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醫(yī)學分子生物學PCR(PolymeraseChainReaction)瀘醫(yī)附院檢驗科分子實驗室：李寶林PCR什么是PCR？聚合酶式反響〔polymerasechainreaction，簡稱PCR〕，又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促反響擴增技術。PCR的用途擴增各種蛋白的基因：用于基因重組、蛋白表達、構建cDNA文庫PCR后的測序：可以很快地測出常規(guī)的PCR產(chǎn)物或單鏈的DNA序列用于分子進化和種系發(fā)育的研究，因為在一些巨大分子的序列中含有足夠的進化信息，通過PCR對其編碼基因的擴增，并與較近或較遠的種系比較，研究其分子進化及種系發(fā)育是很有用的分析和診斷遺傳性疾病，根據(jù)其基因的缺失或突變對其做出診斷。如甲型血友病、苯丙酮酸尿癥、地中海貧血等有特定的遺傳性基因，可以做出明確的診斷對人類HLA基因的多肽性分析，用于器官移植的配型。比原有的免疫學方法要好得多，無論在準確性及特異性，檢測的速度等方面都提高了許多PCR技術的開展史第一代：手動/機械手式水浴箱基因擴增三個水浴箱恒定三個溫度，94°58°72°優(yōu)點：設備簡單，投資少，與自動擴增儀相比無需升降溫過程，實驗時間短，更接近理想PCR反響條件缺點：實驗人員勞動強度大，易疲勞而出過失，標本在移動過程中會暴露在空氣下，溫度受影響。而且有的地方由于氣壓水溫無法到達94°第二代：自動化控制型定性基因擴增儀與第一代水浴式擴增儀相比，也有人稱該種擴增儀為干式基因擴增儀，它是最具代表性的擴增儀，包括后續(xù)介紹的第三代、第四代都是以第二代為根底集成了定量檢測局部

無法對初始模板精確定量無法實時監(jiān)測擴增情況跑膠繁瑣，易污染PCR技術的開展史PCR技術的開展史第三代：終點定量/半定量第二代的定性PCR只能判斷陰性陽性，而無法評價特定核酸的濃度及定量分析，定量PCR至少能到達定性PCR無法實現(xiàn)的以下功能：潛伏期病毒濃度探測感染程度致病病原體數(shù)量變化測定抗病毒藥物療效評估恢復期病毒載量檢測PCR技術的開展史第四代：實時定量PCR實時定量QPCR儀＋實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統(tǒng)。PCR的根本原理PCR由變性--退火--延伸三個根本反響步驟構成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反響作準備

模板DNA與引物的退火〔復性〕：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合

引物的延伸：DNA模板--引物結合物在72℃、DNA聚合酶〔如TaqDNA聚合酶〕的作用下，以dNTP為反響原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保存復

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