目的基因的原核表達

目的基因的原核表達XXXXX目的基因的原核表達目錄一.引言二.原核表達三.結(jié)論目的基因的原核表達目的基因的原/真核表達PART1一.引言一.引言A.簡介目的基因的定義和重要性目的基因(geneofinterest)，也稱靶標基因，是指在實驗中研究或操縱的特定基因。比如，轉(zhuǎn)基因研究中轉(zhuǎn)入到生物體內(nèi)的外源的抗蟲基因Bt或抗除草劑基因CP4-EPSPS等。目的基因可以是生物體本身的，也可以是來自不同生物體的。比如Bt基因來自蘇云金芽孢桿菌一.引言目的基因的原核表達的意義原核表達簡單來說就是用大腸桿菌來生產(chǎn)蛋白的意思，可以人為的獲得你要蛋白的基因序列，PCR擴增后，轉(zhuǎn)到表達載體上導(dǎo)入大腸桿菌，(也就是傳說中原核表達的意思，大腸桿菌是原核細胞)讓菌來定向的生產(chǎn)這個蛋白，表達載體(目的蛋白基因序列存在的能產(chǎn)蛋白的載體)所謂的誘導(dǎo)就是加IPTG一種誘導(dǎo)劑，來誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生目的蛋白，沒有誘導(dǎo)劑就不能生產(chǎn)PART2二.原核表達二.原核表達(一)獲得目的基因1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點)，PCR循環(huán)獲得所需基因片段，2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物二.原核表達(二)構(gòu)建重組表達載體1、載體酶切:將表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體二.原核表達(三)獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，根據(jù)重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定2、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點3、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達宿主菌的感受態(tài)細胞二.原核表達(四)誘導(dǎo)表達1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2mlLB(含Amp50pg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)2、按1:50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mILB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(最好0.6，大約需3hr)3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組，余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實驗組，兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr4、分別取菌體1ml，離心12000gx30s收獲沉淀，用100μl1%SDS重懸，混勻，70℃10min5、離心12000gx1min，取上清作為樣品，可做SDS等分析三.結(jié)論三.結(jié)論目的基因的原核表達的特點和應(yīng)用目的基因的原核表達是生物技術(shù)中的重要步驟，具有以下特點和應(yīng)用：首先，目的基因需要經(jīng)過體外擴增或克隆，然后導(dǎo)入原核細胞中進行表達