcusaureus,Staphylococcussciuri,Staphylococcuschromogenes,Bacillus.Theexperimentprovidesreferenceforthedeterminationofthemainpathogenicbacteriaofbacterialskindiseaseofdogsandthetimelyandeffectivetreatmentofbacterialskindiseaseofdogs.Keywords:canines;bacterialskindisease;DNA引起犬細(xì)菌性皮膚病主要致病菌的生物學(xué)分析陳可欣（天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院）1引言1.1犬皮膚病現(xiàn)狀隨著社會經(jīng)濟發(fā)展的進(jìn)步，寵物犬?dāng)?shù)量與日俱增[1]，狗作為伴侶動物中的一員，在當(dāng)今社會的家庭生活中開始更多作為人類精神寄托的存在，寵物犬疾病也逐漸受到人們的關(guān)注。在所有寵物疾病中，犬皮膚病是臨床首診中較常見的疾病之一。此種疾病治療后易復(fù)發(fā)、治療病程長、發(fā)病情況與犬自身諸多因素及周圍環(huán)境條件等有很大關(guān)系，在診斷和治療上有一定難度，且其病原可在人與動物間交叉感染，具有一定的危害性。相關(guān)文獻(xiàn)[2]中提出犬患皮膚病的病因主要有以下幾種：寄生蟲性皮膚病、真菌性皮膚病、細(xì)菌性皮膚病。研究數(shù)據(jù)中還顯示出犬皮膚病全年均有發(fā)病，且每年7至10月的病例數(shù)是3至6月病例數(shù)的3倍。1.2犬細(xì)菌性皮膚病的研究進(jìn)展有研究[1]顯示，在臨床中，幾乎所有種類的犬都可能患上細(xì)菌性皮膚病，發(fā)病數(shù)約占犬患皮膚病數(shù)的40%。犬細(xì)菌性皮膚病常發(fā)生為外寄生蟲、真菌、外傷等造成的繼發(fā)感染，繼發(fā)感染病例達(dá)75.77%[3]，病因具有復(fù)雜性。從病原方面可將犬細(xì)菌性皮膚病分成球菌感染和桿菌感染；從致病機制方面可分為繼發(fā)性感染和原發(fā)性感染；從臨床癥狀，可分膿皮病、蜂窩織炎和紅癬等。其中在犬細(xì)菌性皮膚病臨床病例癥狀中，以膿皮病最為常見，約占18%[4]。近些年來，在常見能引起全細(xì)菌性皮膚病的致病菌中，由于廣譜抗生素的濫用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methiclliin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA）和耐甲氧西林偽中間型葡萄球菌（Methiclliin-resistantStaphylococcuspseudintermedius，MRSP）等耐藥型細(xì)菌被許多研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，耐藥性細(xì)菌數(shù)量急劇增加，病原菌的耐藥性嚴(yán)重影響著臨床治療效果，進(jìn)一步加大了治療的難度。1.2.1病原能引起犬細(xì)菌性皮膚病的病原菌種類有很多，其中不僅包括常見的金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、綠膿桿菌（又名銅綠假單胞菌，Pseudomonasaeruginosa）、中間型葡萄球菌（S.aureus）等常在機會致病菌，近年來，許多研究者還從患細(xì)菌性皮膚病病例中分離出其他菌種，如2007年Bannoehr[8]鑒別出偽中間型葡萄球菌（Staphylococcuspseudintermedius），同年，Sasaki[9]等研究者發(fā)現(xiàn)MRSP菌株，其次還有2002年P(guān)appalardo等[10]從患有膿皮病犬患處分離的病原菌有奇異變形桿菌（Proteusmirabilis）、產(chǎn)色葡萄球菌（Staphylococcuschromogenes）、芽孢桿菌（Bacillus）、大腸桿菌（E.coli）及糞鏈球菌（Streptococcusfaecalis），以及Summers等[11]報道中所提到的施氏葡萄球菌（Staphylococcusschleiferi）、松鼠葡萄球菌（Staphylococcussciuri）、微細(xì)棒狀桿菌（Corynebacteriumminutissimum）、分枝桿菌（Mycobacterium）等致病菌。偽中間型葡萄球菌是犬黏膜上的常在菌，能夠暫時存在于犬黏膜上而不致病，當(dāng)該菌因犬只免疫力低下，或是皮膚受損、黏膜完整結(jié)構(gòu)被破壞等情況轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【鷷r，引起膿皮病、傷口感染發(fā)炎、外耳道炎以及尿道感染等癥狀[12]。在童勝濤的研究[4]中數(shù)據(jù)顯示，武漢地區(qū)引起犬患細(xì)菌性皮膚病的致病菌中偽中間型葡萄球菌約占比58.16%，此比例遠(yuǎn)高出其他致病性分離菌株的5倍之多。2014年，KarenHR，AlexanderHW所著書[13]及國外外文文獻(xiàn)[14]中也均表明偽中間型葡萄球菌為犬患細(xì)菌性皮膚病最主要的致病菌。其次，遼寧錦州及江西等多地區(qū)的犬細(xì)菌性皮膚病臨床病例的患處分離驗證偽中間型葡萄球菌是引起犬患細(xì)菌性皮膚病的病原菌[15-16]。在2007年Bannoehr[8]所發(fā)表的相關(guān)外文研究表明從中間型葡萄球菌中鑒別出偽中間型葡萄球菌，推斷之前研究中從犬細(xì)菌性皮膚病患處分離出的偽中間型葡萄球菌可能被誤診為中間型葡萄球菌。中間型葡萄球菌具有一定的侵襲性[17-18]，嚴(yán)重的甚至可造成菌血癥、皮膚膿腫、各器官炎癥等。在曾婉秋[19]等的研究中，犬源中間型葡萄球菌的分離率為9.71%，且39%的犬口腔中存在中間型葡萄球菌。當(dāng)寵物的免疫力下降或皮膚免疫系統(tǒng)有所損傷時，中間型葡萄球菌極易通過舔舐在患處引發(fā)感染，造成病癥。2001年馬麗平[20]及陸江等[21]的研究報道中提到中間型葡萄球菌為引起犬細(xì)菌性皮膚病主要的病原菌，薛占永[22]等的研究數(shù)據(jù)中，中間型葡萄球菌的檢出率為38.9%，占有相當(dāng)?shù)谋戎亍＝瘘S色葡萄球菌廣泛存在于自然界環(huán)境、各種動物的皮膚和呼吸道以及食物中，感染該菌可在犬皮膚上造成潰爛，發(fā)炎腫脹，脫毛等癥狀，嚴(yán)重者甚至可能造成死亡。金黃色葡萄球菌在許多文獻(xiàn)中被提及是犬細(xì)菌性皮膚病重要致病菌之一[23-24]，曾在過去被認(rèn)為是對研究犬細(xì)菌性皮膚病治療有臨床意義的重要菌屬。在武漢地區(qū)犬細(xì)菌性皮膚病的研究[4]中松鼠葡萄球菌檢出率達(dá)10.2%，僅次于偽中間型葡萄球菌檢出率，在薛占永等[22]的研究中，該菌的檢出率占有2.8%的比重，說明在寵物臨床中犬細(xì)菌性皮膚病患犬的患處有一定可能會檢測出松鼠葡萄球菌的存在，此菌也是犬細(xì)菌性皮膚病致病菌之一。產(chǎn)色葡萄球菌是人類少見的病原菌，是存在于動物機體身上的低毒力條件致病菌[25]。其可用一種產(chǎn)色葡萄球菌選擇性培養(yǎng)基[26]進(jìn)行鑒別，因其產(chǎn)生色素，故取名產(chǎn)色葡萄球菌。在北京地區(qū)，薛占永等[22]的研究報告數(shù)據(jù)中產(chǎn)色葡萄球菌檢出率高達(dá)55.6%，且菌種構(gòu)成比占31.7%。在童勝濤[4]相關(guān)研究得出的數(shù)據(jù)顯示，短小芽孢桿菌在引起犬細(xì)菌性皮膚病病原菌中占比7.14%，是桿菌屬中最高的菌種。1.2.2致病機制臨床中，細(xì)菌性皮膚病可分為繼發(fā)感染和原發(fā)感染。正常完整的皮膚是機體中最大的免疫系統(tǒng)，作為防御外界病原侵害機體的第一道防線，具有一定防御功能。在表皮免疫系統(tǒng)存在缺陷或者犬免疫力的降低時，易誘導(dǎo)原發(fā)病的繼發(fā)感染。當(dāng)犬的表皮系統(tǒng)被破壞后，原存在于犬黏膜的常在菌通過犬的舔舐等方式轉(zhuǎn)移到患處，患處滲出物及表皮脫落物為這些細(xì)菌提供了適宜的生長環(huán)境，使細(xì)菌快速大量繁殖，引發(fā)細(xì)菌性皮膚病。外寄生蟲感染的病犬與過敏患犬極易繼發(fā)細(xì)菌性感染皮膚病，患犬會因極度瘙癢對患部舔舐、撓、蹭，使其表皮系統(tǒng)被破壞，給細(xì)菌創(chuàng)造了感染的機會，引起皮膚病。犬皮膚不潔、毛囊口被污物堵塞、引起皮脂腺機能障礙等因素也都可導(dǎo)致細(xì)菌在患處滋生，造成原發(fā)性細(xì)菌性皮膚病[27]。1.2.3癥狀細(xì)菌性皮膚病的致病菌以化膿桿菌為主，發(fā)病部位常常出現(xiàn)膿包、癤子、丘疹等[28]。犬細(xì)菌性皮膚病根據(jù)不同類型的感染，其主要的表現(xiàn)形式有膿皮病、蜂窩織炎和紅癬等。膿皮病常集中于皮褶多、生活環(huán)境差的犬的腋下、四肢皺褶、腹股溝、皮膚黏膜結(jié)合處等。根據(jù)患處的嚴(yán)重程度可將膿皮病分為表層膿皮病、淺層膿皮病、深層膿皮病[29]。表層膿皮病表現(xiàn)癥狀稍輕，膿皰、丘疹、鱗屑、結(jié)痂、表皮脫屑等；淺層膿皮病表現(xiàn)與表層膿皮病癥狀相似，在其病變區(qū)域可能會出現(xiàn)色素沉著和脫毛的現(xiàn)象；深層膿皮病則主要表現(xiàn)為結(jié)痂、潰爛、膿皰、丘疹，癥狀較前兩者嚴(yán)重，病變區(qū)域會有脫失色素、掉毛等情況，有時還會形成竇道，有血清血漿樣膿性物質(zhì)滲出。蜂窩織炎，剛開始在發(fā)病部位出現(xiàn)彌漫型漸進(jìn)性腫脹[30]，觸診可明顯地感覺皮膚發(fā)燙，按壓患部，病犬有疼痛反應(yīng)，甚至可能會出現(xiàn)機能障礙，隨后腫脹的堅實感慢慢消失，可感覺到病灶有局部波動感，穿刺患處可見有膿汁流出。嚴(yán)重者，治療不及時，極易引起全身感染，發(fā)展成敗血癥而死亡。紅癬是由微細(xì)棒狀桿菌感染所引起的一類細(xì)菌性皮膚病癥狀[31]。其表現(xiàn)為患犬皮膚上出現(xiàn)界限清楚的紅色或褐色斑塊，起初表面光滑濕潤，隨后逐漸開始出現(xiàn)皺褶、鱗屑，輕觸患部，犬會有瘙癢感，常發(fā)生于腋下、趾間、腹股溝等部位。1.2.4治療薛占永等[22]研究藥物敏感性試驗結(jié)果表明，引起細(xì)菌性皮膚病的致病菌對青霉素耐藥，但對其他β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定青霉素、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合藥物、相關(guān)頭孢類以及碳青霉烯類抗生素等敏感。在治療犬細(xì)菌性皮膚病時，使用抗生素是必不可少的。解決如何合理選用適宜的抗生素，盡量準(zhǔn)確對因治療，避免抗生素濫用使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，是當(dāng)務(wù)之急。治療時，結(jié)合患犬的身體情況以及病情等來用藥，確定適當(dāng)劑量并給予足夠療程。犬細(xì)菌性皮膚病，在犬體表無明顯潰爛，傷口等的情況下，除抗生素治療外，還可以用抗細(xì)菌感染香波進(jìn)行藥浴治療[32]。在最新研究[33]中還發(fā)現(xiàn)使用具有抗生物膜活性的植物提取物對患細(xì)菌性皮膚病犬的患處進(jìn)行局部治療也有相當(dāng)?shù)寞熜?。若確診為其他疾病的繼發(fā)感染時，應(yīng)盡快治療原病因，從根本上解決問題。1.3DNA測序技術(shù)的研究進(jìn)展1953年Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)后，1977年Sanger測序法出現(xiàn)，到人類基因組計劃（HumanGenomeProject，HGP）完成，生物學(xué)研究也逐漸深入到了分子水平。研究[34]顯示，DNA測序法的進(jìn)步在人類生物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域起到至關(guān)重要的作用。與此同時，DNA測序技術(shù)變得更加的低成本、高通量以及多功能。DNA測序技術(shù)的未來發(fā)展必定對疾病臨床治療等方面產(chǎn)生深刻的影響，不僅是單純的測序們還將與基礎(chǔ)生物學(xué)產(chǎn)生更加緊密的聯(lián)系。在周曉光等的研究[35]中發(fā)現(xiàn)在過去的數(shù)十年的歷史發(fā)展中，每經(jīng)幾年,DNA測序速度就呈指數(shù)增長。這種高速發(fā)展,很大程度地改變了人們研究生命科學(xué)的方式，極大程度地推動了基因組學(xué)及其分支乃至其他諸如比較基因組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)以及合成生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的創(chuàng)立與發(fā)展。在某種程度上，測序技術(shù)的進(jìn)展已然可以從測量局部、單一的基因的片段或基因轉(zhuǎn)變至可以檢測整個基因組?？焖?、低廉的測序能力將會引領(lǐng)我們進(jìn)一步促進(jìn)比較基因組學(xué)分析、疾病診斷等發(fā)展，在未來，DNA技術(shù)極有可能可以幫助人類進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)并掌握全部生物的基因組及對其有意義的變異進(jìn)行分析解釋。預(yù)測可發(fā)生突變的異?；颍莆丈锘蛲蛔冃再|(zhì)及其所表達(dá)出的信息，防患于未然。1.3.1DNA測序在細(xì)菌性皮膚病鑒別診斷中的應(yīng)用通過DNA測序技術(shù)測出致病菌DNA序列進(jìn)行細(xì)菌同源性比對結(jié)果，可確定引起犬細(xì)菌性皮膚病的細(xì)菌種類。同時，DNA測序在測出細(xì)菌DNA序列后，通過耐藥基因檢驗，在幫助人們了解其耐藥性方面也起著不可忽視的重要作用。細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性與耐藥菌株基因中出現(xiàn)的mecA等耐藥基因有很大的關(guān)系。自2005年Devriese[36]發(fā)現(xiàn)了MRSP，近15年來MRSP的流行越來越嚴(yán)重，2008年CLSI正式將MRSP定義為含有mecA基因的偽中間型葡萄球菌，其基因可編碼表達(dá)PBP2a蛋白，促進(jìn)細(xì)胞壁的合成，使得細(xì)菌更易存活和繁殖。此外，mecA基因使得細(xì)菌對所有β-內(nèi)酰胺抗生素以及它們的衍生物（包括所有的青霉素類與頭孢類）都具有了耐藥性，并且還出現(xiàn)有聯(lián)合抵抗現(xiàn)象[37]。1.4研究目的及意義通過DNA技術(shù)檢測出病因細(xì)菌序列，對在臨床患病病例患處采集的病料中分離出的主要致病細(xì)菌進(jìn)行細(xì)菌同源性鑒別分析，準(zhǔn)確鑒別致病細(xì)菌種屬，為寵物醫(yī)生對患病犬進(jìn)行有針對性的診斷提供準(zhǔn)確的依據(jù)，輔助臨床綜合診治，使患病寵物能夠早預(yù)防早治療早康復(fù)。研究引起犬皮膚病的細(xì)菌主要類型并了解其生物學(xué)性質(zhì)，為研究預(yù)防和治療犬細(xì)菌性皮膚病方面打好基礎(chǔ)。2材料與方法2.1實驗對象2019年12月26日-2020年1月10日期間來天津農(nóng)學(xué)院附屬動物醫(yī)院檢查的5只患細(xì)菌性皮膚病患犬及從其患處采集的膿汁、痂皮等病料。病例1：7歲，薩摩耶，公犬，15kg。左側(cè)大腿皮膚破潰處有膿汁，患處周圍有紅斑。病例2：4歲，博美，母犬，3kg。腹部皮膚發(fā)紅，脫毛、膿泡破潰有膿汁。病例3：5歲，德牧，公犬，22kg。情緒激動，有瘙癢抓撓以及其舔咬患處行為。臀部外側(cè)皮膚發(fā)紅、皮膚破損，患處有膿汁和痂皮。病例4：2歲，泰迪，公犬，體重為3kg。情緒萎靡，腰部皮膚患處脫毛，有少許痂皮，破潰。病例5：1歲半，串串（貴賓混種），母犬，5kg。背部患處發(fā)現(xiàn)寄生蟲，有刮蹭痕跡，皮膚瘙癢，不停抓撓?；继幹車撁茲?，有些許小膿皰，黃色痂皮。2.2實驗材料2.2.1設(shè)備YX280B型高壓蒸汽滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械有限公司）、DZF-6030型烘干箱（蘇州納美瑞電子科技有限公司）、SPX-600PE型恒溫培養(yǎng)箱（力辰科技有限公司）、TS-211A臥式恒溫?fù)u床（常州亞特實驗器材有限公司）、LIOOS600T型三目生物顯微鏡、FYL-YS-230L型冰箱（北京福意電器有限公司）、SW-CJ-1FD型無菌操菌工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、ZSBB-712恒溫水槽（上海智誠公司）、臺式高速冷凍離心機TGL-16（湖南湘儀離心機儀器有限公司）、XH-T旋渦混合器（常州市萬豐儀器制造有限公司）、10-1000μl移液器、PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司），DYY-6C穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（泰州星火生化儀器制造有限公司），BIO-RADChemiDocXRS凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）、ThermoFisher超微量分光光度計（ThermoFisherScientificInc）等。2.2.2試劑革蘭氏染液（購自南京建成科技有限公司）、溶菌酶（Lysozyme,10mg/ml）、DNA提取試劑盒（KG203）、普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基（購自北京博奧生物有限公司）、普通液體培養(yǎng)基（北京博奧生物有限公司）、血平板（購自廣州市鴻洲實驗器材科技有限公司）、生理鹽水（鹿泉）、無菌水、蒸餾水、500ml無水乙醇（天津市廣成化學(xué)試劑有限公司）。2.2.3耗材一次性無菌采樣棉拭子、酒精燈、接種環(huán)、90mm玻璃培養(yǎng)皿、載玻片、試管、100ml量筒、500ml燒杯、250ml錐形瓶、1.5mlEP管、一次性無菌手套、、移液管、1.5ml離心管、標(biāo)簽紙、記號筆、封口膠、脫脂棉。2.2.4培養(yǎng)基配制及引物設(shè)計普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基：取15g固體粉末加入500ml蒸餾水。加熱煮沸，攪拌至充分溶解，高壓滅菌處理。普通液體培養(yǎng)基：取5.5g成品粉末加入500ml蒸餾水。加熱煮沸，攪拌至充分溶解，高壓滅菌處理。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[38]及VanderhaeghenW等[39]相關(guān)研究設(shè)計出16SrRNA引物片段及mecA基因引物片段，由相關(guān)生物公司合成。根據(jù)相關(guān)研究報告[38]及BannoehrJ等[8]與童勝濤[4]的研究中的PCR擴增方法對16SrRNA基因引物及mecA基因引物進(jìn)行PCR擴增。具體引物序列見表1。表116srRNA引物序列及擴增片段大小引物名稱引物設(shè)計引物序列（5’-3’）片段大小16srRNA27FGAGTTTGATCCTGGCTCAG1503bp1492RCGGTTACCTTGTTACGACTTmecAmecA-FAAAATCGATGGTAAAGGTTGGC532bpmecA-RAGTTCTGCAGTACCGGATTTGC2.3實驗方法2.2.1采樣根據(jù)趙熠群[29]研究文獻(xiàn)中對患細(xì)菌性皮膚病犬患處病料所進(jìn)行的采樣方法對本次試驗中的研究對象進(jìn)行病樣采集。所有樣品病料采集均使用一次性無菌棉拭子，盡量減少污染物的影響。采集后的棉拭子儲存于無菌管中，無菌管上做對應(yīng)標(biāo)記。2.2.2細(xì)菌培養(yǎng)及分離細(xì)菌培養(yǎng)（1）膿汁處理方法：取出裝有膿汁的無菌管，在無菌操作臺里將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒至紅，待其冷卻后，從管內(nèi)蘸取一環(huán)膿汁，劃線涂于平板上，四分法劃線，每次分區(qū)劃線前對接種環(huán)進(jìn)行灼燒滅菌，從上一分區(qū)尾端接著劃線，便于培養(yǎng)出單獨菌落。（2）無菌棉拭子處理方法：取出裝有棉拭子的無菌管，在無菌操作臺里將棉拭子取出直接涂于平板上，接種環(huán)接著劃線，只需開始時滅菌一次即可。（3）痂皮及皮屑處理：用滅菌后接種環(huán)從無菌管中少量多次取病料點樣劃線于平板上，每次取樣均需對接種環(huán)再次滅菌。將處理好的平板倒置放于37℃恒溫箱中，5組樣本10個平板，平板上做好樣本組及組號標(biāo)記，培養(yǎng)12～24h，至長出明顯菌落。細(xì)菌分離將可疑單獨菌落挑出，接種于液體培養(yǎng)基中，搖床增菌培養(yǎng)待用，每日對其進(jìn)行傳代。2.2.3染色鏡檢、鑒別挑取單獨菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，放于顯微鏡下，觀察細(xì)菌形態(tài)及特征，并統(tǒng)計細(xì)菌檢出率。鏡檢后，挑取相應(yīng)單獨菌落劃線接種于血平板中進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，觀察細(xì)菌在血平板中的溶血情況。2.2.4細(xì)菌DNA鑒定細(xì)菌DNA的提?。?）用適宜移液器吸取200μl樣本菌液至2ml離心管后，加入1.4ml緩沖液GSL（試劑盒配套溶液），間歇振蕩1分鐘至樣品混勻。（2）70℃水浴5min。由于革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁厚，需對其進(jìn)行破壁處理，可離心靜置，小心清除上清液后冷凍放置10min取出，在樣品中加入適量溶菌酶溶液，在水浴鍋中將溫度提高至90℃以促進(jìn)其細(xì)胞壁裂解。（3）將水浴后的樣本于渦旋機上渦旋15s，后置于離心機中12000rmp（～13400×g）離心1分鐘。取上清液102ml至新的2ml離心管中。將一粒抑制劑吸附片InhibitEX置入樣本中，振蕩至吸附片打開重懸，室溫水浴1min，使吸附片完全作用。（4）離心機12000rmp（～13400×g）離心3min。取上清液至1.5ml離心管，12000rmp（～13400×g）離心3min。再取上清液200μl至新1.5ml離心管中，加入15μlProteinaseK。加入200μl緩沖液GB，渦旋機渦旋15s。（5）70℃水浴加熱10min。（6）加入200μl無水乙醇，適當(dāng)渦旋。溶液加入至一個吸附柱CR2中（套有收集管），12000rmp（～13400×g）離心30秒，倒掉廢液，再將吸附柱CP2放入收集管中。（7）往吸附柱中加入已加入無水乙醇的500μl緩沖液GD，12000rmp（～13400×g）離心30s，倒掉廢液。再向吸附柱CR2中加入600μl事先加入過無水乙醇的漂洗液PW離心30s，倒掉廢液，重復(fù)一次。（8）吸附柱CR2放回收集管中，再次離心2min，倒掉廢液，于室溫中放置數(shù)分鐘至徹底晾干吸附材料中殘余漂洗液，防止漂洗液中乙醇的殘留對后續(xù)DNA實驗造成影響。（9）將吸附柱CR2轉(zhuǎn)放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間部分懸空滴加50μl洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5分鐘，12000rmp（～13400×g）離心2分鐘，將溶液收集至離心管中。將回收DNA產(chǎn)物分裝保存于冰箱中冷凍，防止裂解待用，做好標(biāo)記。DNA濃度及純度檢測回收DNA產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測其濃度，若有目的條帶（1503bp）出現(xiàn)明顯，可不進(jìn)行PCR擴增。若不明顯需以所提取的DNA作為模板，用細(xì)菌16SrRNA引物在PCR儀進(jìn)行擴增反應(yīng)。細(xì)菌基因測序及序列比對分析將最終獲得的DNA片段及引物送至測序公司測定序列，所得結(jié)果在NCBI（/）網(wǎng)站上進(jìn)行比對，確定細(xì)菌種屬，了解所提取的可疑致病菌的DNA中是否含有耐藥基因。2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析通過目測觀察法及顯微鏡鏡下觀察法統(tǒng)計不同樣本中不同的可疑菌株檢出率，檢出率計算公式如下：檢出率(%)=(某種菌檢出樣本數(shù)/受檢標(biāo)本總數(shù))×100%3結(jié)果與分析3.1定性分析3.1.1細(xì)菌形態(tài)及性質(zhì)鑒定根據(jù)細(xì)菌在普通肉湯培養(yǎng)基平板上及血平板上的生長情況及經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡下所觀察到的細(xì)菌形態(tài)及特征對細(xì)菌進(jìn)行鑒定。5組樣本普通肉湯培養(yǎng)基上均長出淡黃色或白色、圓形、大小相似、光滑突起、邊緣齊整的菌落（見圖1、2）且5組樣本組中的大部分單獨菌落均出現(xiàn)有葡萄串狀、藍(lán)紫色的革蘭氏陽性葡萄球菌（見圖3），僅樣本2中含有一株單獨菌落中為短桿狀或鏈狀的革蘭氏陽性桿菌（見圖4）以及一株革蘭氏陽性葡萄球菌與少量桿菌混合的單獨菌落（見圖5）。血平板中2、3、5號樣本組中所挑取的單獨菌落出現(xiàn)透明溶血環(huán)（見圖6），樣本組1號、4號未見有明顯溶血環(huán)（見圖7），菌落形態(tài)與普通培養(yǎng)基上相似。圖3樣本3.1革蘭氏染色鏡檢情況圖2樣本5.2普通培養(yǎng)基上的生長情況圖3樣本3.1革蘭氏染色鏡檢情況圖2樣本5.2普通培養(yǎng)基上的生長情況圖1樣本1.1普通培養(yǎng)基上的生長情況312312圖4樣本2.2中出現(xiàn)革蘭氏陽性桿菌染色鏡檢情況圖7樣本組1血平板上的生長情況65圖5樣本2.2中出現(xiàn)球菌圖4樣本2.2中出現(xiàn)革蘭氏陽性桿菌染色鏡檢情況圖7樣本組1血平板上的生長情況65圖5樣本2.2中出現(xiàn)球菌及少量短桿菌染色鏡檢情況圖6樣本組3血平板上的生長情況4773.1.2DNA鑒定結(jié)果DNA片段分裝保存，結(jié)果還需進(jìn)一步實驗鑒定。3.2定量分析3.2.1犬細(xì)菌性皮膚病病因比例情況于天津農(nóng)學(xué)院附屬動物醫(yī)院檢查的5只患皮膚病患犬初診斷結(jié)果，樣本4為寄生蟲與細(xì)菌混合感染引起的細(xì)菌性皮膚病，所有樣本均為繼發(fā)性感染引起的細(xì)菌性皮膚?。ㄒ姳?）。表2犬細(xì)菌性皮膚病病因比例情況病因混合感染單純感染總計繼發(fā)性感染原發(fā)性感染總計病例數(shù)/例145505比例/%20801001000100由表中可以看出，20%為寄生蟲與細(xì)菌混合感染性皮膚病，80%為單純感染細(xì)菌性皮膚病，臨床中單純感染細(xì)菌性皮膚病發(fā)生比例較高，但也有混合感染造成皮膚病的比例存在。且5只研究對象均為繼發(fā)性感染，由此可見，繼發(fā)性感染所造成的細(xì)菌性皮膚病在臨床病例中占據(jù)著相當(dāng)高的比例。3.2.2單獨菌落菌種分布情況對5個樣本組的10個平板中單獨菌落進(jìn)行革蘭氏染色后，置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。檢查結(jié)果見表3。表3單獨菌落菌種分布情況菌種/株樣本編號革蘭氏陽性葡萄球菌革蘭氏陽性桿菌球菌+桿菌總計未檢出1.1400411.2300322.1211502.2202413.1400413.2500504.1300324.2300325.1200235.240041總計33133713由表3可知，有97.29%（36/37）的檢出樣本中含有革蘭氏陽性葡萄球菌，可確定革蘭氏陽性葡萄球菌為引起犬細(xì)菌性皮膚病的主要致病菌，而10.81%（4/37）的菌株中染色鏡檢結(jié)果中出現(xiàn)革蘭氏陽性桿菌，且其中8.11%（3/37）為革蘭氏陽性球菌與革蘭氏陰性球菌的混合菌落，2.70%（1/37）只含有革蘭氏陽性桿菌，推測革蘭氏陽性桿菌為犬細(xì)菌性皮膚病的致病菌之一，但不是最主要致病菌。相較于革蘭氏陽性桿菌的檢出率來說，革蘭氏陽性葡萄球菌的檢出率遠(yuǎn)高出10倍之多，可確定革蘭氏陽性葡萄球菌屬為本次研究試驗患細(xì)菌性皮膚病犬的最主要致病菌，具體為何種葡萄球菌還未確定，需進(jìn)一步試驗。4討論4.1犬細(xì)菌性皮膚病臨床情況本試驗在臨床中所研究的5只患犬中60%集中在2-4歲，7歲老年犬一只，寄生蟲與細(xì)菌混合型皮膚病一只為1歲半幼犬，統(tǒng)計結(jié)果與沈麗[40]就上海地區(qū)犬患細(xì)菌性皮膚病病例調(diào)查報告中所提到的犬細(xì)菌性皮膚病在2-6歲犬中發(fā)病率最高，其次為6歲以上的結(jié)論相符，且病例5年齡符合文獻(xiàn)中對于混合型感染病例在犬的各年齡階段均可發(fā)生的描述。2-4歲犬年輕有活力，在戶外喜歡四處亂跑，對新鮮事物充滿好奇，極易刮蹭破皮，給細(xì)菌提供感染入口。老年犬由于免疫力降低容易使細(xì)菌轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【鴮?dǎo)致細(xì)菌感染，引起細(xì)菌性皮膚病。試驗時間處于冬季，僅在天津農(nóng)學(xué)院附屬動物醫(yī)院采集到的5例患細(xì)菌性皮膚病犬病例，與劉潔等相關(guān)研究[41-44]中皮膚病常發(fā)于夏秋季節(jié)，冬季病例較少的結(jié)論相符合。能引起犬細(xì)菌性皮膚病的主要致病菌喜好潮濕溫暖的環(huán)境，冬季氣溫低氣候干燥，細(xì)菌活性相對于夏秋兩季來說較低，繁殖速度較慢，因此患病犬只較少。5只病例中母犬占40%，公犬占60%，比重相差不大，公犬比重略高于母犬，符合孫彥婷[45]等對于鄭州金水區(qū)多個病例研究得出雄性犬較雌性犬易感的結(jié)論。同時也說明犬細(xì)菌性皮膚病在所有性別的犬中均可發(fā)生。公犬較母犬好動，脾氣較躁，皮膚感染細(xì)菌的可能性相對較高一些。試驗中的研究對象均為長毛、毛發(fā)較為濃密的犬種，與陳興娟[46]就福建漳州78例犬分析結(jié)果相符。毛發(fā)濃密給細(xì)菌提供了良好的附著環(huán)境，若不及時清理毛發(fā)，毛孔易堵塞，細(xì)菌更易滋生。試驗中中小型犬較大型犬易感，可能與天津地區(qū)近年來飼養(yǎng)小型犬?dāng)?shù)量較大型犬稍多有關(guān)，因此只能間接地說明了犬細(xì)菌性皮膚病在所有體型的犬種中均有可能發(fā)生，主人應(yīng)注意護理寵物犬皮膚衛(wèi)生，及時清理毛發(fā)，定時給犬只洗澡，保持寵物犬的皮膚表面干燥清潔。本試驗得出80%的犬為單純細(xì)菌感染，此結(jié)果與童勝濤[4]中的24.24%存在出入，原因可能為：（1）環(huán)境及患犬個體差異；（2）樣本數(shù)量小，存在偶然性，推測后者可能性更大。有100%犬患細(xì)菌性皮膚病是繼發(fā)感染，此結(jié)果大于沈麗[40]研究中數(shù)據(jù)，但結(jié)合李純林等[4，40，47]的文獻(xiàn)結(jié)論均可以說明犬細(xì)菌性皮膚病主要為繼發(fā)感染。且存在與寄生蟲、真菌等其他致病因素混和型感染病例，臨床寵物醫(yī)生在治療時應(yīng)結(jié)合病因綜合治療。4.2犬細(xì)菌性皮膚病致病菌預(yù)測本試驗中聯(lián)系目前試驗所得結(jié)果，通過細(xì)菌培養(yǎng)及血平板溶血環(huán)形態(tài)與細(xì)菌DNA測序技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)理論分析相結(jié)合，推測引起犬細(xì)菌性皮膚病主要致病菌的種屬可能為偽中間型葡萄球菌、中間型葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、產(chǎn)色葡萄球菌、短小芽孢桿菌，其中偽中間型葡萄球菌為最主要致病菌的可能性最大，預(yù)測結(jié)果還需要進(jìn)一步驗證。且犬細(xì)菌性皮膚病可由多種菌種共同感染引起，在使用抗生素治療時，需注意聯(lián)合抗菌治療同時合理使用適宜抗生素，防止抗生素濫用。4.2.1根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)及血平板溶血環(huán)本試驗5組樣本組在普通肉湯培養(yǎng)基上均長出淡黃色或白色、圓形、大小相似、光滑突起、邊緣齊整的菌落。革蘭氏染色顯微鏡觀察結(jié)果顯示97.29%菌為葡萄串狀、藍(lán)紫色的革蘭氏陽性葡萄球菌以及少量短桿狀或鏈狀的革蘭氏陽性桿菌，此結(jié)果與曲強、管慶松等文獻(xiàn)中[48-49]提及革蘭氏陽性葡萄球菌是導(dǎo)致犬患細(xì)菌性皮膚病的主要致病菌結(jié)論一致。60%血平板上出現(xiàn)透明溶血環(huán)，40%血平板未出現(xiàn)明顯溶血環(huán)。偽中間型葡萄球菌偽中間型葡萄球菌是革蘭氏陽性葡萄球菌，血漿凝固酶陽性，有β溶血[16]，在普通肉湯培養(yǎng)基平板上呈現(xiàn)中等大小、白色或淡黃色、圓形、邊緣整齊、光滑突起的菌落，在血平板中可見β溶血環(huán)。本試驗中細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長情況與偽中間型葡萄球菌的描述描述一致，且偽中間型葡萄球菌所引起的犬細(xì)菌性皮膚病病癥與試驗中研究對象患處有膿皮、膿汁、膿皰，脫毛有痂皮皮屑等癥狀相符，故預(yù)測本試驗中所分離出的溶血性革蘭氏陽性葡萄球菌致病菌為偽中間型葡萄球菌有相對較高的可能性。中間型葡萄球菌中間型葡萄球菌是常存在于犬皮膚與黏膜的機會致病菌之一，與偽中間型葡萄球菌在普通培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)較為相似，中等大小的白色圓形光滑突起，可通過基因檢測細(xì)菌序列鑒別區(qū)分兩種菌種。血平板中呈β溶血或不溶血的生長情況，凝固酶陽性，甘露醇陰性[15]。試驗中菌落形態(tài)與中間型葡萄球菌符合度較高，因此推測本試驗中所分離出的不溶血革蘭氏陽性致病菌有一定的可能為中間型葡萄球菌。金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌同屬于革蘭氏陽性葡萄球菌，在培養(yǎng)基上菌落表現(xiàn)為單個或多個圓形，表面光滑，突起，顏色為無色或者金黃色菌落[50]，致病性金黃色葡萄球菌在血平板中有明顯透明溶血環(huán)[51]。但在近年來的某些地區(qū)性的研究[4，22]中，在患病犬患處金黃色葡萄球菌的檢出率較低，分別為8.3%和2.04%。結(jié)合試驗中菌落的生長情況與金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)描述有一定相似度，合理推測本試驗中所檢出的溶血性革蘭氏陽性葡萄球菌有可能為金黃色葡萄球菌，但可能性較偽中間型葡萄球菌低。松鼠葡萄球菌松鼠葡萄球菌接種于普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)為白色或者淡黃色、中小突起、表面光滑濕潤，在血平板上可見灰白色、中等圓形菌落、表面光滑突出，在菌落周圍沒有溶血環(huán)，為革蘭氏陽性葡萄球菌[52]，與試驗中的菌落形態(tài)有相似之處，則推測本試驗分離出的葡萄球菌有一定概率可能為松鼠葡萄球菌。產(chǎn)色葡萄球菌產(chǎn)色葡萄球菌在血平板上形成直徑約0.5-3mm，白色圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤、有隆起且不溶血菌落，革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽性葡萄串狀球菌，凝固酶為陰性[53]，結(jié)合產(chǎn)色葡萄球菌染色鏡檢特征描述與薛占永[22]等相關(guān)研究中所檢測出的高占比以及其致病癥狀，不可排除在本試驗中所分離出的不溶血革蘭氏陽性葡萄球菌為產(chǎn)色葡萄球菌的可能性。短小芽孢桿菌短小芽孢桿菌屬于化膿桿菌，會引起寵物皮膚化膿感染，有膿瘡，脫毛瘙癢，嚴(yán)重可有潰瘍有膿汁，符合樣本2臨床檢查癥狀。且短小芽孢桿菌革蘭氏染色為短桿狀的革蘭氏陽性桿菌[4，54]，形態(tài)與試驗中鏡檢出的桿菌相似，同時在血平板上呈現(xiàn)有β溶血環(huán)。故合理推測本試驗中所檢測到的革蘭氏陽性桿菌有一定概率為短小芽孢桿菌，但檢出數(shù)量較少，可能存在偶然性。4.2.2細(xì)菌基因檢測通過提取細(xì)菌DNA，經(jīng)過DNA測序技術(shù)可將所有可疑同屬菌株細(xì)分到種。經(jīng)過基因庫同源性比對可以較為直觀且快速地找到致病菌的種類。將提取DNA產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，可通過圖像顯示的DNA片段大小，初步判斷所提取DNA的各菌株之間的同源關(guān)系。當(dāng)樣本量足夠大的時候，通過DNA測序法，還可較準(zhǔn)確統(tǒng)計出各病原菌的占比，從而得出引起犬細(xì)菌性皮膚病最主要致病菌。當(dāng)通過DNA測序鑒別細(xì)菌種屬用于臨床病例時，常常作為確診所患何種細(xì)菌性皮膚病最有力的依據(jù)，是鑒別區(qū)分不同致病菌所引起的犬細(xì)菌性皮膚病最可靠的方法。根據(jù)犬細(xì)菌性皮膚病致病菌基因方面相關(guān)文獻(xiàn)[17-54]可知，偽中間型葡萄球菌、中間型葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌基因約為1500bp左右，產(chǎn)色葡萄球菌為1400bp，若所提取的DNA產(chǎn)物電泳條帶在對照條帶中的的1500bp左右條帶范圍內(nèi)出現(xiàn)可初步驗證預(yù)測方向正確，隨后送檢可檢測本試驗中所提取致病菌的具體DNA序列，通過基因庫中不同基因組比對，可準(zhǔn)確驗證預(yù)測結(jié)果。在我國國內(nèi)多地區(qū)的病例研究[4，12，16，44]中發(fā)現(xiàn)引起犬細(xì)菌性皮膚病的主要致病菌與基因庫中的偽中間型葡萄球菌同源性均在99%以上，因此，可以推測本試驗中所分離出的致病菌菌株極有可能為偽中間型葡萄球菌。4.3犬細(xì)菌性皮膚病致病菌耐藥基因檢測mecA基因普遍存在于細(xì)菌性皮膚病病原菌的耐藥菌株的基因中，雖也有例外情況，但此基因可作為細(xì)菌具有耐藥性的重要參考依據(jù)之一。2008年德國Schwarz等[55]研究得出了所采集的偽中間型葡萄球菌耐藥基因譜型有mecA、aacA/aphD、tetK。楊靜于2011年在其研究[5]中提出了通過篩查北京耐甲氧西林偽中間型葡萄球，得出耐藥基因譜型為mecA、ermB、tetK、aacA-aphD。2016年北京地區(qū)周傳鐸[56]等人通過對23株偽中間型葡萄球菌進(jìn)行篩查，未找到到mecA基因，得出17.39%的耐藥基因譜型為aacA-aphD和linA/linA’，并且發(fā)現(xiàn)有87%的菌株均檢出了耐藥基因。耐藥菌株中均可檢測出耐藥基因的不同基因譜型，將本試驗中提取的DNA片段與耐藥基因引物相反應(yīng)，可檢測出本試驗分離的能引起犬細(xì)菌性皮膚病主要致病細(xì)菌基因序列中是否含有耐藥基因。因此，盡早使用DNA技術(shù)對細(xì)菌耐藥性進(jìn)行檢測，了解耐藥菌株性質(zhì)，及時進(jìn)行防控。通過對引起犬細(xì)菌性皮膚病主要致病菌的耐藥基因的檢測結(jié)合相關(guān)藥敏試驗結(jié)果，研究出合理的治療用藥方案，從數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)致病性細(xì)菌的耐藥性問題十分嚴(yán)重，警醒人們應(yīng)及時地避免已產(chǎn)生耐藥性犬細(xì)菌性皮膚病的主要致病菌向人類傳播的發(fā)生，盡早研制出適宜的防治方法，加強對抗生素濫用的監(jiān)管力度，善用現(xiàn)代化科學(xué)技術(shù)防患于未然，保護人類健康。4.3研究過程中的不足樣本數(shù)量太少，冬季犬患皮膚病病例較少，收集數(shù)據(jù)時間較短，樣本組不夠，得出的實驗數(shù)據(jù)結(jié)論與相關(guān)文獻(xiàn)中存在著一定差異，目前樣本數(shù)只能得出些許結(jié)論，存在一定的偶然性，若想更充分地了解犬細(xì)菌性皮膚病主要致病菌的流行病學(xué)及生物學(xué)特征，還需要更長期地收集更大量的樣本量。本試驗中所分離到的桿菌數(shù)量較少，應(yīng)考慮其可能為雜菌的情況，所得數(shù)據(jù)僅作為參考。采樣時，因患處長期暴露在外，可能會采集到污染菌，為了防止污染菌影響實驗結(jié)果，在采樣時盡量應(yīng)在患處中心采取，接種操作應(yīng)嚴(yán)格無菌操作。目前DNA測序還有待進(jìn)一步實驗，僅能對引起犬患細(xì)菌性皮膚病的主要致病菌進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果還需結(jié)合藥敏試驗，生化試驗，DNA同源性比對等進(jìn)一步證實。5結(jié)論犬細(xì)菌性皮膚病多發(fā)于2-4歲長毛犬，冬季發(fā)病少，多為繼發(fā)性感染，寄生蟲和細(xì)菌可同時造成犬細(xì)菌性皮膚病的混合感染且多種菌種可共同感染發(fā)病。其次，犬細(xì)菌性皮膚病致病菌可溶血也可不溶血，均為革蘭氏陽性菌，其中革蘭氏陽性葡萄球菌占比大，是引起犬細(xì)菌性皮膚病的最主要致病菌菌屬?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】[1]王心竹.淺談我國寵物行業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2018(2):57-59.[2]劉清華，喬海蓮，權(quán)中會等.西安地區(qū)寵物犬皮膚病的流行病學(xué)分析[J].中國獸醫(yī)雜志，2013，49(5):61-64.[3]童勝濤.武漢地區(qū)犬貓細(xì)菌性皮膚病流行病學(xué)調(diào)查及病原分離鑒定[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.[4]童勝濤，邵詠旋，謝倩茹等.犬膿皮病診療研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2016，43(1):274-279[5]楊靜．犬化膿感染病原菌耐藥性調(diào)查及耐甲氧西林假中間型葡萄球菌流行病學(xué)研究[D]．北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2011．[6]JeffersJG.Topicaltherapyfordrug-resistantpyodermainsmallanimals.VeterinaryClinicsofNorthAmerica：SmallAnimalPractice，2013，43(1)：41-50.[7]RuzauskasM，CoutoN，KerzieneS，SiugzdinieneR，KlimieneI，VirgailisM，PombaC.Prevalence，speciesdistributionandantimicrobialresistancepatternsofmethicillin-res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