細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

第五章細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)CellCultureTechnique概念：是在無菌條件下，取出活體結(jié)構(gòu)成分（活體組織、細(xì)胞或器官等），置于類似體內(nèi)生存的生理環(huán)境中，使其生長、增殖并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。分類：

組織培養(yǎng)（tissueculture）

細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）器官培養(yǎng)（organculture）第五章細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)CellCultureTechnique（一）培養(yǎng)細(xì)胞生長的基本條件1.無污染環(huán)境environment：

2.恒定的溫度temperature：3.氣體gas：4.細(xì)胞培養(yǎng)基culturemedium

：（一）培養(yǎng)細(xì)胞生長的基本條件4.細(xì)胞培養(yǎng)基culturemedium：（1）合成培養(yǎng)基（syntheticmedium）：如：EagleMEM、DMEM、RPMI1640、M199等培養(yǎng)基的選擇有一定的原則性也有一定的靈活性。一般選用建細(xì)胞系時使用的培養(yǎng)基，這是選擇培養(yǎng)基的原則。對于建立新的細(xì)胞系（株），則多參考相關(guān)文獻(xiàn)，選擇使用幾種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和比較，摸索各種培養(yǎng)條件。一旦成功，既可按同樣的培養(yǎng)基、血清和培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)。

（一）培養(yǎng)細(xì)胞生長的基本條件（2）天然培養(yǎng)基(naturalmedium)：常用各種血清血清滅活（清除補(bǔ)體成分）：將血清解凍后，置水浴箱中于56℃孵育30min。（3）無血清培養(yǎng)基(serumfreemedium)

：無血清培養(yǎng)基多以合成培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，再補(bǔ)加其它成分。補(bǔ)加成分主要有激素、生長因子、各種功能蛋白、脂肪酸、酶抑制劑和微量元素等。常用基礎(chǔ)培養(yǎng)液是HamF12和DMEM混合培養(yǎng)液，兩者1:1混合，補(bǔ)加6~15mlHEPES與1.2g/LNaHCO3。1.培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式

(1)貼附型生長（錨定依賴性）

(2)懸浮型生長

(二)培養(yǎng)細(xì)胞的特性2.培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點（1）貼附(attachment)

（2）接觸抑制

（contactinhibition）

（3）密度依賴

(densitydependency)

(二)培養(yǎng)細(xì)胞的特性3.培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程

(1)原代培養(yǎng)(primaryculture)：

(2)傳代(subculture)：細(xì)胞系(cellline)

有限細(xì)胞系(finitecellline)細(xì)胞系的生長過程一般可分為三個階段：（1）原代培養(yǎng)或初代培養(yǎng)期：（2）傳代期：傳代30～50次（3）衰退期：(二)培養(yǎng)細(xì)胞的特性接種（inoculation）后細(xì)胞生長分三個階段：

(1)潛伏期(latentphase):(2)指數(shù)生長期(exponentialgrowthphase):(3)平臺期(plateauphase):(二)培養(yǎng)細(xì)胞的特性有限細(xì)胞系

“危機(jī)期”衰退期死亡。“危機(jī)期”無限細(xì)胞系無限細(xì)胞系(infinitecellline):細(xì)胞獲得永生性而具有持久或無限增殖的能力。無限細(xì)胞系：NIH3T3、Rat-1、10T1/2惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：

細(xì)胞株（Cellstrain）：利用單細(xì)胞分離培養(yǎng)法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中分離出單個細(xì)胞后經(jīng)增殖形成的細(xì)胞群.(二)培養(yǎng)細(xì)胞的特性二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備和準(zhǔn)備工作（一）基本設(shè)備1.實驗室設(shè)計

2.常用設(shè)施及設(shè)備（1）超凈工作臺：也稱凈化工作臺(垂直式、水平層流式）

（2）無菌操作間：由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。（3）普通操作間：普通培養(yǎng)箱、離心機(jī)、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物品。（4）洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。（5）分析間顯微鏡、計算機(jī)及打印機(jī)等。離心機(jī)櫥柜 載物臺培養(yǎng)室冰箱 遞物小窗 培養(yǎng)箱 試劑柜實驗室實驗臺凈化臺實驗儀器臺顯微鏡載物臺衣柜冰箱水池緩沖間專用培養(yǎng)實驗室布局示意圖CO2培養(yǎng)箱倒置生物顯微鏡(熒光)二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備和準(zhǔn)備工作3.培養(yǎng)用器皿常用的培養(yǎng)用器皿有下面幾種：（1）液體儲存瓶：（2）培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、多孔培養(yǎng)板（3）吸管：刻度吸管、滴管（彎頭和直頭）（4）離心管：大腹式尖底離心管和普通尖底離心管。（5）其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等4.取材用器械：各種培養(yǎng)用品（二）清洗和滅菌1.清洗：（1）玻璃器皿：四步驟。

①浸泡：②刷洗：③浸酸：清潔液浸泡時間不少于6小時，一般應(yīng)過夜。④沖洗：

（二）清洗和滅菌

成

分

強(qiáng)酸溶液

次強(qiáng)酸溶液

弱酸溶液

重鉻酸鉀（g）

63120100

濃硫酸（ml）

1000200100

蒸餾水（ml）

20010001000清潔液配制：常配成不同的濃度，常用的有下列三種：（2）塑料制品(各種培養(yǎng)板等)：①浸泡：必要時用2%NaOH浸泡過夜，②刷洗：用自來水充分沖洗，③浸酸：再用5%鹽酸溶液浸泡30min，④沖洗：最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈。（3）膠塞：清水浸泡后用2%NaOH溶液煮沸10min。自來水沖洗晾干后，再用1%稀鹽酸浸泡30min。最后分別用自來水和重蒸水各沖洗3次（二）清洗和滅菌2.消毒：（A）物理滅菌法（紫外線、濕熱、干熱、過濾等）；（B）化學(xué)滅菌法（各種化學(xué)消毒劑）；（C）抗生素。（二）清洗和滅菌消毒措施：（1）紫外線消毒：培養(yǎng)室紫外線燈應(yīng)距地面不超過2.5米，（2）溫?zé)幔ǜ邏海┫荆河糜谀承┡囵B(yǎng)用液、手術(shù)器械以及其它一些工具的消毒。

（3）干熱消毒：

用于玻璃器皿的干熱消毒。

（4）過濾除菌：用于培養(yǎng)用液除菌，濾膜的孔徑有0.8

m、

0.45

m、0.22

m、和0.1

m等數(shù)種。常用

0.22

m濾膜（5）化學(xué)消毒：最常見的是70%酒精及0.1%的新潔爾滅，（6）抗生素滅菌：主要用于培養(yǎng)用液的預(yù)防污染作用。（二）清洗和滅菌干熱烤箱(50℃

~250℃)高壓滅菌鍋正壓濾器消毒物品

壓力蒸汽

干熱

過濾

紫外線

化學(xué)氣體

化學(xué)消毒劑

電離輻射

培養(yǎng)室、臺

+++玻璃制品

+++金屬器械

++++塑料用品

+++橡膠制品

++++培養(yǎng)用液

++布、棉類

++常用物品的消毒方法選擇在細(xì)胞培養(yǎng)過程中需用大量用于清洗、消化、營養(yǎng)培養(yǎng)的細(xì)胞的液體。1.水的制備：新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水。2.緩沖液的配制（1）PBS的配制(見下表)（三）培養(yǎng)用液配制成

分Ringer氏液PBSTyrode氏Earle氏Hanks氏BSSGey氏BSSPuck氏BSSDulbecco

氏D-HankKCl0.420.200.200.400.400.370.400.200.40KH2PO40.20—0.060.030.150.200.06MgCl2.6H2O—0.10—0.100.21—0.10—MgSO4.7H2O—0.200.100.070.1540.10—CaCl20.25—0.200.200.140.170.012——NaCl0.98.008.006.688.007.008.008.008.00NaHCO—1.002.200.352.27——0.35NaH2PO4.H2O—0.050.14—————Na2HPO4.7H22.161.00—0.090.2260.39*2.160.09葡萄糖—1.001.001.001.00——酚紅

—0.010.01—0.005—0.01幾種常用的平衡鹽溶液配方（g/L）

(3)5.6%NaHCO3溶液NaHCO35.6g三蒸水加至100ml過濾除菌或高壓蒸汽滅菌（10磅10min）。分裝小瓶（每瓶5ml），于4℃冰箱內(nèi)保存。HEPES238.3g三蒸水加至

1L(2)1MolHEPES緩沖貯存液(50~100倍)過濾除菌。分裝小瓶（每瓶10~25ml）。于4℃保存。（三）培養(yǎng)用液配制3.培養(yǎng)液的配制（1）合成培養(yǎng)基的配制:

①溶解、調(diào)pH值、定容：雙蒸水、添加劑、青鏈霉素、1N的鹽酸和NaOH，最后定容至1000ml，搖勻。②抽濾分裝，置4℃冰箱備用。③添加谷氨酰胺：使用前向按1：100的比例向培養(yǎng)液中加入谷酰胺溶液（4℃，兩周有效）。（2）血清的滅活：血清要在56℃恒溫水浴中滅活30min（三）培養(yǎng)用液配制4．各種消化液的配制（1）0.25％胰蛋白酶液:

注射式濾器過濾，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。?）膠原酶溶液：濃度為0.1％，配制同胰蛋白酶。

濾器過濾，分裝于10ml小瓶，于-20℃保存。（三）培養(yǎng)用液配制胰蛋白酶粉劑（1:250）250mg無Ca2+、Mg2+的BSS加至100ml膠原酶粉劑100mg無Ca2+、Mg2+的BSS加至100ml（3）EDTA（二乙烯四乙酸二鈉）溶液：工作濃度為

0.02%，D-Hanks液溶解，高壓滅菌后即可使用。

用1：1的EDTA（0.02%）和胰蛋白酶(0.25%)混合液消化細(xì)胞可提高消化效率，但EDTA不能被血清中和，消化后要徹底清洗，否則細(xì)胞易脫壁。EDTA

4Na200mg無Ca2+、Mg2+的

BSS加至1L酚紅15mg（三）培養(yǎng)用液配制5.青、鏈霉素溶液的配制青霉素和鏈霉素的使用濃度分別為100U/ml。青霉素1.0×106IU生理鹽水加至100ml鏈霉素1g6.200mmol/L谷氨酰胺貯存溶液(100倍)

分裝小瓶（每瓶1~10ml）。用時每升培養(yǎng)液加此溶液10ml。于-20℃保存。谷氨酰胺2.922g三蒸水加至100ml充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過濾除菌。分裝小瓶（每瓶5~10ml）。于-20℃保存。（三）培養(yǎng)用液配制（一）基本操作和要求1.培養(yǎng)前準(zhǔn)備2.培養(yǎng)室和超凈工作臺的消毒無菌培養(yǎng)室：0.2%的新潔爾滅或2%～5%來蘇兒拖地，紫外線照射消毒30～50min。超凈工作臺：臺面用75%酒精擦洗，紫外線消毒30min。其它：移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)，再經(jīng)紫外線照射消毒。3.洗手和著裝：工作服可經(jīng)紫外線照射30min。4.無菌培養(yǎng)操作三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)（二）原代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，是從供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)。1.組織塊培養(yǎng)法三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)2.消化培養(yǎng)法

酶消化法注意事項：用胰蛋白酶溶液過度消化細(xì)胞也會對細(xì)胞造成較大傷害。因此，必須注意控制酶量（酶濃度）、作用時間長短以及酶處理溫度。配制消化酶溶液時應(yīng)注意使用適當(dāng)?shù)娜芤海ú缓珻a2+、Mg2+），調(diào)節(jié)至合適的酸堿度。到底使用哪一種消化酶溶液，要根據(jù)擬解離組織的細(xì)胞外間質(zhì)的具體構(gòu)成成分而定。三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)3．原代培養(yǎng)取材過程中的注意事項：（1）取材要準(zhǔn)確真正取到目的組織，而且要盡量剔除干凈附帶的其它組織成分或結(jié)構(gòu)成分。（2）不同組織的取材及制備培養(yǎng)材料的步驟在具體操作過程中，需根據(jù)具體實驗對象，基調(diào)整本步驟。（3）注意取材過程的速度、力度、溫度、組織營養(yǎng)等。4．無菌操作技術(shù)無菌觀念和無菌操作必須貫穿整個體外培養(yǎng)過程的始終。三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)3．細(xì)胞純化：按照上述步驟所獲得的組織塊或細(xì)胞懸液，內(nèi)含各種原本存在的細(xì)胞成分，用這樣的材料進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)物將是含有多種細(xì)胞的混合物。如何從所制備的細(xì)胞懸液中得到單一的細(xì)胞類型，亦即如何分離出各種各樣的細(xì)胞成分，才是培養(yǎng)前更為重要的過程。

酶消化法機(jī)械刮除法差速粘附法密度梯度離心法流式細(xì)胞分選術(shù)免疫磁珠分離術(shù)4．生長基質(zhì)（growthsubstratum）：常指培養(yǎng)器皿表面上涂布（包被）一層能夠促進(jìn)培養(yǎng)物粘附、貼壁與鋪展的生物活性物質(zhì)。膠原、多聚賴氨酸（poly-L-lysine）、多聚鳥氨酸、層粘連蛋白、纖連蛋白等。（1）膠原的制作及包被方法

①選健康成年大鼠1只，在沒有麻醉的情況下用剪刀迅速剪下新鮮鼠尾。立即用肥皂粉水及清水清洗干凈。先用碘酒棉球檫拭消毒，再以95%酒精浸泡消毒約30分鐘。晾干備用。

②無菌條件下抽取大鼠尾腱：用大止血鉗夾住鼠尾頭端，用電工鉗從鼠尾的另一端剪切。以聽到“喀嚓”聲但不剪斷鼠尾為宜，此時僅將鼠尾皮膚剪開而內(nèi)面的尾腱未被剪斷。然后，兩手分別向相反方向用力，將大鼠尾腱從斷口抽出。用剪刀將抽出的尾腱剪下，置一無菌器皿中存?zhèn)?。重?fù)步驟②

③收集所獲大鼠尾腱，稱重。三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)④將大鼠尾腱置入盛有滅菌的0.1%醋酸溶液瓶中。每毫升醋酸溶液加尾腱2.5mg。于4℃冰箱內(nèi)溶解2~3d。4℃離心（4000rpm）30min。上清液即鼠尾膠原液。分裝并凍存于冰箱中備用。⑤包被方法如下：取擬包被滅菌培養(yǎng)瓶、皿或蓋玻片若干，用吸管或移液器吸取鼠尾膠原液，均勻涂布其表面。涂好后，將培養(yǎng)器皿置于預(yù)先放有氨水棉球密閉容器內(nèi)，讓氨氣熏蒸15~25min。鼠尾膠原將凝固成凍膠狀。取出熏蒸好的培養(yǎng)器皿，用無菌緩沖液反復(fù)浸洗以除去氨，至Hanks液顏色不再變化為止。接種植塊前可再用培養(yǎng)液浸泡約1min。備用。也可以將涂布好膠原的培養(yǎng)器皿不經(jīng)氨氣熏蒸，而在37℃

下自然干燥1~2d。備用。三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)（2）多聚賴氨酸溶液的配制及包被方法多聚賴氨酸一般使用濃度為0.1~1mg/ml，可用Tris-HCl（0.15mol/L,pH8.4）緩沖溶液或蒸餾水配制，過濾除菌?？蓪⑵浼拥脚囵B(yǎng)瓶皿內(nèi)（使用量以覆蓋住生長表面為宜），過夜。再用無Ca2+、Mg2+BSS或BPS浸洗，使用前用培養(yǎng)液浸泡過渡備用。三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)（三）傳代培養(yǎng)三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)（三）傳代培養(yǎng)三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)吸除培養(yǎng)液消化前細(xì)胞加消化液消化后細(xì)胞吸除消化液加培養(yǎng)液終止消化吹打制成細(xì)胞懸液計數(shù)接種（四）細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇保存一個細(xì)胞系或細(xì)胞株，是細(xì)胞培養(yǎng)中的重要工作。細(xì)胞儲存在液氮中的溫度低至-196℃?；驹瓌t：慢凍快融，這樣可以最大限度地減少細(xì)胞在凍存和復(fù)蘇過程中的損害，保存細(xì)胞活力。三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)細(xì)胞的凍存：保護(hù)劑：二甲基亞砜(DMSO)

三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)方法與過程：（1）選擇指數(shù)生長期的細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液。（2）配制含10%DMSO的凍存培養(yǎng)液。（3）消化細(xì)胞，用凍存培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液，移入凍存管并作好標(biāo)記。（4）將凍存管放入4℃冰箱，約40min。（5）將凍存管置于-20℃冰箱，約30~60min。（6）將凍存管置于-80℃超低溫冰箱中過夜。（7）將凍存管置于-196℃液氮罐中長期保存。注意事項：①DMSO不需要進(jìn)行高壓滅菌，因為它本身就有滅菌的作用，高壓滅菌反而會破壞它的分子結(jié)構(gòu)，降低冷凍保護(hù)效果。常溫下DMSO對人體有害，故在配制時最好戴上手套操作。②不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內(nèi)過久，因為低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，這是“危險溫區(qū)”。③注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時添加。細(xì)胞的凍存：

三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)2.細(xì)胞的復(fù)蘇：復(fù)蘇細(xì)胞與凍存的要求相反，要快速融化。（1）將水浴鍋預(yù)熱至37℃。（2）從液氮罐中取出凍存管。迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍（3）約1~2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解。取出凍存管，以1000rpm離心3min。（4）用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，放入超凈臺內(nèi)。（5）吸棄上清液，向離心管內(nèi)加入培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計數(shù)。接種密度以5×105/ml為宜。（6）將細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長狀況及時換液傳代。三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)四、細(xì)胞培養(yǎng)的主要觀察和檢測技術(shù)（一）活細(xì)胞的常規(guī)觀察：連續(xù)的、動態(tài)的觀察1.培養(yǎng)液狀態(tài)

肉眼觀察：重點觀察培養(yǎng)液的顏色和透明度的變化。一般正常情況生長穩(wěn)定的細(xì)胞2~3d需換液一次，生長緩慢的細(xì)胞3~4d需換液一次。出現(xiàn)混濁多為污染（懸浮細(xì)胞培養(yǎng)除外）。2.細(xì)胞生長狀況

細(xì)胞增殖：細(xì)胞傳代后經(jīng)潛伏期進(jìn)入指數(shù)生長期，貼壁生長的細(xì)胞長滿瓶底的80%就應(yīng)及時傳代否則進(jìn)入平臺期后開始衰退。懸浮細(xì)胞增生明顯，培養(yǎng)液變黃時應(yīng)傳代。3.細(xì)胞形態(tài)變化

細(xì)胞生長狀況良好：透明度大、折光性強(qiáng)、輪廓不清，

指數(shù)生長期可見到分裂細(xì)胞。細(xì)胞生長狀態(tài)不良：細(xì)胞折光性變?nèi)?，輪廓增?qiáng)；胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴、顆粒樣物質(zhì)，有時細(xì)胞表面和周圍出現(xiàn)絲絮狀物，部分細(xì)胞死亡、崩解、漂浮。傳代和實驗：選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞問題與對策：生長狀態(tài)不良的原因、處理措施.四、細(xì)胞培養(yǎng)的主要觀察和檢測技術(shù)細(xì)胞生長狀況良好細(xì)胞生長狀態(tài)不良3.細(xì)胞形態(tài)變化4.微生物污染

細(xì)菌：培養(yǎng)液變黃、混濁，霉菌：細(xì)胞間有絲狀結(jié)構(gòu)支原體：細(xì)胞生長異常緩慢

問題與對策：四、細(xì)胞培養(yǎng)的主要觀察和檢測技術(shù)DNA熒光染色法檢測細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染4.微生物污染檢測:利用熒光染料（bisbenzimide,Hoechst33258）檢測支原體污染。這種染料會結(jié)合到DNA的A-T富集區(qū)域，因為支原體的DNA中A-T含量高（55%-80%），所以可將其染色而檢測。被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點，即為支原體的DNA，證明有支原體污染。污染的預(yù)防1．培養(yǎng)操作前的準(zhǔn)備2．培養(yǎng)操作時的注意事項3．其它注意事項①為了確保培養(yǎng)物的安全，應(yīng)及早凍存有價值的培養(yǎng)物。重要細(xì)胞系（株）的傳代工作應(yīng)由兩人獨立進(jìn)行；②購入的未滅活血清應(yīng)采取56°C水浴滅活30min的措施以使血清中的補(bǔ)體和支原體滅活；③為了避免誘導(dǎo)抗藥細(xì)菌，應(yīng)定期更換培養(yǎng)系統(tǒng)中的抗菌素，或盡可能不用抗菌素；④對新引進(jìn)的細(xì)胞株應(yīng)加強(qiáng)觀察，防止外來的污染源；⑤定期清潔CO2培養(yǎng)箱，用消毒劑（如0.1%新潔爾滅）抹拭以防止和清除霉菌的生長。三、污染的排除盡早消毀受到污染的培養(yǎng)細(xì)胞。挽救珍貴細(xì)胞系以及在操作中難于避免污染的培養(yǎng)情況，例如從樣品中新分離出的細(xì)胞，或估計在操作中有可能被污染的細(xì)胞。抗菌素的應(yīng)用：慣常采用在培養(yǎng)液中加入抗革蘭氏陽性（G+）和陰性（G–）細(xì)菌的抗菌素，如青霉素與鏈霉素。懷疑污染時可直接進(jìn)行大劑量（5~10倍的常規(guī)劑量）沖擊用藥?？咕乜?/p>

菌

譜常用濃度細(xì)菌真菌支原體青霉素G+100IU/ml鏈霉素G–100

g/ml慶大霉素G+/G–+200

g/ml四環(huán)素G+/G–+10

g/ml卡那霉素G+/G–+50

g/ml兩性霉素+2

g/ml制霉菌素+25

g/ml常用抗菌素及其推薦用量見表利用96孔培養(yǎng)板可同時進(jìn)行多藥多劑量培養(yǎng)試驗，是挽救受污染細(xì)胞的一種簡單而有效的辦法。實驗材料：①約100ml的RPMI1640完全培養(yǎng)液②96孔培養(yǎng)板1塊；③預(yù)選好的抗菌素1~4種。（2）實驗步驟

①選好抗菌素（1~4種）500倍濃度的母液②將抗菌素母液在96孔板內(nèi)進(jìn)行對倍稀釋。3孔/每稀釋度，

0.1ml/每孔體積。4種抗菌素/每96個孔板。③在已含抗菌素的孔中加入0.1ml懷疑污染的培養(yǎng)細(xì)胞（含

104個）液。此時最未孔的抗菌素含量相當(dāng)于常規(guī)濃度將④培養(yǎng)24hr，觀察、選出生長良好的培養(yǎng)物，在相應(yīng)濃度的抗菌素下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。注：真菌污染：選用兩性霉素和制霉菌素。支原體污染:

四環(huán)素、卡那霉素、10g/ml4–氟喹諾酮，連用2~3wk1.抗生素篩選培養(yǎng)試驗巨噬細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下仍然可以吞噬微生物并將其消化。利用96孔培養(yǎng)板將極少量的培養(yǎng)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，可以在高度稀釋培養(yǎng)細(xì)胞、極大地降低微生物污染程度的同時，更有效地發(fā)揮巨噬細(xì)胞清除污染的效能。本方法通常與抗菌素聯(lián)合應(yīng)用。（1）主要實驗材料

①6~12周齡的任何品系和性別的健康小鼠；②約100ml的RPMI1640完全培養(yǎng)液③無血清RPMI1640培養(yǎng)液④96孔和24孔培養(yǎng)板。2．巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的方法（2）實驗過程:①以頸椎脫臼法處死小鼠。經(jīng)皮消毒，無菌剪開小鼠腹腔，用2ml4℃的PBS沖洗腹腔2~3次。②收集沖洗液，計數(shù)細(xì)胞。離心5min沉淀腹腔細(xì)胞。用無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞,離心沉淀。用RPMI1640

完全培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至106個/ml。此即為所收集的腹腔巨噬細(xì)胞.③將細(xì)胞懸液加到96孔培養(yǎng)板，每孔0.1ml（含細(xì)胞105個）。

37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。④第二天即可觀察到貼壁生長的腹腔巨噬細(xì)胞。⑤將污染細(xì)胞液用完全培養(yǎng)液稀釋成為100個/ml。⑥稀釋細(xì)胞加入巨噬細(xì)胞培養(yǎng)板（3排）中，每孔加0.1ml（含5個細(xì)胞）⑦其余細(xì)胞懸液再用等體積的完全培養(yǎng)液稀釋。將稀釋的細(xì)胞懸液加入另外（3排）,每個孔加0.1ml（含5個細(xì)胞）。⑧如上類推，第四次稀釋后每個孔接種的體積為0.1ml（1個)⑨將接種了污染細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板置37℃、含5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。⑩每隔3d用含青、鏈霉素的新培養(yǎng)液置換孔內(nèi)1/2培養(yǎng)液。（3）結(jié)果分析污染的細(xì)胞經(jīng)高度稀釋后與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)下可生長形成克隆性集落。凡是有克隆生長的孔，表明細(xì)胞已經(jīng)凈化?？梢允占寺〖?xì)胞到24孔板內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。3．小鼠皮下/腹腔過繼培養(yǎng)方法這是一種適用于清除連續(xù)傳代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞細(xì)菌與支原體污染的一種方法。由于裸鼠存在T細(xì)胞免疫缺陷，可以接受人的腫瘤細(xì)胞，形成移植瘤。裸鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞及其它非特異的防卸體系仍可消滅、抵卸少量微生物。利用這一特性，可將懷疑受了污染的腫瘤細(xì)胞接種于裸小鼠的皮下或腹腔。該方法也常應(yīng)用于與小鼠品系同源的其它培養(yǎng)細(xì)胞系。如用Bald/C小鼠凈化已污染了微生物的同源雜交瘤細(xì)胞。

（二）細(xì)胞鋪片的HE染色技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞的HE染色過程與組織切片的染色過程基本相同但培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備有其特點，貼壁生長的細(xì)胞常用蓋玻片培養(yǎng)法制備，懸浮生長的細(xì)胞可用離心甩片機(jī)制備。其步驟如下：細(xì)胞按約為1×105/ml接種于含蓋玻片的培養(yǎng)瓶中，放入

CO2孵箱培養(yǎng)一段時間，待細(xì)胞基本長成單層，取出長有細(xì)胞的蓋玻片，用PBS洗3次。2.將蓋玻片浸入95%酒精固定15min。3.PBS洗2次，每次1min。4.浸入蘇木精染液，染色5～10min。5.自來水浸洗。四、細(xì)胞培養(yǎng)的主要觀察和檢測技術(shù)6.浸入稀鹽酸酒精溶液數(shù)秒鐘分色。7.自來水浸洗。8.浸入淡氨水中3～5min，使細(xì)胞核藍(lán)化。9.自來水浸洗。10.浸入伊紅染液，染色5～10min。11.自來水浸洗。12.經(jīng)70%、80%、90%酒精各1次、95%酒精2次

100%酒精3次逐級脫水，每次1min。13.通過二甲苯3次，每次1min。14.在載玻片上滴加中性樹膠，將有細(xì)胞一面的蓋玻片向下封固于載玻片上。15.于光鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色。四、細(xì)胞培養(yǎng)的主要觀察和檢測技術(shù)（二）細(xì)胞鋪片的HE染色技術(shù)（三）細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞計數(shù)是觀察培養(yǎng)細(xì)胞絕對數(shù)值最簡單的方法?？赏ㄟ^計數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞的絕對值來確定實驗細(xì)胞的濃度調(diào)整、繪制細(xì)胞的生長曲線等。繪制細(xì)胞生長曲線：根據(jù)不同細(xì)胞系生長速度，連續(xù)對培養(yǎng)細(xì)胞計數(shù)7~10天，每天計數(shù)樣品數(shù)應(yīng)不低于3個，再求平均值。四、細(xì)胞培養(yǎng)的主要觀察和檢測技術(shù)注意事項：①進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)時，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104

個/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少，要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。②要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，取樣前應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，否則影響計數(shù)準(zhǔn)確性。③細(xì)胞壓中線，只計左側(cè)和上方細(xì)胞，不計右側(cè)和下方細(xì)胞。④2個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計算。如果細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明消化不充分。（三）細(xì)胞計數(shù)（四）四唑鹽（MTT）檢測技術(shù)：一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。原理：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。四、細(xì)胞培養(yǎng)的主要觀察和檢測技術(shù)應(yīng)用：該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測，大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選，細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、重復(fù)性好，操作簡便、經(jīng)濟(jì)、快速、易自動化，無放射性污染，與其他檢測細(xì)胞活力的方法有良好的相關(guān)性。（四）四唑鹽（MTT）檢測技術(shù)：方法與步驟：接種：用消化液消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，以每孔103～104個細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μl。2.培養(yǎng)：在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)3～5天。3.呈色：每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃繼續(xù)孵育4h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。對于懸浮生長的細(xì)胞，需離心（1000rpm，5min），然后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μlDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。4.比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。（四）四唑鹽（MTT）檢測技術(shù)：注意事項：①選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度：在進(jìn)行MTT實驗前，應(yīng)檢測細(xì)胞貼壁率、倍增時間及不同接種細(xì)胞量的細(xì)胞生長曲線，然后確定實驗中每孔的接種細(xì)胞量和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止時細(xì)胞數(shù)不至于過多。這樣才能保證MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系。②避免血清干擾：用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時，高濃度的血清物質(zhì)會影響實驗孔的光吸收值。實驗本底增加，降低實驗敏感性。因此，一般選小于10%血清的培養(yǎng)液進(jìn)行實驗。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。③設(shè)空白對照：設(shè)與實驗孔平行、不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔。其它實驗步驟保持一致。比色時以空白孔調(diào)零。（四）四唑鹽（MTT）檢測技術(shù)：（五）克?。洌┬纬蓪嶒灴寺⌒纬蓪嶒炇菧y定單個細(xì)胞增殖能力的有效方法之一。概念：單個細(xì)胞在體外持續(xù)增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，稱為克隆或集落(clone)，這時的每個克隆可含有50個以上的細(xì)胞，克隆大小在0.3～1.0mm之間。意義：通過計數(shù)克隆形成率(cloningefficiency)，可對單個細(xì)胞的增殖潛力作定量分析，了解細(xì)胞的增殖力和對生存環(huán)境的適應(yīng)性，克隆形成率高者其獨立生存能力強(qiáng)。應(yīng)用：這種方法常用于抗癌藥物敏感性實驗、腫瘤放射生物學(xué)實驗等。常用的方法有平板克隆形成實驗和軟瓊脂克隆形成實驗。四、細(xì)胞培養(yǎng)的主要觀察和檢測技術(shù)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)

神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元）不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時，可出現(xiàn)一定程度的分化，長出突起等現(xiàn)象，但很難使之增殖。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。

人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長的膠質(zhì)細(xì)胞，也可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。一般說來，膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中生長不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉(zhuǎn)化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒等誘發(fā)轉(zhuǎn)化。

五、常見二倍體細(xì)胞的取材與培養(yǎng)設(shè)備：

1.無菌操作設(shè)備。

2.大型設(shè)備CO2培養(yǎng)箱：5%、10%CO2。

3.倒置顯微鏡：用于每天觀察貼壁細(xì)胞生長情況。

4.解剖顯微鏡，用于準(zhǔn)確地取材。

5.常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養(yǎng)液，解剖液和鼠尾膠。

6.低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲存血清酶等貴重物品。

7.電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。

8.高壓消毒鍋：用于消毒培養(yǎng)皿，手術(shù)器械。

9.過濾器：配制解剖液、培養(yǎng)液等。

10.滲透壓儀，pH劑，天平等。

無菌培養(yǎng)器皿及手術(shù)器械（已消毒無菌）

1培養(yǎng)皿：常用35mm塑料及玻璃皿。

2培養(yǎng)板，24-40孔，可用于開放培養(yǎng)。

3培養(yǎng)瓶：

4吸管：常用1，5，10ml。

5各類培養(yǎng)液貯存器。

6小型手術(shù)器械。

準(zhǔn)備：

1.配制培養(yǎng)液

（1）解剖液：以無機(jī)鹽（去除Ca2+,Mg2+）加葡萄糖配制成PBS緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。

（2）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。

（3）接種培養(yǎng)液：用于胰酶消化后的細(xì)胞分散，做成細(xì)胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入

10%馬血清，當(dāng)天配制。

（4）維持培養(yǎng)液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營養(yǎng)物質(zhì)。

2.培養(yǎng)基質(zhì):常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴氨酸，再涂膠

1.選材:

常用胚胎動物或新生鼠神經(jīng)組織。

6-8d胚齡雞胚、新生鼠、胎鼠或人胚胎。不同部位組織取材年齡不同，大鼠紋狀體10d為宜；若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚，則黑質(zhì)以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細(xì)胞成活率高，顆粒細(xì)胞正在分化。2.取材:1、拉頸處死孕18d的SD母鼠；2、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5分鐘；3、在無菌條件下取出胎鼠；2、取出相應(yīng)腦組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其切開分成背腹兩側(cè)，分別培養(yǎng)。3.細(xì)胞分離與接種:

神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細(xì)口吸管吹打細(xì)胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細(xì)胞懸液，計數(shù)，預(yù)置細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)皿（1×106），做電生理應(yīng)為5×105或更低。

4.抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長:

培養(yǎng)3-7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長。5.觀察:

接種6-12h，開始貼壁，并有集合現(xiàn)象，細(xì)胞生長突起明顯，5-7d膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，7-10d膠質(zhì)細(xì)胞成片于神經(jīng)細(xì)胞下面，形成地毯，2周時神經(jīng)細(xì)胞生長最豐滿，四周暈光明顯，一個月后，有些神經(jīng)細(xì)胞開始退化，變形，甚至出現(xiàn)空泡，一般培養(yǎng)2-4周最宜。注意:

培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞只增大，不增殖，只有原代，無有細(xì)胞周期；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以增殖。培養(yǎng)早期（9-12d）時，有較多的神經(jīng)細(xì)胞死亡，這是第一次死亡階段，應(yīng)注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細(xì)胞一般突起長而多，且相互形成突觸。

免疫組化分析注意事項:1、活細(xì)胞對抗體的通透性：由于抗體直接作用于活細(xì)胞，不易穿透活細(xì)胞，故對核內(nèi)抗原定位時，首先考慮膜對抗體的通透性問題。常用化學(xué)試劑或采用冰凍方法解決。2、各細(xì)胞組分顯示：神經(jīng)組織培養(yǎng)中細(xì)胞成分復(fù)雜，有神經(jīng)元、多種膠質(zhì)細(xì)胞等共同存在，在免疫組化中，或其它組織學(xué)染色中，常用不同的染色方法以區(qū)分不同細(xì)胞，如半乳糖腦苷脂對小樹突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記明顯；GFAP對星形膠質(zhì)細(xì)胞具有特異性染色等。這對研究神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細(xì)胞功能具有極大的應(yīng)用價值。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以往多被忽視，其在腦血管疾?。ㄈ缛毖該p傷）、退行性疾?。ㄈ鏏D、PD）、損傷后膠質(zhì)細(xì)胞的填充等具有不可忽視的作用。它也是神經(jīng)細(xì)胞功能和營養(yǎng)支持的物質(zhì)基礎(chǔ)。六、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞。當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是最多的。另外腫瘤對人類是威脅最大的疾病。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理、抗癌藥檢測、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)對闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。

1.組織培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，其差異較小，但也并非完全相同。培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞具以下突出特點：

(1)形態(tài)和性狀

培養(yǎng)中癌細(xì)胞無光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密，微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則，可能與腫瘤細(xì)胞具有不定向運(yùn)動和錨著不依賴性有關(guān)。（2）生長增殖

腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。接觸抑制消除，細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。（3）永生性

永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無限傳代而不凋亡（Apoptosis）。（4）浸潤性

浸潤性是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性增殖行為，培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時，能浸潤入其它組織細(xì)胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。

（5）異質(zhì)性

所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區(qū)的細(xì)胞獲得血液供應(yīng)多，增殖旺盛，中心區(qū)有的細(xì)胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞稱干細(xì)胞（StemCells）、只有這些干細(xì)胞才是支持腫瘤生長的成分。腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)時易于生長增殖；把干細(xì)胞分離出來的培養(yǎng)方法稱干細(xì)胞培養(yǎng)。

（6）細(xì)胞遺傳

大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細(xì)胞群常由多個細(xì)胞群組成，有干細(xì)胞系和數(shù)個亞系，并不斷進(jìn)行著適應(yīng)性演變。

腫瘤細(xì)胞在體外不易生長可能原因：

①依賴性：腫瘤細(xì)胞雖有較強(qiáng)克隆生長力，但仍有一定的群體性或與其它細(xì)胞相依存關(guān)系。一是腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互依存，二是腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞的依賴。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細(xì)胞后也會同時消除或減弱這些依存關(guān)系，可能影響癌細(xì)胞增殖生長的活性；

②腫瘤細(xì)胞的自泌下降：腫瘤細(xì)胞的自泌因分散培養(yǎng)而被稀釋，達(dá)不到腫瘤生長的需求，降低腫瘤細(xì)胞的生長增殖力；

③干細(xì)胞增殖強(qiáng)：并非所有腫瘤細(xì)胞都有強(qiáng)的生長活力和長的LifeSpan，只有干細(xì)胞才有強(qiáng)的增殖生長能力，但這些細(xì)胞數(shù)量很少；

④離體培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件。2培養(yǎng)方法腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。

(1)．取材：

人腫瘤細(xì)胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進(jìn)行培養(yǎng)，如因故不能立即培養(yǎng)，可貯存于4℃中，但不宜栽過24小時。

(2)．培養(yǎng)基：

腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用的RPMIl640、DMEM、Mc-Coy5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。(3)．成纖維細(xì)胞的排除：

成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵。

(4)、提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長率措施

根據(jù)人們的經(jīng)驗，腫瘤細(xì)胞在體外不易培養(yǎng)，建立能傳代的腫瘤細(xì)胞系更為困難。當(dāng)腫瘤組織或細(xì)胞初代接種培養(yǎng)后，常出現(xiàn)以下幾種情況：

A.完全無細(xì)胞游出或移動；

B.有細(xì)胞移動和游出，但無細(xì)胞增殖，細(xì)胞長時間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代；

C.有細(xì)胞增殖，傳若干代后停止生長或衰退死亡；

D.傳數(shù)代后細(xì)胞增殖緩慢，經(jīng)過一段停滯期后，才又呈旺盛生長狀態(tài)，形成穩(wěn)定生長的腫瘤傳代細(xì)胞系。

措施:

以上現(xiàn)象說明腫瘤細(xì)胞對體外生存條件有較高的要求，并需經(jīng)過對新環(huán)境的適應(yīng)才能生長，因此欲獲得好的培養(yǎng)效果，不能局限于一般培養(yǎng)法，必須采用一些特殊的措施。

1．適宜底物：把經(jīng)過純化的細(xì)胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細(xì)胞層等。

2．生長因子：應(yīng)用促細(xì)胞生長因子，向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細(xì)胞生長因子。根據(jù)細(xì)胞種類不同選用不同的促生長物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。

3.動物體媒介培養(yǎng)方法：

為提高腫瘤細(xì)胞對體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)力和增加有活力癌細(xì)胞（干細(xì)胞）的數(shù)量，可采用動物體轉(zhuǎn)嫁接種成瘤后，再從動物體內(nèi)取出進(jìn)行培養(yǎng)，能提高體外培養(yǎng)的成功率。受體動物以裸鼠最好。

（1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用Hanks液洗凈血污，切成1～3毫米小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤塊；

（2）飼養(yǎng)觀察，待腫瘤生長達(dá)較大體積后，剝?nèi)〕隽鼋M織；

（3）進(jìn)行體外培養(yǎng)。

（4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續(xù)在裸鼠體內(nèi)傳代。通過裸鼠媒介接種，有活力的腫瘤細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞培養(yǎng)易于成功。

5.體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測

一旦培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長成形態(tài)上單一的細(xì)胞群體或細(xì)胞系（或株）后，不論用于實驗研究還是建立細(xì)胞系，都需要做一系列的細(xì)胞生物學(xué)測定，主要的目的在于求得證明：

所培養(yǎng)的細(xì)胞系的確來源于原體內(nèi)具有惡性的細(xì)胞，而非正常細(xì)胞或其它細(xì)胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學(xué)性狀。測定項目數(shù)量無明確規(guī)定，根據(jù)需要而定，以下為常做的項目和要點。

在上述腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測中，最主要的為：異體動物（以用裸鼠為上）接種成瘤、軟瓊脂培養(yǎng)、核型分析、細(xì)胞骨架和電鏡觀察等幾項。當(dāng)然從分子細(xì)胞學(xué)角度考慮尚應(yīng)做癌基因和抗癌基因等的檢測。

【形態(tài)觀察】主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。

【細(xì)胞生長增殖】檢測細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞分裂指數(shù)、倍增時間、細(xì)胞周期時間。

【細(xì)胞核型分析】檢測核型特點，染色體數(shù)量、標(biāo)記染色體的有無、帶型等。

【凝集試驗】檢測凝集力。

【軟瓊脂培養(yǎng)】檢測集落形成能力。

【異體動物接種】向異體動物體內(nèi)（皮下）接種細(xì)胞懸液，觀察成瘤能力。

【其它】除上述項目外，根據(jù)需要還可做同位素標(biāo)記、組織化學(xué)成分分析，熒光顯微鏡觀察等。

6、對腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株的評價已建成的各種腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株，無疑都是可用的實驗對象。近年我國已建成的腫瘤細(xì)胞系已非常多，并獲得越來越廣泛的應(yīng)用。但根據(jù)研究者的經(jīng)驗，在使用這些細(xì)胞系時，應(yīng)持特別審慎態(tài)度，主要是應(yīng)考慮到這些細(xì)胞在長期傳代中有否發(fā)生遺傳性改變的可能。眾所周知，長期傳代細(xì)胞系染色體核型常是不穩(wěn)定的。另外也可能發(fā)生如基因突變、基因易位或缺失等變化。其結(jié)果可能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)性狀上的變動。以近年建成的各種腫瘤細(xì)胞系為例，都已傳代少則幾十，多則百代以上后，才確認(rèn)建成了細(xì)胞系。這種情況下很難保證細(xì)胞從初代到建成時的性狀仍是一致的。

五、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用:理論上幾乎所有類型的組織、細(xì)胞甚或器官都可以按一定方式在體外環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞生命活動的主要方面都可以在體外再現(xiàn)。因此，體外培養(yǎng)技術(shù)幾乎可以應(yīng)用到生物、醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域。（一）在組織學(xué)與胚胎學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用1．在組織學(xué)與胚胎學(xué)上的應(yīng)用組織培養(yǎng)是組織學(xué)與胚胎學(xué)領(lǐng)域科學(xué)研究的重要方法。在以體外培養(yǎng)技術(shù)研究器官發(fā)生與組織發(fā)生方面，有許多重要課